本發(fā)明屬于細(xì)胞與組織培養(yǎng)領(lǐng)域中細(xì)胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)體系，特別是涉及一種傳代馴化培養(yǎng)羊睪丸原代細(xì)胞(lt)得到可傳代培養(yǎng)的羊睪丸傳代細(xì)胞(lt-1)的方法及其專用培養(yǎng)體系與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，羊睪丸細(xì)胞(lt)均是來源于羔羊睪丸，經(jīng)解剖、剪碎、消化、培養(yǎng)而成的原代細(xì)胞，該細(xì)胞生長緩慢，繁殖一定代數(shù)后(一般10代以內(nèi))停止生長，傳代次數(shù)有限，隨著傳代次數(shù)的升高，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞形態(tài)也隨之越來越差，最后無法進(jìn)行傳代；并且羔羊睪丸來源有限，采集工作量大，易污染，費時費事；細(xì)胞制作過程復(fù)雜耗時，不利于批量生產(chǎn)使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為克服羊睪丸原代細(xì)胞(lt)培養(yǎng)的不足，實現(xiàn)羊睪丸細(xì)胞的批量培養(yǎng)，本發(fā)明的發(fā)明人長期致力于羊睪丸原代細(xì)胞的傳代馴化研究，通過個性化的培養(yǎng)基，優(yōu)化馴化途徑，最終獲得了一株可以傳代培養(yǎng)的羊睪丸細(xì)胞。

本發(fā)明的第一個目的是提供一株可傳代培養(yǎng)的羊睪丸傳代細(xì)胞，命名為lt-1，該株細(xì)胞已于2016年9月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.12988。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于傳代馴化培養(yǎng)羊睪丸原代細(xì)胞(lt)的培養(yǎng)體系。

本發(fā)明所提供的用于傳代馴化培養(yǎng)羊睪丸原代細(xì)胞的培養(yǎng)體系包括細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ、細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ和細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ；所述細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ為含有10％(體積百分比v/v)新生牛血清和1％-3％(質(zhì)量體積百分比w/v)l-谷氨酰胺的mem培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ是含有10％(v/v)新生牛血清的dmem培養(yǎng)液所述細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ為含有5％(v/v)胎牛血清和5％(v/v)新生牛血清的dmem培養(yǎng)液。

本發(fā)明所提供的用于傳代馴化培養(yǎng)羊睪丸原代細(xì)胞的培養(yǎng)體系還包括消化液ⅰ和消化液ⅱ，所述消化液ⅰ為0.25％(w/v)的胰酶消化液，所述消化液ⅱ為含有0.25％(w/v)胰酶和0.02％(w/v)edta的edta-胰酶消化液。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種傳代馴化培養(yǎng)羊睪丸原代細(xì)胞(lt)的方法。本發(fā)明所提供的傳代馴化培養(yǎng)羊睪丸原代細(xì)胞的方法，是將羊睪丸原代細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ進(jìn)行傳代培養(yǎng)至7-8代，再逐次用細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)至20代、30代，最后用細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ逐步適應(yīng)傳代至40-50代得到可傳代的羊睪丸細(xì)胞lt。這里，每次傳代培養(yǎng)后用消化液ⅱ封口，再消化細(xì)胞后加入細(xì)胞培養(yǎng)液。

具體的，可包括以下步驟：

1)取用公羊睪丸；

2)獲得羊睪丸原代細(xì)胞：將羊睪丸經(jīng)清洗、解剖、剪碎，置于放有玻璃珠的三角瓶中，加入消化液ⅰ，封口，將其放入水浴鍋中消化約20-30分鐘，取出，加入細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ終止消化，輕輕向一個方向搖動三角瓶，在玻璃珠的作用下，羊睪丸細(xì)胞均勻分散開，用無菌紗布過濾，取透過液體，置于細(xì)胞瓶中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由此得到羊睪丸原代細(xì)胞；

3)羊睪丸原代細(xì)胞的傳代：將羊睪丸原代細(xì)胞在恒溫環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，待羊睪丸細(xì)胞長滿單層時，加入消化液ⅱ，封口，將其放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化，取出，加入細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

4)按照步驟3)中的方法將羊睪丸原代細(xì)胞傳至7-8代時，將長滿單層的羊睪丸細(xì)胞加入消化液ⅱ，封口，將其放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞，取出，加入細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

5)按照步驟4)中的方法將羊睪丸原代細(xì)胞傳至20代時，將長滿單層的羊睪丸細(xì)胞加入消化液ⅱ，封口，將其放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞，取出，加入細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

6)按照步驟5)中的方法將羊睪丸原代細(xì)胞傳至30代時，將長滿單層的羊睪丸細(xì)胞加入消化液ⅱ，封口，將其放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞，取出，加入細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

7)按照步驟6)中的方法將羊睪丸原代細(xì)胞傳至40-50代，得到可以傳代的羊睪丸細(xì)胞。

在上述傳代馴化培養(yǎng)羊睪丸原代細(xì)胞的方法中，所述步驟1)的公羊為2-4月齡的小公羊。

所述步驟2)中玻璃珠的直徑為2-3mm，優(yōu)選為2.5mm，粒數(shù)為100-150，優(yōu)選120；消化液ⅰ的添加量為30-50ml，優(yōu)選40ml，消化溫度為36.5-37.5℃，優(yōu)選37℃，消化時間為20-30分鐘，優(yōu)選30分鐘；細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ的添加量為300-500ml，優(yōu)選300ml；無菌紗布的層數(shù)為6-8層，優(yōu)選為8層。

所述3)羊睪丸原代細(xì)胞的傳代：所述羊睪丸原代細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為36.5-37.5℃，優(yōu)選37℃；消化液ⅱ的添加量為1-2ml，優(yōu)選2ml，消化溫度為36.5-37.5℃，優(yōu)選37℃，消化時間為1-2分鐘，優(yōu)選2分鐘；細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ的添加量為20-25ml(細(xì)胞瓶培養(yǎng)面積為25cm²)，優(yōu)選20ml,平分為兩瓶進(jìn)行培養(yǎng)(分種比例為1:2),培養(yǎng)溫度為36.5-37.5℃，優(yōu)選37℃，培養(yǎng)時間為48-72小時，優(yōu)選為72小時,以細(xì)胞長滿單層的時長為準(zhǔn)。

所述步驟4)將羊睪丸原代細(xì)胞傳至7-8代時，細(xì)胞開始生長更加緩慢，且形態(tài)不佳，此時需減小分種比例，以消化前羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積與消化后的羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積比為1：(1-1.5)的分種比例進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)液為細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ；消化液ⅱ的添加量為1-2ml，優(yōu)選2ml，消化溫度為36.5-37.5℃，優(yōu)選37℃，消化時間為1-2分鐘，優(yōu)選1分鐘；細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ的添加量為10-15ml，優(yōu)選10ml，培養(yǎng)溫度為36.5-37.5℃，優(yōu)選37℃，培養(yǎng)時間為48-72小時，優(yōu)選為72小時，以細(xì)胞長滿單層的時長為準(zhǔn)。

所述步驟5)將羊睪丸原代細(xì)胞傳至20代時，細(xì)胞生長較快，且形態(tài)較好，可適當(dāng)擴(kuò)大分種比例，以消化前羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積與消化后的羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積比為1：(2-3)的分種比例進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)；消化液ⅱ的添加量為1-2ml，優(yōu)選2ml，消化溫度為36.5-37.5℃，優(yōu)選37℃，消化時間為1-2分鐘，優(yōu)選1分鐘；細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ的添加量為10-15ml，優(yōu)選10ml，培養(yǎng)溫度為36.5-37.5℃，優(yōu)選37℃，培養(yǎng)時間為48-72小時，優(yōu)選為72小時，以細(xì)胞長滿單層的時長為準(zhǔn)。

所述步驟6)中將羊睪丸原代細(xì)胞傳至30代時，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)液為培養(yǎng)液ⅲ，同時降低分種比例，以消化前羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積與消化后的羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積比為1：(1-1.5)繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；消化液ⅱ的添加量為1-2ml，優(yōu)選2ml，消化溫度為36.5-37.5℃，優(yōu)選37℃，消化時間為1-2分鐘，優(yōu)選1分鐘；細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ的添加量為10-15ml，優(yōu)選10ml，培養(yǎng)溫度為36.5-37.5℃，優(yōu)選37℃，培養(yǎng)時間為48-72小時，優(yōu)選為72小時，以細(xì)胞長滿單層的時長為準(zhǔn)。

所述步驟7)中將羊睪丸原代細(xì)胞傳至50代時，挑選得到一株可以傳代培養(yǎng)的羊睪丸傳代細(xì)胞，命名為lt-1。該株細(xì)胞已于2016年9月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.12988。

本發(fā)明的羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)可用于羊口瘡病毒的增殖培養(yǎng)，包括以下步驟：用細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ(含有5％(v/v)胎牛血清和5％(v/v)新生牛血清的dmem培養(yǎng)液)培養(yǎng)羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)，培養(yǎng)溫度為36.5-37.5℃(優(yōu)選37℃)，待其長滿單層細(xì)胞后，傾去培養(yǎng)液上清，以1％-3％(v/v，優(yōu)選2％)的劑量接入羊口瘡病毒，吸附1小時后，加入維持液ⅰ(含2％(v/v)胎牛血清的dmem培養(yǎng)液)，維持液ⅰ的添加量為8-10ml(優(yōu)選10ml)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36.5-37.5℃(優(yōu)選37℃)，觀察單層細(xì)胞的病變情況，當(dāng)80％以上單層細(xì)胞出現(xiàn)病變時，將單層細(xì)胞凍融2-3次，收獲病毒液；所述接入的羊口瘡病毒可為之前所收獲的病毒液。

具體的，1)接入羊口瘡病毒(來源于金宇保靈生物藥品有限公司)收獲的病毒液標(biāo)記為病毒液ⅰf1代；

2)將病毒液ⅰf1代接入長成單層的羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)中培養(yǎng)，收獲的病毒液標(biāo)記為病毒液ⅰf2代；

3)將病毒液ⅰf2代接入長成單層的羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)中培養(yǎng)，收獲的病毒液標(biāo)記為病毒液ⅰf3代。

病毒液ⅰf1代-f3代病毒液均能產(chǎn)生明顯的病變，病毒含量可達(dá)10^7.5tcid50/ml，均可用于羊口瘡病毒傳代培養(yǎng)及疫苗生產(chǎn)。

本發(fā)明提供了一種羊睪丸原代細(xì)胞(lt)的傳代馴化培養(yǎng)方法，并且獲得了一株可以傳代培養(yǎng)的羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)，本發(fā)明具有以下有益效果：

1)采用優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)液的方法對羊睪丸原代細(xì)胞(lt)進(jìn)行傳代馴化培養(yǎng)，可使羊睪丸原代細(xì)胞增加傳代次數(shù)，適于批量生產(chǎn)；

2)將羊口瘡病毒接種于羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，結(jié)果顯示，羊口瘡病毒能連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，均能產(chǎn)生明顯的病變，病毒含量可達(dá)10^7.5tcid50/ml，與羊睪丸原代細(xì)胞(lt)培養(yǎng)的羊口瘡病毒毒價相當(dāng)。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

附圖說明

圖1顯示羊睪丸原代細(xì)胞在37℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞長滿單層時形態(tài)；

圖2顯示羊睪丸原代細(xì)胞傳至7-8代時形態(tài)，此時細(xì)胞開始生長更加緩慢，且形態(tài)不佳；

圖3顯示羊睪丸原代細(xì)胞傳至20代時形態(tài)，此時細(xì)胞生長較快，且形態(tài)較好；

圖4顯示羊睪丸原代細(xì)胞傳至30代時形態(tài)；

圖5顯示羊睪丸原代細(xì)胞傳至50代時形態(tài)；

圖6顯示lt-1細(xì)胞能產(chǎn)生明顯的病變，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變圓；

圖7顯示培養(yǎng)后期細(xì)胞大量脫落。

具體實施方式

所述百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/質(zhì)量(w/w，單位g/100g)百分比濃度、質(zhì)量/體積(w/v，單位g/100ml)百分比濃度或體積/體積(v/v，單位ml/100ml)百分比濃度。

實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。

實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。

實施例1、羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)的傳代馴化培養(yǎng)(獲得)方法與保藏

用于傳代馴化培養(yǎng)羊睪丸傳代細(xì)胞(lt-1)的培養(yǎng)體系包括細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ、細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ和細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ，所述細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ為含有10％(v/v)新生牛血清(購自金源康公司，批號為20151208)和1％-3％(w/v)l-谷氨酰胺(購自gibco公司，批號為21051024)的mem培養(yǎng)液(購自宜興市賽爾生物科技有限公司，批號為150130)，所述細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ是含有10％(v/v)新生牛血清的dmem培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ為含有5％(v/v)胎牛血清(購自gibco公司，批號為10099-141)和5％(v/v)新生牛血清的dmem培養(yǎng)液(購自gibco公司，批號為12800082)；

l-谷氨酰胺用蒸餾水配制成質(zhì)量/體積比(w/v)為3％的溶液后，0.22μm濾膜過濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

用于傳代馴化培養(yǎng)羊睪丸傳代細(xì)胞(lt-1)的培養(yǎng)體系還包括消化液ⅰ和消化液ⅱ，所述消化液ⅰ為0.25％(w/v)的胰酶(胰酶規(guī)格為1:250，購自gibco公司，批號為1596920)消化液，所述消化液ⅱ為含有0.25％(w/v)胰酶和0.02％(w/v)edta(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為20140627)的edta-胰酶消化液。

本發(fā)明傳代馴化培養(yǎng)(獲得)羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)的方法，包括以下步驟：

1)采取2-4月齡的小公羊睪丸；

2)獲得羊睪丸原代細(xì)胞：將羊睪丸經(jīng)清洗、解剖、剪碎，置于放有玻璃珠的三角瓶中，玻璃珠的直徑為2.5mm(2-3mm均可)，粒數(shù)為120(100-150均可)，加入消化液ⅰ，消化液ⅰ的添加量為40ml(30-50ml均可)，封口，將其放入水浴鍋中消化細(xì)胞，消化溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，消化時間為30分鐘(20-30分鐘均可分鐘均可)，取出，加入細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ終止消化，細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ的添加量為300ml(300-500ml均可)，輕輕向一個方向搖動三角瓶，在玻璃珠的作用下，羊睪丸細(xì)胞均勻分散開，用8層(6-8層均可)無菌紗布過濾，取透過液體，置于細(xì)胞瓶中，得到羊睪丸原代細(xì)胞；

3)羊睪丸原代細(xì)胞的傳代：將羊睪丸原代細(xì)胞在37℃(36.5-37.5℃均可)恒溫環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，待羊睪丸細(xì)胞長滿單層時(圖1)，加入消化液ⅱ，消化液ⅱ的添加量為2ml(1-2ml均可)，封口，將其放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化，消化溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，消化時間為1分鐘(1-2分鐘均可)，取出，加入細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液ⅰ的添加量為20-25ml(細(xì)胞瓶培養(yǎng)面積為25cm²)，優(yōu)選20ml，平分為兩瓶進(jìn)行培養(yǎng)(分種比例為1:2)，培養(yǎng)溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，培養(yǎng)時間為72小時(48-72小時均可，以細(xì)胞長滿單層的時長為準(zhǔn))；

4)按照步驟3)中的方法將羊睪丸原代細(xì)胞傳至7-8代時，細(xì)胞開始生長更加緩慢，且形態(tài)不佳(圖2)，此時需減小分種比例，以消化前羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積與消化后的羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積比為1：(1-1.5)的分種比例進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)液為細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ；將長滿單層的羊睪丸細(xì)胞加入消化液ⅱ，消化液ⅱ的添加量為2ml(1-2ml均可)，封口，將其放入恒溫培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞，消化溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，消化時間為1分鐘(1-2分鐘均可)，取出，加入細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ的添加量為15ml(10-15ml均可)，培養(yǎng)溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，培養(yǎng)時間為72小時(48-72小時均可，以細(xì)胞長滿單層的時長為準(zhǔn))；

5)按照步驟4)中的方法將羊睪丸原代細(xì)胞傳至20代時，細(xì)胞生長較快，且形態(tài)較好(圖3)，可適當(dāng)擴(kuò)大分種比例，以消化前羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積與消化后的羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積比為1：(2-3)的分種比例進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)；將長滿單層的羊睪丸細(xì)胞加入消化液ⅱ，消化液ⅱ的添加量為2ml(1-2ml均可)，封口，將其放入恒溫培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞，消化溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，消化時間為1分鐘(1-2分鐘均可)，取出，加入細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液ⅱ的添加量為10ml(10-15ml均可)，培養(yǎng)溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，培養(yǎng)時間為72小時(48-72小時均可,以細(xì)胞長滿單層的時長為準(zhǔn))；

6)按照步驟5)中的方法將羊睪丸原代細(xì)胞傳至30代時(圖4)，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)液為培養(yǎng)液ⅲ，同時降低分種比例，以消化前羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積與消化后的羊睪丸細(xì)胞營養(yǎng)液的體積比為1：(1-1.5)的分種比例繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；將長滿單層的羊睪丸細(xì)胞加入消化液ⅱ，消化液ⅱ的添加量為2ml(1-2ml均可)，封口，將其放入恒溫培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞，消化溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，消化時間為1分鐘(1-2分鐘均可)，取出，加入細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ的添加量為15ml(10-15ml均可)，培養(yǎng)溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，培養(yǎng)時間為72小時(48-72小時均可，以細(xì)胞長滿單層的時長為準(zhǔn))；

7)按照步驟6)中的方法將羊睪丸原代細(xì)胞傳至50代時(圖5)，得到一株可以傳代培養(yǎng)的羊睪丸細(xì)胞，命名為lt-1。

用上述方法獲得的可以傳代培養(yǎng)的羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1已于2016年9月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.12988。

實施例2、將羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)用于羊口瘡病毒的增殖培養(yǎng)

將羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)用于羊口瘡病毒的增殖培養(yǎng)，具體方法包括以下步驟：

1)用細(xì)胞培養(yǎng)液ⅲ(含有5％(v/v)胎牛血清和5％(v/v)新生牛血清的dmem培養(yǎng)液)培養(yǎng)羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)，培養(yǎng)溫度為37℃，待其長滿單層細(xì)胞后，傾去培養(yǎng)液上清，以2％(v/v，1％-3％均可)的劑量接入羊口瘡病毒(來源于金宇保靈生物藥品有限公司)，吸附1小時候后，加入維持液ⅰ(含2％(v/v)胎牛血清的dmem培養(yǎng)液)，維持液ⅰ的添加量為10ml(8-10ml均可)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，每天觀察單層細(xì)胞的病變情況，當(dāng)80％以上單層細(xì)胞出現(xiàn)病變時，將單層細(xì)胞凍融2-3次，收獲病毒液，標(biāo)記為病毒液ⅰf1代；

2)將病毒液ⅰf1代再以2％(v/v，1％-3％均可)的劑量接入長成單層的羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)中，吸附1小時后，加入維持液ⅰ，維持液ⅰ的添加量為10ml(8-10ml均可)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，每天觀察單層細(xì)胞的病變情況，當(dāng)80％以上單層細(xì)胞出現(xiàn)病變時，將單層細(xì)胞凍融2-3次，收獲病毒液，標(biāo)記為病毒液ⅰf2代；

3)將病毒液ⅰf2代再以2％(v/v，1％-3％均可)的劑量接入長成單層的羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)中，吸附1小時后，加入維持液ⅰ，維持液ⅰ的添加量為10ml(8-10ml均可)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃(36.5-37.5℃均可)，每天觀察單層細(xì)胞的病變情況，當(dāng)80％以上單層細(xì)胞出現(xiàn)病變時，將單層細(xì)胞凍融2-3次，收獲病毒液，標(biāo)記為病毒液ⅰf3代。

實驗例、羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1用于羊口瘡病毒的增殖培養(yǎng)效果檢測

對比例1：將羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)用于羊口瘡病毒的增殖培養(yǎng)，具體方法與實施例2相同，不同之處在于維持液ⅰ為不含胎牛血清的dmem培養(yǎng)液。

對比例2：將未馴化的羊睪丸原代細(xì)胞(lt)用于羊口瘡病毒的增殖培養(yǎng)，具體方法與實施例2相同。

將對比例1、2中各個階段中收獲的病毒液進(jìn)行細(xì)胞感染滴度的測定。每個病毒液測毒價的方法為：取9支高壓滅菌的1.5ml離心管，每管加入0.9ml病毒稀釋液(含2％(v/v)胎牛血清的dmem培養(yǎng)液)，再在第1管中加入0.1ml的病毒稀釋液，用旋渦混合儀將液體混勻后，取0.1ml加入第2管中，如此依次稀釋，最終每管中病毒的稀釋度為10^-1-10^-9；將各稀釋度的病毒液加入長滿羊睪丸原代細(xì)胞(lt)的96孔細(xì)胞板中，每個稀釋度病毒液接種8孔，每孔接0.1ml，置37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察。根據(jù)細(xì)胞病變孔數(shù)按reed-muench法計算tcid50/ml。

檢測結(jié)果如表1所示，實施例2和對比例1中，用羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)培養(yǎng)羊口瘡病毒時，當(dāng)維持液為無血清的dmem培養(yǎng)液時，lt-1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變不易觀察；當(dāng)維持液為含2％(v/v)胎牛血清的dmem培養(yǎng)液時，lt-1細(xì)胞能產(chǎn)生明顯的病變，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變圓及培養(yǎng)后期細(xì)胞的大量脫落(圖6、圖7)。當(dāng)維持液為含2％(v/v)胎牛血清的dmem培養(yǎng)液時，lt-1細(xì)胞毒液病毒含量達(dá)10^7.33tcid50/ml以上，并且與羊睪丸原代細(xì)胞(lt)毒液毒價相當(dāng)，差別不明顯。上述檢測結(jié)果表明本發(fā)明的羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)可用于羊口瘡病毒的增殖培養(yǎng)。

表1羊睪丸傳代細(xì)胞lt-1(cgmccno.12988)用于羊口瘡病毒的增殖培養(yǎng)效果檢測結(jié)果