本發(fā)明涉及一種醫(yī)用的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，屬于生物治療和細(xì)胞生物的技術(shù)和材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在生物醫(yī)學(xué)工程關(guān)于細(xì)胞的科研領(lǐng)域及醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中，主要目的是研究細(xì)胞的功能和作用。惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，“手術(shù)、放療與化療”三大常規(guī)療法仍不能解決腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，實(shí)踐證實(shí)，腫瘤生物免疫治療可以很好地控制腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，以常規(guī)治療(手術(shù)、放療、化療)輔以腫瘤免疫治療的綜合療法，將成為21世紀(jì)人類(lèi)征服癌癥的主要工具。
體細(xì)胞技術(shù)是目前國(guó)際上最前沿的治療技術(shù)，從人體外周血中分離出單核細(xì)胞，通過(guò)gmp實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行擴(kuò)增、誘導(dǎo)和活化培養(yǎng)，形成多種免疫殺傷細(xì)胞，然后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。這種免疫細(xì)胞具有顯著識(shí)別和殺傷患者體內(nèi)各種腫瘤細(xì)胞和病毒的活性，可增強(qiáng)人體免疫功能，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，更好地控制腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。支持這種治療的關(guān)鍵耗材是培養(yǎng)血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞(主要是淋巴細(xì)胞)用的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基。早期的細(xì)胞培養(yǎng)液的添加物均用動(dòng)物血清。但動(dòng)物血清成分復(fù)雜存在因個(gè)體、產(chǎn)地和批號(hào)的不同，使血清批間質(zhì)量差異甚大，直接影響基因工程等下游產(chǎn)品的分離、純化等諸多不利因素。傳統(tǒng)的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基個(gè)性化比較強(qiáng)，一種無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基只能適應(yīng)于某種或某類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)，目前，尚無(wú)適應(yīng)大多數(shù)細(xì)胞的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品。
滸苔富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、粗纖維、氨基酸、脂肪酸、維生素和多種礦物質(zhì),其中鐵含量在中國(guó)食物營(yíng)養(yǎng)成分表上記載為我國(guó)食物之最，同時(shí)還含有脂肪和維生素。在滸苔蛋白質(zhì)中，氨基酸種類(lèi)齊全，必需氨基酸含量較高，其中緣管滸苔的限制氨基酸為賴(lài)氨酸，氨基酸評(píng)分為79；條滸苔的限制氨基酸為蛋氨酸，氨基酸評(píng)分為80。滸苔的脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的含量為分別為50.5%、12.7%和36.8%，其中包括近4%的奇數(shù)碳原子脂肪酸。因此滸苔是高蛋白、高膳食纖維、低脂肪、低能量，且富含礦物質(zhì)和維生素的天然理想營(yíng)養(yǎng)食品的原料。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
現(xiàn)有的免疫細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，為了滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)，需要提供大量的營(yíng)養(yǎng)元素，包括氨基酸類(lèi)組分、維生素類(lèi)組分、無(wú)機(jī)鹽組分等等，中國(guó)專(zhuān)利cn102604891a公開(kāi)了一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，包括了上百種營(yíng)養(yǎng)元素，配置起來(lái)非常復(fù)雜。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種含有滸苔提取液的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基,在現(xiàn)有培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入滸苔提取液。
滸苔提取液的制備方法如下：
1）滸苔的預(yù)處理：新鮮滸苔洗凈，烘干，研碎得滸苔粉。
2）滸苔提取液：取上述的滸苔粉，加入滸苔粉質(zhì)量5-9倍的水，加熱到40-60℃，然后用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，均質(zhì)完后，加熱到90-100℃，保持30-50min；降溫到30℃，加入復(fù)合酶200-300u/g；升溫到35-45℃，保持50-80min，
復(fù)合酶選自纖維素酶、溶菌酶、蛋白酶中的一種或幾種。
3）提取液過(guò)濾，取濾液備用。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，加入滸苔提取液的重量是5-10g/l。
具體的，本發(fā)明提供一種含有滸苔提取液的醫(yī)用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括氨基酸類(lèi)組分、維生素類(lèi)組分、無(wú)機(jī)鹽組分和滸苔提取液。
氨基酸類(lèi)組分包括下列成分：
甘氨酸5-11mg/l、l-精氨酸80-100mg/l、l-門(mén)冬酰胺20-30mg/l、l-谷氨酸10-15mg/l、l-組氨酸20-30mg/l、l-羥脯氨酸10-15mg/l、l-亮氨酸25-55mg/l、l-苯丙氨酸15-20mg/l、l-色氨酸25-60mg/l、l-纈氨酸40-45mg/l。
維生素類(lèi)組分包括下列成分：
維生素h0.01-0.02mg/l、氯化膽堿2-3mg/l、葉酸2-6mg/l、煙酰胺1-3mg/l、維生素b61-3mg/l、維生素b120.01-0.02mg/l、i-肌醇3-8mg/l。
無(wú)機(jī)鹽組分包括下列成分：
四水二硝酸鈣0.01-0.06g/l、無(wú)水硫酸鎂0.01-0.1g/l、碳酸氫鈉3-5g/l、氯化鉀0.08-1g/l、氯化鈉3-8g/l。
滸苔提取液的重量是5-10g/l。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，滸苔提取液可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，滸苔提取液中含有的多種生物活性成分，可以極大促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。
本培養(yǎng)基使用時(shí)的滅菌方法：本培養(yǎng)基采用過(guò)濾除菌法，使用微孔濾膜過(guò)濾器。使用裝入濾膜，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，各種微生物被阻留在微孔濾膜上面，而液體和小分子物質(zhì)通過(guò)濾膜，從而達(dá)到除菌的目的。其濾膜是由硝酸纖維素、醋酸纖維素等制成，采用0.22μm或者是0.1μm孔徑，每張濾膜只使用1次。
本發(fā)明的有益效果：
增殖效果更好。與現(xiàn)有技術(shù)的無(wú)血清培養(yǎng)相比較，本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的免疫細(xì)胞，增殖效果更好，縮短了培養(yǎng)時(shí)間。
本發(fā)明提供的培養(yǎng)基適用于對(duì)所有免疫細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)、臨床安全性高?？捎糜赾ik細(xì)胞、dc細(xì)胞、nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞等所有各類(lèi)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)，不需要腫瘤細(xì)胞的刺激，不需要補(bǔ)加胎牛血清，提高了臨床安全性。
本發(fā)明提供的無(wú)血清培養(yǎng)基，所含成分均為化學(xué)限定成分，不含任何動(dòng)物血清成分，從而避免了動(dòng)物血清可能導(dǎo)致的安全性問(wèn)題。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供一種含有滸苔提取液的醫(yī)用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，包括氨基酸類(lèi)組分、維生素類(lèi)組分、無(wú)機(jī)鹽組分和滸苔提取液。
氨基酸類(lèi)組分包括下列成分：
甘氨酸5mg/l、l-精氨酸80mg/l、l-門(mén)冬酰胺20mg/l、l-谷氨酸10mg/l、l-組氨酸20mg/l、l-羥脯氨酸10mg/l、l-亮氨酸25mg/l、l-苯丙氨酸15mg/l、l-色氨酸25mg/l、l-纈氨酸40mg/l。
維生素類(lèi)組分包括下列成分：
維生素h0.01mg/l、氯化膽堿2mg/l、葉酸2mg/l、煙酰胺1mg/l、維生素b61mg/l、維生素b120.01mg/l、i-肌醇3mg/l。
無(wú)機(jī)鹽組分包括下列成分：
四水二硝酸鈣0.01g/l、無(wú)水硫酸鎂0.01g/l、碳酸氫鈉3g/l、氯化鉀0.08g/l、氯化鈉3g/l。
滸苔提取液的重量是8g/l。
實(shí)施例2本發(fā)明提供的培養(yǎng)基的技術(shù)指標(biāo)
1、外觀透明澄清的液體，呈淡綠色。
2、ph值：6.6-7.5。
3、滲透壓：270-350mosm。
4、細(xì)菌內(nèi)毒素＜3eu/ml。
5、微生物細(xì)菌：陰性霉菌：陰性。
6、穩(wěn)定性：在符合規(guī)定的儲(chǔ)存條件下(2-8℃)保存的成品至有效期后一個(gè)月內(nèi)，其ph值、滲透壓、細(xì)菌內(nèi)毒素、微生物及細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)符合技術(shù)要求的規(guī)定。
7、細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)及對(duì)比實(shí)驗(yàn)
本發(fā)明的培養(yǎng)基與中國(guó)專(zhuān)利cn102604891a公開(kāi)的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)的對(duì)比驗(yàn)證，在相同的培養(yǎng)條件下。vero細(xì)胞均接種1×104個(gè)/ml，培養(yǎng)50小時(shí)。
結(jié)果如下：
本發(fā)明的培養(yǎng)基細(xì)胞數(shù)量達(dá)到3.2×106個(gè)/ml。
中國(guó)專(zhuān)利cn102604891a公開(kāi)的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞數(shù)量達(dá)到8.9×105個(gè)/ml。
當(dāng)然，上述說(shuō)明并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。