本發(fā)明涉及一種體外消化分離角質(zhì)形成細(xì)胞的新方法，屬于組織細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
角質(zhì)形成細(xì)胞是構(gòu)成表皮細(xì)胞的主要組成部分，是一種可以分泌形成角質(zhì)蛋白的細(xì)胞，根據(jù)其不同的分化進(jìn)程，在皮膚結(jié)構(gòu)中的分布為基底細(xì)胞層、棘細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層、角質(zhì)層。自1967年briggaman從皮膚中分離出角質(zhì)形成細(xì)胞，至今50年來，培養(yǎng)方法不停的發(fā)展和演變，培養(yǎng)技術(shù)在不斷進(jìn)步。體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞具有增殖修復(fù)的能力，可以移植于燒傷創(chuàng)面進(jìn)行修復(fù)。燒傷病人在修復(fù)創(chuàng)面時(shí)往往面臨的是供皮區(qū)的有限，在最小的供皮面積培養(yǎng)出更多的細(xì)胞用于修復(fù)創(chuàng)面是尤為重要。在培養(yǎng)細(xì)胞過程中，首先需要將角質(zhì)形成細(xì)胞提取分離出來然后才能進(jìn)行培養(yǎng)，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的方法為兩步酶消化法，第一步用中性蛋白酶或膠原蛋白酶等將表皮層組織和真皮層組織分離，第二部再用胰蛋白酶將表皮層組織消化分離為單個(gè)細(xì)胞。其中消化分離細(xì)胞的環(huán)節(jié)必然存在一部分細(xì)胞未從組織上消化下來造成浪費(fèi)，而常用的胰蛋白酶消化方法若過長時(shí)間消化組織，雖然更充分分離細(xì)胞，但卻由于長時(shí)間的消化作用而損傷細(xì)胞的功能，如何在最小的皮膚中獲取最大化的細(xì)胞量同時(shí)保持較高活性的細(xì)胞功能是提高細(xì)胞培養(yǎng)效率的重要因素。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中角質(zhì)形成細(xì)胞在消化分離過程中未徹底消化下來和長時(shí)間徹底消化而影響細(xì)胞活性的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種改良的角質(zhì)形成細(xì)胞消化分離的提取方法，以解決上述問題。
本發(fā)明提供了一種動(dòng)態(tài)多次的重復(fù)消化的方法，包括動(dòng)態(tài)的方式和多次的重復(fù)。
進(jìn)一步的講所述的動(dòng)態(tài)方式為在消化過程中用移液器吸頭在消化所用的器皿中進(jìn)行順時(shí)針和逆時(shí)針交替攪拌，使組織和胰蛋白酶溶液充分接觸，使消化的角質(zhì)形成細(xì)胞快速脫離組織。攪拌消化進(jìn)行2分鐘后立即吸出胰蛋白酶溶液，此時(shí)胰蛋白酶溶液含有一定量較早消化分離的角質(zhì)形成細(xì)胞，將其加入事先準(zhǔn)備好的消化中止溶液中(大豆胰蛋白酶中止溶液或含有10％血清的dmem培養(yǎng)液)，即完成一次消化。
進(jìn)一步的講重復(fù)多次是上述的動(dòng)態(tài)消化步驟重復(fù)進(jìn)行5次。
進(jìn)一步的講在胰蛋白酶消化分離細(xì)胞前需準(zhǔn)備好分離出的表皮層組織，分離表皮層前需將皮膚組織剪切成寬約0.3cm，長1-3cm的皮條，分離表皮層組織后需經(jīng)不含鈣鎂的pbs液清洗至少1次并且不剪碎該組織。
進(jìn)一步的講所使用的消化酶為經(jīng)提前水浴預(yù)熱為37℃的0.25％胰蛋白酶溶液，并保持37℃，所加入盛放表皮層組織的器皿中的胰蛋白酶量是組織體積的5倍以上，保證完全淹沒組織。
附圖說明
圖1為本發(fā)明操作過程的示意圖；
圖中①盛有胰蛋白酶中止液的50ml離心管，②設(shè)施為37℃的恒溫水浴鍋，③盛有濃度為0.25％胰蛋白酶-edta的容器，④1ml移液器吸頭，⑤表皮層組織，⑥培養(yǎng)皿。
該示意圖展示了本發(fā)明的主要操作步驟，將預(yù)熱至37℃的胰蛋白酶-edta溶液③轉(zhuǎn)移至(右邊虛線箭頭)培養(yǎng)皿，經(jīng)過順時(shí)針和逆時(shí)針交替攪拌(兩個(gè)實(shí)線箭頭)，然后再轉(zhuǎn)移至(左邊虛線箭頭)盛有胰蛋白酶中止液的50ml離心管①進(jìn)行中止消化。
具體實(shí)施方式
以下具體實(shí)例進(jìn)一步描述并檢驗(yàn)本發(fā)明，本發(fā)明不僅僅限于該實(shí)例。在本發(fā)明的范圍內(nèi)或者在不脫離本發(fā)明的主體思想和內(nèi)容內(nèi)，也可以用于提取鼠等其他動(dòng)物的表皮細(xì)胞，也可以對(duì)于諸如胰蛋白酶的濃度、劑量、時(shí)間和重復(fù)次數(shù)做出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，且包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)例
皮膚標(biāo)本來自泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)后的組織，將組織標(biāo)本用含有三抗的dpbs清洗血漬，用眼科剪進(jìn)行修剪皮下組織，再剪成寬約0.3cm，長1-2cm的皮條，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，加滿用dpbs稀釋的濃度為0.125％的dispase溶液(0.22um濾膜過濾除菌)，搖晃離心管至皮片在液體中均勻懸浮，平放于4℃冰箱過夜。次日取出離心管，在超凈臺(tái)中進(jìn)行分離提取細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將皮片及溶液倒入培養(yǎng)皿中，用小鑷將皮條轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿，加入含三抗的dpbs，進(jìn)行漂洗，將培養(yǎng)皿蓋口朝上放置于超凈臺(tái)面，在皿蓋中用小鑷從組織中分離出表皮層，再次用含有三抗的dpbs進(jìn)行漂洗3次。
將分離的表皮層組織用無菌干紗布?jí)K吸干水分，用剪刀分開成兩部分，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，在電子天平上分別稱重并記錄。
實(shí)驗(yàn)組為動(dòng)態(tài)多次的胰蛋白酶消化方法，首先準(zhǔn)備50ml離心管并加入15ml含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，在分離表皮細(xì)胞前預(yù)先將濃度為0.25％胰蛋白酶-edta溶液在水浴缸預(yù)熱至37℃，將稱重后的實(shí)驗(yàn)組表皮層組織放入60mm培養(yǎng)皿中，加入3ml提前預(yù)熱至37℃的0.25％胰蛋白酶-edta溶液，用微量移液器吸頭持續(xù)攪拌2min后可見胰酶溶液顏色轉(zhuǎn)為黃褐色，將溶液吸取后加入上述備好培養(yǎng)液的離心管中，微量移液器吹吸混均胰酶溶液和培養(yǎng)液，再取3ml的0.25％胰蛋白酶-edta溶液，用微量移液器吸頭攪拌約2min后將溶液再次轉(zhuǎn)移至離心管中，共重復(fù)5次，將50ml離心管中液體用200目濾網(wǎng)過濾至另一支50ml離心管，加入少量dpbs清洗離心管中殘留細(xì)胞再過濾至另一離心管，在室溫下將濾液進(jìn)行離心，180g，5min。
對(duì)照組為傳統(tǒng)的酶消化法，將稱重后的對(duì)照組表皮層組織放入60mm培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪碎成微粒狀，大小約1mm；加入0.25％胰蛋白酶-edta溶液3ml，在37℃環(huán)境下消化約10min后取出，加入3ml含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，用5ml移液管進(jìn)行吹吸混均，可見混合液粘稠，通過吹吸使細(xì)胞脫離組織，將混合液用200目濾網(wǎng)過濾至50ml離心管并按上述方式進(jìn)行離心。
各取以上所述兩組細(xì)胞懸液10ul分別加入兩支0.6mlep管中，各加入10ul臺(tái)盼藍(lán)溶液后混勻，1min后在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，壞死細(xì)胞為藍(lán)色，活細(xì)胞為無色透明狀，用血球計(jì)數(shù)板在倒置相差顯微鏡下分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和壞死細(xì)胞。計(jì)算單位重量表皮層組織提取活細(xì)胞數(shù)量[活細(xì)胞數(shù)量÷表皮層組織稱重]，計(jì)算細(xì)胞存活率[活細(xì)胞數(shù)量÷(活細(xì)胞數(shù)量+壞死細(xì)胞數(shù))×100％]。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的配對(duì)t檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較。
動(dòng)態(tài)多次重復(fù)消化法和傳統(tǒng)消化法的消化效率比較(n＝8，
本實(shí)驗(yàn)通過臺(tái)盼藍(lán)染色和血球計(jì)數(shù)板對(duì)兩種方法提取的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，由上表結(jié)果可知新方法提取的活細(xì)胞數(shù)目顯著多于傳統(tǒng)方法，大約是傳統(tǒng)方法的3倍，盡管活細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例較傳統(tǒng)方法稍偏低，這可能因?yàn)橄淖銐驈氐祝瑢⒈砥咏M織最表層已調(diào)亡的細(xì)胞過多消化分離。總之所提取的活的角質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著得到提高。