本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種鏨菜揮發(fā)油的提取純化和檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鏨菜(Leonurus pseudo-macranthus Kitag)，屬于唇形科、益母草屬植物，別名白花益母草、山玉米。以全草入藥，有效成分為益母草素(Leonurin)，內(nèi)服可使血管擴(kuò)張而使血壓下降，并有頡抗腎上腺素的作用，可治動(dòng)脈硬化性和神經(jīng)性的高血壓，又能增加子宮運(yùn)動(dòng)的頻度，為產(chǎn)后促進(jìn)子宮收縮藥，并對(duì)長期子宮出血而引起衰弱者有效，故廣泛用于治療婦女閉經(jīng)、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后出血過多、惡露不盡、產(chǎn)后子宮收縮不全、胎動(dòng)不安、子宮脫垂及赤白帶下等癥。其在我國分布廣泛，主要分布于遼寧、河北、山西、陜西、甘肅、山東、江蘇、安徽、河南等地。生于山坡或丘陵地上，海拔100-1200米。
揮發(fā)油(volatile oils)，又稱精油(essential oils)，是一類在常溫下能揮發(fā)的、可隨水蒸汽蒸餾的、與水不相混的油狀液體的總稱。大多數(shù)揮發(fā)油具有芳香氣味。揮發(fā)油是一類重要的活性成分，臨床上除直接應(yīng)用主要含揮發(fā)油的生藥外，還可應(yīng)用從中精制的揮發(fā)油，如桉葉油、薄荷油等。揮發(fā)油具有發(fā)散解表、芳香開竅、理氣止痛、祛風(fēng)除濕、活血化瘀、祛寒溫里、清熱解毒、解暑祛穢、殺蟲抗菌等作用，如薄荷油用驅(qū)風(fēng)健胃，當(dāng)歸油鎮(zhèn)痛，柴胡油退熱，土荊芥油驅(qū)腸蟲等，此外，揮發(fā)油還廣泛應(yīng)用于香料、食品與化妝品等的生產(chǎn)。
目前，對(duì)于鏨菜的研究較少，多采用內(nèi)服煎湯，或者搗爛或研磨調(diào)敷外用；還未有關(guān)于鏨菜揮發(fā)油提取與使用的報(bào)道。因此，隨著天然產(chǎn)物精細(xì)化應(yīng)用的逐步實(shí)施，以及為進(jìn)一步的拓展鏨菜的應(yīng)用領(lǐng)域，有必要對(duì)鏨菜揮發(fā)油的提取與使用開展研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種鏨菜揮發(fā)油的提取純化和檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
本發(fā)明的第一方面，提供一種鏨菜揮發(fā)油的提取純化方法，步驟如下：
(1)將鏨菜粉碎，加水后攪拌進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，得含揮發(fā)油水系；
(2)向含揮發(fā)油水系中加入有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，棄去分出的水層，向含揮發(fā)油的有機(jī)溶劑中加入脫水干燥劑脫水，過濾回收有機(jī)溶劑，即得到干燥純凈的揮發(fā)油。
優(yōu)選的，步驟(1)中，將鏨菜粉碎至粒徑為50-100目；進(jìn)一步優(yōu)選的，將鏨菜粉碎至粒徑為60目。
優(yōu)選的，步驟(1)中，鏨菜和水加入的質(zhì)量比為1：2～5，進(jìn)一步優(yōu)選為1:3。
優(yōu)選的，步驟(1)中，水蒸氣蒸餾提取時(shí)間為3-6h。
優(yōu)選的，步驟(2)中，所述有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、正己烷和乙醚中的一種或幾種；進(jìn)一步優(yōu)選為乙醚。
優(yōu)選的，步驟(2)中，所述脫水干燥劑選自無水硫酸鈉或無水硫酸鈣；進(jìn)一步優(yōu)選為無水硫酸鈉。
本發(fā)明的第二方面，提供一種鏨菜揮發(fā)油的檢測(cè)方法，步驟如下：
(1)按上述方法提取純化鏨菜揮發(fā)油；
(2)采用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)鏨菜揮發(fā)油進(jìn)行分析檢測(cè)。
優(yōu)選的，步驟(2)中，分析檢測(cè)的條件為：HP-5MS色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣：氦氣；流速：1.2mL/min，溶劑延遲3min；升溫程序：初始溫度為60℃，保持1min，以8℃/min升溫到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。離子化方式：EI，70eV；離子源溫度：250℃；載氣：氦氣；柱流速：1.2mL/min。
本發(fā)明的第三方面，提供由上述提取純化方法得到的鏨菜揮發(fā)油。經(jīng)分析檢測(cè)，本發(fā)明的鏨菜揮發(fā)油的化學(xué)成分包括：香紫蘇醇、β-石竹烯、早熟素、β-桉葉烯、檀香腦、濕地松酸、喇叭烯、環(huán)氧異香樹烯和α-長葉蒎烯。
本發(fā)明的第四方面，提供上述鏨菜揮發(fā)油在作為抑菌劑中的應(yīng)用；所述抑菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌具有較好的抑菌效果，可用于食品、藥品、化妝品和保健品等領(lǐng)域。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明首次采用水蒸氣蒸餾和有機(jī)萃取技術(shù)提取純化得到鏨菜揮發(fā)油，提取純化方法工藝簡(jiǎn)單，成本低，制備工藝中的蒸餾水和有機(jī)溶劑能夠重復(fù)利用，經(jīng)本發(fā)明制備工藝獲得的揮發(fā)油含水率低，同時(shí)經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證具有良好的抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌均有良好的抑菌作用，適合工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。
需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。
正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于鏨菜的研究較少，多采用內(nèi)服煎湯，或者搗爛或研磨調(diào)敷外用；還未有關(guān)于鏨菜揮發(fā)油提取與使用的報(bào)道，基于此，本申請(qǐng)?zhí)岢隽艘环N鏨菜揮發(fā)油的提取純化和檢測(cè)方法。
在本申請(qǐng)的一種實(shí)施方案中，提供了一種鏨菜揮發(fā)油的提取純化方法，步驟如下：
(1)取新鮮鏨菜洗凈晾干后，粉粹至粒徑為50-100目，加入蒸餾水后攪拌進(jìn)行水蒸汽蒸餾，得含揮發(fā)油水系；
(2)向含揮發(fā)油水系中加入有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，棄去分出的水層，向含揮發(fā)油的有機(jī)溶劑中加入脫水干燥劑脫水，過濾回收有機(jī)溶劑即得到干燥純凈的揮發(fā)油。
本申請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，鏨菜粉粹目數(shù)的大小會(huì)影響揮發(fā)油的提取率，粉碎顆粒過大，會(huì)使水蒸汽從原料間隙流出，從而使得提取率降低，且浪費(fèi)資源；而粉粹的粒徑過小，則使得水蒸汽無法均勻透過原料，導(dǎo)致蒸汽從沖開的原料中逸出，同樣導(dǎo)致提取率不高。經(jīng)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鏨菜粉粹的目數(shù)以50-100目為宜，可以保證較高的揮發(fā)油提取率。在本申請(qǐng)的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，鏨菜粉粹的目數(shù)為60目，相對(duì)于其他的粉碎目數(shù)取得了最優(yōu)的揮發(fā)油提取率。
在進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取時(shí)，適宜的提取時(shí)間能夠保證盡可能由鏨菜中提取出揮發(fā)油組分，同時(shí)也避免提取時(shí)間過長造成的資源浪費(fèi)。本申請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)過程中以揮發(fā)油提取率為考察指標(biāo)，對(duì)水蒸氣蒸餾提取的時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間以3-6h為宜，可以最大程度的將鏨菜中的揮發(fā)油提取出來，同時(shí)避免資源的浪費(fèi)。
由于關(guān)于鏨菜有效成分的研究很少，對(duì)于鏨菜揮發(fā)油的提取更是技術(shù)上的空白，因此，如何選擇提取方法，如何選擇有機(jī)溶劑，是鏨菜揮發(fā)油提取的難點(diǎn)所在。本申請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)過程中對(duì)多種不同極性的有機(jī)溶劑進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、正己烷、乙醚作為有機(jī)溶劑，鏨菜揮發(fā)油的提取率較優(yōu)。在本申請(qǐng)的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，以乙醚作為有機(jī)溶劑，相較于其他的有機(jī)溶劑具有更好的揮發(fā)油提取率。
在本申請(qǐng)的另一種實(shí)施方式中，提供了一種鏨菜揮發(fā)油的檢測(cè)方法，步驟如下：
(1)按上述方法提取純化鏨菜揮發(fā)油；
(2)采用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)鏨菜揮發(fā)油進(jìn)行分析檢測(cè)。分析檢測(cè)的條件為：HP-5MS色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣：氦氣；流速：1.2mL/min，溶劑延遲3min；升溫程序：初始溫度為60℃，保持1min，以8℃/min升溫到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。離子化方式：EI，70eV；離子源溫度：250℃；載氣：氦氣；柱流速：1.2mL/min。
為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例和對(duì)比例詳細(xì)說明本申請(qǐng)的技術(shù)方案。
本發(fā)明實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗(yàn)材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。
實(shí)施例1：鏨菜揮發(fā)油的提取純化
(1)取400g新鮮鏨菜洗凈晾干后粉粹至粒徑為60目，加入1200g蒸餾水后攪拌進(jìn)行水蒸汽蒸餾，蒸餾提取時(shí)間為45h，得含揮發(fā)油水系；
(2)向含揮發(fā)油水系中加入乙醚進(jìn)行萃取，棄去分出的水層，向含揮發(fā)油的乙醚溶液中加入無水硫酸鈉脫水，過濾回收乙醚，即得到干燥純凈的揮發(fā)油，提取率為1.32％，揮發(fā)油中的含水率為0.55％。
實(shí)施例2：鏨菜揮發(fā)油的檢測(cè)
采用GC-MS對(duì)實(shí)施例1得到的鏨菜揮發(fā)油進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)條件如下：HP-5MS色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣：氦氣；流速：1.2mL/min，溶劑延遲3min；升溫程序：初始溫度為60℃，保持1min，以8℃/min升溫到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。離子化方式：EI，70eV；離子源溫度：250℃；載氣：氦氣；柱流速：1.2mL/min。共檢測(cè)出鏨菜揮發(fā)油中化學(xué)成分49種，具體化學(xué)成分及相對(duì)含量見表1。
表1鏨菜揮發(fā)油化學(xué)成分
對(duì)比例1：鏨菜揮發(fā)油的提取純化
將步驟(1)中鏨菜粉碎的粒徑調(diào)整為40目，其余操作同實(shí)施例1，制備得到揮發(fā)油，提取率為1.15％，揮發(fā)油中的含水率為0.72％。
對(duì)比例2：鏨菜揮發(fā)油的提取純化
將步驟(1)中鏨菜粉碎的粒徑調(diào)整為120目，其余操作同實(shí)施例1，制備得到揮發(fā)油，提取率為0.96％，揮發(fā)油中的含水率為0.64％。
對(duì)比例3：鏨菜揮發(fā)油的提取純化
將步驟(2)中“向含揮發(fā)油水系中加入乙醚進(jìn)行萃取”調(diào)整為“向含揮發(fā)油水系中加入二氯甲烷進(jìn)行萃取”，其余操作同實(shí)施例1，制備得到揮發(fā)油，提取率為1.25％，揮發(fā)油中的含水率為0.76％。
對(duì)比例4：鏨菜揮發(fā)油的提取純化
將步驟(2)中“向含揮發(fā)油水系中加入乙醚進(jìn)行萃取”調(diào)整為“向含揮發(fā)油水系中加入甲苯進(jìn)行萃取”，其余操作同實(shí)施例1，制備得到揮發(fā)油，提取率為1.20％，揮發(fā)油中的含水率為0.69％。
實(shí)施例3鏨菜揮發(fā)油的抑菌作用
1.試驗(yàn)菌種和培養(yǎng)基
試驗(yàn)菌種：選擇四種細(xì)菌菌株用于抑菌試驗(yàn)，包括革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(ATCC6538)，枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)和革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(ATCC 25922)，綠膿桿菌(ATCC 27853)。
試驗(yàn)用培養(yǎng)基：細(xì)菌MHB(Mueller Hinton Broth)培養(yǎng)基。
2.試驗(yàn)方法
(1)滅菌：
將實(shí)驗(yàn)所需要的培養(yǎng)基、試管、培養(yǎng)皿、濾紙片(6mm)、槍頭、蒸餾水等在121℃濕熱滅菌20min，滅完菌將其放置超凈工作臺(tái)紫外滅菌30min。
(2)菌懸液的配制：
從經(jīng)過活化的菌體斜面上挑取一環(huán)菌體接種于相應(yīng)的MHB培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床中37℃條件下隔夜培養(yǎng)。分別吸取以上培養(yǎng)好的處于對(duì)數(shù)生長期的供試菌液0.5mL，用MH肉湯稀釋成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。再用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶100稀釋后，得到1-2×106CFU/ml備用。
(3)供試藥物：
對(duì)照藥物：氯霉素；樣品：實(shí)施例1所得鏨菜揮發(fā)油的5mg/mL稀釋液。
(4)抑菌活性的測(cè)定：
采用濾紙片法測(cè)定抑菌活性。無菌條件下，在已滅菌的培養(yǎng)皿中傾入MHA培養(yǎng)基20mL，冷卻凝固后制成固體平板。向每個(gè)固體平板中加入100μL已稀釋好的菌懸液，涂布均勻，放置5min，使培養(yǎng)基充分吸收菌液。用記號(hào)筆在有菌瓊脂平板上標(biāo)號(hào)。用無菌鑷子將滅完菌的干燥的濾紙片夾出，放入寫相應(yīng)對(duì)照編號(hào)的培養(yǎng)皿中，向滅完菌的干燥的濾紙片滴加配制好的樣品溶液或氯霉素溶液10μL，每個(gè)樣品做三個(gè)平行，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。培養(yǎng)時(shí)間到后取出培養(yǎng)皿觀察透明抑菌圈，采用十字交叉法用測(cè)微尺測(cè)量每個(gè)抑菌圈兩個(gè)垂直方向的直徑大小，取其平均值(mm)為測(cè)定結(jié)果，每項(xiàng)抑菌實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次。以抑菌圈直徑的大小來進(jìn)行抑菌活性強(qiáng)弱的判定，抑菌圈表現(xiàn)得越大，則表明其抗菌活性也就越強(qiáng)。
(5)MIC的測(cè)定：
吸取稀釋好的菌液加于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，并加入已配置好的不同濃度的藥物100μL。倒數(shù)第二孔不加藥物(僅加培養(yǎng)基和細(xì)菌)加入稀釋菌液100μL，為細(xì)菌生長對(duì)照孔。最后一列為陽性對(duì)照氯霉素。置于振蕩器上振蕩1min，使孔內(nèi)溶液充分混勻后，將96孔板振蕩搖勻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18小時(shí)后，向每孔中加入用無菌水配置的1％TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)溶液20μL，振蕩搖勻于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30到60分鐘，觀察每孔顏色變化。取未呈現(xiàn)顏色變化的最后一孔所含揮發(fā)油濃度為其最低抑菌濃度MIC。
重復(fù)所有MIC值的測(cè)量一式三份。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
抑菌效果用最小抑菌濃度MIC表示，測(cè)量結(jié)果見表2。
表2鏨菜揮發(fā)油抑菌活性
由表2可以看出，鏨菜揮發(fā)油對(duì)4種供試菌均有一定的抑制作用，其對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.156mg/mL，對(duì)枯草桿菌的最低抑菌濃度為0.039mg/mL，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為大于2.50mg/mL，對(duì)綠膿桿菌的最低抑菌濃度為大于2.50mg/mL。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明鏨菜揮發(fā)油可作為天然抗菌劑用于食品、藥品保健品或化妝品行業(yè)，代替有毒副作用的合成抗菌劑。
以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。