本發(fā)明涉及生物化工技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種手性純l-草銨膦的生產(chǎn)方法；具體地說是一種利用來源于微生物的氨基酸脫氫酶生產(chǎn)光學(xué)純l-草銨膦的方法。

技術(shù)背景

草銨膦(glufosinate-ammonium)是世界第二大轉(zhuǎn)基因作物耐受除草劑，由赫斯特公司(幾經(jīng)合并后現(xiàn)歸屬拜耳公司)開發(fā)生產(chǎn)，化學(xué)名稱為4-[羥基(甲基)膦?；鵠-dl-高丙氨酸，又稱草銨膦銨鹽、basta、buster等，屬膦酸類除草劑，是谷氨酰胺合成酶抑制劑，非選擇性(滅生性)觸殺型除草劑。

目前，世界上的三大除草劑品種是草甘膦、草銨膦和百草枯，相對于百草枯和草甘膦，草銨膦具有優(yōu)異的除草性能及較小的藥害副作用，隨著抗草銨膦轉(zhuǎn)基因作物的快速發(fā)展，草銨膦在未來一段時間內(nèi)市場需求巨大，前景非常廣闊。

草銨膦有兩種光學(xué)異構(gòu)體，分別為l-草銨膦和d-草銨膦。但只有l(wèi)-型具有生理活性，且在土壤中易分解，對人類和動物的毒性較小，除草譜廣，對環(huán)境的破壞力小。

目前，市場上銷售的草銨膦一般都是外消旋混合物。若草銨膦產(chǎn)品能以l-構(gòu)型的純光學(xué)異構(gòu)體形式使用，可顯著降低草銨膦的使用量，這對于提高原子經(jīng)濟性、降低使用成本、減輕環(huán)境壓力具有重要意義。

手性純l-草銨膦的方法主要制備方法有三種：手性拆分法、化學(xué)直接合成法以及生物催化法。

手性拆分法是通過對外消旋d，l-草銨膦或其衍生物進行手性拆分，實現(xiàn)d型和l型異構(gòu)體的分離，從而制得光學(xué)純的l-草銨膦。此工藝主要存在以下缺點：需要使用昂貴手性拆分試劑、理論收率只能達到50％、單次拆分收率低、工藝比較復(fù)雜。

化學(xué)直接合成法從手性原料出發(fā)合成光學(xué)純l-草銨膦，多見于實驗室研究中?；瘜W(xué)不對稱合成法工藝步驟多、收率低，手性原料昂貴，導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高，不利于大規(guī)模制備l-草銨膦。

相比之下，生物催化法具有立體選擇性嚴格、反應(yīng)條件溫和、收率高等優(yōu)點，是生產(chǎn)l-草銨膦的優(yōu)勢方法。

生物法生產(chǎn)l-草銨膦以起始原料和途徑進行分類，主要包括以下3大類：

1)以l-草銨膦的衍生物為底物，通過酶法直接水解獲得，主要的優(yōu)點轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物ee值較高，但需要昂貴且不易獲得的手性原料作為前體(organophosphorusanaloguesandderivativesofthenaturall-aminocarboxylicacidsandpeptides.i.enzymaticsynthesisofd-,dl-,andl-phosphinothricinandtheircyclicanalogues[j].bullchemsocjpn,1988,61(10):3699-3704.)。例如生物法制備l-草銨膦最簡單的方法就是利用蛋白酶直接水解雙丙氨膦。雙丙氨膦是一種天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，雙丙氨膦脫去2分子l-丙氨酸，生成l-草銨膦。

2)以外消旋草銨膦的前提為底物，通過酶的選擇性拆分獲得。主要優(yōu)點為原料相對易得，催化劑活力高，但其理論收率只能達到50％，會造成原料的浪費。natchev報道了一種采用α-胰凝乳蛋白酶拆分雙丙氨膦乙酯制備l-草銨膦的方法，該法首先經(jīng)過3步反應(yīng)將外消旋的草銨膦合成雙丙氨膦二乙酯，接著用堿性mesinterico肽酶將其c端脂基水解。再經(jīng)α-胰凝乳蛋白酶催化水解肽鍵(cheminformabstract:totalsynthesisandenzyme-substrateinteractionofd-,dl-,andl-phosphinotricine,“bialaphos”(sf-1293)anditscyclicanalogues[j].cheminform,1989,1(17):125-131.)。在該步反應(yīng)中，α-胰凝乳蛋白酶能選擇性水解l-雙丙氨膦乙酯，生成l-草銨膦乙脂。最后利用磷酸二脂酶水解p端酯基得到l-草銨膦。

3)以α-酮酸-2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸為底物，通過酶的不對稱合成獲得，主要涉及的酶包括轉(zhuǎn)氨酶與氨基酸脫氫酶。

早在研究草銨膦在土壤微生物體內(nèi)的代謝途徑時就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，l-草銨膦在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用被分解成一種α-酮酸-2-羰基-4-(羥基甲基膦酰基)丁酸(簡稱ppo)。

schulza等(stereospecificproductionoftheherbicidephosphinothricin(glufosinate)bytransamination:isolationandcharacterizationofaphosphinothricin-specifictransaminasefromescherichiacoli[j].applied&environmentalmicrobiology,1990,56(1):1-6.)在上世紀90年代就利用從大腸桿菌中克隆的轉(zhuǎn)氨酶，以2-羰基-4-(羥基甲基膦酰基)丁酸為底物，l-谷氨酸作為氨基供體，催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生產(chǎn)l-草銨膦。該在轉(zhuǎn)氨酶經(jīng)固定化并安裝至生物反應(yīng)器，催化制備l-草銨膦，其產(chǎn)物濃度可達76.1g/l，最高產(chǎn)率為50g/(l·h)，l-草銨膦的ee值超過99.9％。但利用轉(zhuǎn)氨酶制備l-草銨膦有兩大缺陷，其一是原料ppo不能完全轉(zhuǎn)化為l-ppt，轉(zhuǎn)化率最高只有90％；其二是要使可逆反應(yīng)向生成l-ppt的方向進行，需要4倍當量以上的l-谷氨酸作為氨基供體，過量的谷氨酸給l-草銨膦的分離帶來了很大的麻煩。

氨基酸脫氫酶(ec1.4.1.-，aadh)是一類能將氨基酸可逆的脫氨生成對應(yīng)酮酸的酶，其反應(yīng)需要核苷類輔酶的參與(nad(p)⁺)。根據(jù)其底物特異性，可分為谷氨酸脫氫酶、亮氨酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、纈氨酸脫氫酶等。因其表現(xiàn)出的優(yōu)良催化效率與選擇性，氨基酸脫氫酶被廣泛的應(yīng)用于天然與非天然α-氨基酸的合成。例如，li等利用亮氨酸脫氫酶制備l-叔亮氨酸，0.6m的底物能夠在5.5h被完全轉(zhuǎn)化，且其產(chǎn)物的ee值高達99％(stereoselectivesynthesisofl-tert-leucinebyanewlyclonedleucinedehydrogenasefromexiguobacteriumsibiricum[j].journalofmolecularcatalysisbenzymatic,2014,105(7):11-17.)。hanson等人利用谷氨酸脫氫酶制備l-6-羥基正亮氨酸，其最終產(chǎn)率為91～97％，ee值大于99％(enzymaticsynthesisofl-6-hydroxynorleucine.[j].bioorganic&medicinalchemistry,1999,7(10):2247-2252.)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有l(wèi)-草銨膦合成工藝存在的缺陷，提供了一種利用氨基酸脫氫酶制備l-草銨膦的方法，該方法原料轉(zhuǎn)化率高、收率高、產(chǎn)物易于分離提純。

本發(fā)明提供了一種利用氨基酸脫氫酶制備l-草銨膦的方法，以2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸或其鹽為底物，在無機氨基供體及還原型輔酶存在的條件下，利用離體的谷氨酸脫氫酶或體外表達谷氨酸脫氫酶的細胞作為催化劑，進行還原胺化反應(yīng)，獲得l-草銨膦。

為獲得本發(fā)明方法所需的酶類，申請人構(gòu)建了一個氨基酸脫氫酶庫，該酶庫的構(gòu)建步驟為：(1)將本實驗室保藏的野生菌進行活化培養(yǎng)，并按試劑盒操作說明進行全基因組的提取；(2)通過基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)查詢不同菌株基因組中包含的氨基酸脫氫酶基因序列，并設(shè)計特異性引物進行合成；(3)通過pcr對不同菌種中的氨基酸脫氫酶基因進行擴增；(4)擴增產(chǎn)物通過酶切、酶連與表達載體進行連接；(5)酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到表達宿主中；(6)測序驗證重組菌是否構(gòu)建成功；(7)構(gòu)建成功重組菌，編號，放入-80℃冰箱保藏備用。

上述氨基酸脫氫酶庫中所包含的氨基酸脫氫酶根據(jù)其底物特異性可分為谷氨酸脫氫酶(gludh)、丙氨酸脫氫酶(aladh)、亮氨酸脫氫酶(leudh)、纈氨酸脫氫酶(valdh)，具體來源和序列見實施例的表3和表4。

其中，所述谷氨酸脫氫酶來源于pseudomonasentomophilastr.l48、pseudomonasputidakt2440或bordetellaprtriidsm12804。

進一步地，所述谷氨酸脫氫酶的ncbi登錄號為wp_044487662.1、np_742836.1或wp_012247444.1。

更優(yōu)選，所述谷氨酸脫氫酶的ncbi登錄號為wp_012247444.1；采用該氨基酸序列的谷氨酸脫氫酶作為催化劑，催化獲得的l-草銨膦產(chǎn)率高達99.2％，ee值達到99％以上。

作為優(yōu)選，所述細胞為表達氨基酸脫氫酶的工程菌，所述工程菌的宿主細胞為e.colibl21(de3)。

具體地，所述工程菌含有表達載體pet-28a(+)，所述氨基酸脫氫酶基因連接在表達載體pet-28a(+)上。

反應(yīng)體系中，催化劑的使用形式為細胞破碎后的粗酶液，也可以為表達重組酶的工程菌靜息細胞，還可以采用純化后的純酶，或者是經(jīng)固定化后的酶。

作為優(yōu)選，反應(yīng)體系中，催化劑的添加量以10000rpm離心10min后的細胞濕重計，所述細胞的添加量為反應(yīng)液重量的0.5～15％。

作為優(yōu)選，所述無機氨基供體為氨水、硫酸銨、氯化銨、磷酸氫二銨、乙酸銨、甲酸銨或碳酸氫銨；無機氨基供體的添加量為0.05～1.5m。

作為優(yōu)選，反應(yīng)體系中，所述底物的濃度為10～100mm。

具體地，所述還原型輔酶為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；還原型輔酶的添加量為10～100mm。

上述反應(yīng)體系中，可通過輔酶再生系統(tǒng)實現(xiàn)輔酶的再生。具體地，反應(yīng)體系中還包括輔酶再生系統(tǒng)，所述輔酶再生系統(tǒng)為：以葡萄糖脫氫酶為輔酶再生酶、以葡萄糖為輔酶再生底物、包含nad(p)h和nad(p)⁺的葡萄糖脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)；或，以醇脫氫酶為輔酶再生酶、以異丙醇為輔酶再生底物、包含nad(p)h和nad(p)⁺的醇脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)；或者，以甲酸脫氫酶為輔酶再生酶、以甲酸鹽為輔酶再生底物、包含nad(p)h和nad(p)⁺的甲酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)。

作為優(yōu)選，所述輔酶再生系統(tǒng)為以葡萄糖脫氫酶為輔酶再生酶、以葡萄糖為輔酶再生底物、包含nad(p)h和nad(p)⁺的葡萄糖脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)；或，以醇脫氫酶為輔酶再生酶、以異丙醇為輔酶再生底物、包含nad(p)h和nad(p)⁺的醇脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)。

所述葡萄糖脫氫酶來源于枯草芽胞桿菌bacillussubtilis168，ncbi登錄號為np_388275.1；醇脫氫酶來源于lactobscilluskefirdsm20587，ncbi登錄號為aap94029.1。

作為優(yōu)選，反應(yīng)體系中，所述輔酶再生系統(tǒng)的葡萄糖脫氫酶添加量(質(zhì)量分數(shù))為反應(yīng)液重量的0.5～15％，葡萄糖添加量為10～200mm；或者，醇脫氫酶添加量(質(zhì)量分數(shù))為反應(yīng)液重量的0.5～15％，異丙醇添加量為10～200mm。

作為優(yōu)選，所述還原胺化反應(yīng)的溫度為20～70℃，時間為6～72h，反應(yīng)液的ph值為6～9。更優(yōu)選，所述溫度為30～60℃，時間為12～36h。采用緩沖液實現(xiàn)ph的穩(wěn)定，所述緩沖液為ph6～8磷酸鹽緩沖液與ph8～9tris-hcl緩沖液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明方法以2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸或其鹽為底物，在無機氨基供體與輔酶存在時，通過氨基酸脫氫酶催化底物發(fā)生氨化還原反應(yīng)直接制備手性純的l-草銨膦，該方法原料轉(zhuǎn)化率高、收率高、產(chǎn)物易于分離提純且手性純度較高。

(2)本發(fā)明方法與轉(zhuǎn)氨酶等催化工藝相比，工藝相對簡單，原料轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化率可達100％，且獲得的產(chǎn)物易于從反應(yīng)液中分離提純。

附圖說明

圖1為利用氨基酸脫氫酶制備l-草銨膦的反應(yīng)式。

圖2為利用氨基酸脫氫酶與輔酶再生酶雙酶耦聯(lián)制備l-草銨膦的反應(yīng)式。

圖3為底物2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸的標樣高效液相檢測圖譜(非手性分析，5mm)；

其中，底物ppo的保留時間為9.7min。

圖4為外消旋草胺膦標樣柱前衍生化高效液相圖譜(手性分析，0.5mm)；

其中，保留時間：l-草銨膦為6.2min，d-草銨膦為7.3min。

圖5為實施案例18中的反應(yīng)進程圖。

圖6為實施案例18中反應(yīng)液(反應(yīng)結(jié)束后)的高效液相檢測圖譜(非手性分析)。

圖7為實施案例18中反應(yīng)液(反應(yīng)結(jié)束后)柱前衍生化高效液相檢測圖譜(手性分析)。

圖8為原料2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸(簡稱ppo)的質(zhì)譜圖；

其中，a圖為ppo的正源質(zhì)譜圖；b圖為ppo的負源質(zhì)譜圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步描述。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明中的實驗方法如無特別說明均為常規(guī)方法，基因克隆操作具體可參見j.薩姆布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。

上游基因工程操作所用試劑：本發(fā)明實施例中使用的限制性內(nèi)切酶和dna連接酶均購自takara，寶生物工程(大連)有限公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、dna回收純化試劑盒購自axygen杭州有限公司；e.colibl21(de3)、質(zhì)粒等購自novagen公司；dnamarker、fastpfudna聚合酶、低分子量標準蛋白、瓊脂糖電泳試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成與基因測序工作由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。以上試劑使用方法參考商品說明書。

下游催化工藝所用試劑：2-羰基-4-(羥基甲基膦酰基)丁酸(簡稱ppo)為人工合成，其質(zhì)譜圖如圖8所示；d，l-草銨膦、l-草銨膦標準品購自sigma-aldrich公司；nadh與nadph購于邦泰生物工程(深圳)有限公司；其他常用試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸(簡稱ppo)的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示；l-草銨膦(簡稱l-ppt)的結(jié)構(gòu)式如式(2)所示；具體如下：

本發(fā)明通過高效液相色譜(hplc)分析反應(yīng)液中底物的濃度，監(jiān)測反應(yīng)的進行。hplc分析方法為：色譜柱型號：qs-c18,5μm,4.6×250mm。流動相：50mm(nh4)2hpo4,加入1％的10％四丁基氫氧化銨水溶液，用50％磷酸(質(zhì)量分數(shù))調(diào)ph至3.6，加入8％乙腈。檢測波長：205nm。流速：1.0ml/min。柱溫：40℃。底物出峰情況見，附圖3。

產(chǎn)物的手性分析及濃度分析通過柱前衍生化高效液相色譜進行，具體的分析方法為：

(1)色譜條件：色譜柱型號：qs-c18,5μm,4.6×250mm。流動相：50mm乙酸鈉溶液：乙腈＝8：0.5。檢測波長：338nm。流速：0.85ml/min。柱溫：30℃。

(2)衍生化試劑：分別稱取0.03g鄰苯二甲醛與0.1gn-乙酰-l-半胱氨酸，用400ul乙醇助溶，再加入4ml0.2mol/硼酸緩沖液(ph9.8)，振蕩使其充分溶解，4℃冰箱保存?zhèn)溆?不超過4天)。

(3)衍生化反應(yīng)與測定：取100μl樣品加入150μl衍生化試劑，混勻后至于25℃保溫5min，進樣20μl進行分析。

d-草銨膦與l-草銨膦的出峰情況，見附圖4。

實施例1氨基酸脫氫酶的構(gòu)建

一、野生菌的活化及基因組提取

所有野生菌均使用lb培養(yǎng)基進行活化與培養(yǎng)，配方為：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，用去離子水溶解后定容，121℃滅菌20min，待用。固體培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基加入2％的瓊脂。

將保存有野生菌的甘油管劃線至含有l(wèi)b固體培養(yǎng)基的平皿上，30℃靜置培養(yǎng)2～3天。從平皿上挑取菌落接入含有50mllb培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、200rpm培養(yǎng)2～3天。在獲得培養(yǎng)液后，根據(jù)基因組提取試劑盒的操作說明書進行全基因組的提取。所得基因組可直接用于目的基因的擴增也可置于-20℃長期保存。

二、目的基因的擴增

分別從大腸桿菌e.colik12w3110、蠟樣芽胞桿菌bacilluscereusatcc14579、谷氨酸棒狀桿菌corynebacteriumglutamicumatcc13032等野生菌的基因組中克隆氨基酸脫氫酶的基因。通過查詢這些野生菌在基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)登陸的全基因組序列，找到其中編碼氨基酸脫氫酶的基因序列，設(shè)計特異性引物。以克隆來自大腸桿菌e.colik12w3110中的谷氨酸脫氫酶(e1)與來自bacillussubtilis168的亮氨酸脫氫酶(e3)為例，根據(jù)相應(yīng)基因組dna序列(genbank登錄號分別為nc_007779.1和nc_000964.3)中注釋為氨基酸脫氫酶的蛋白質(zhì)的核酸序列，設(shè)計相應(yīng)的pcr上游引物和下游引物。

來源于e.coli的谷氨酸脫氫酶的引物：

e1-f序列：5’-cgcggatccatggatcagacatattctctgg-3’(bamhi)

e1-r序列：5’-ccgctcgagttaaatcacaccctgcgcca-3’(xhoi)

來源于bacillussubtilis的轉(zhuǎn)氨酶的引物：

e3-f序列：5’-cgcggatccatggaactttttaaatatatgg-3’(bamhi)

e3-r序列：5’-ccgctcgagttaacgtctgcttaatacac-3’(xhoi)

在上、下游引物中分別加入限制性內(nèi)切酶切位點，如下劃線所示，具體限制性內(nèi)切酶見引物序列括號內(nèi)。分別以大腸桿菌e.colik12w3110、枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168基因組為模板，相應(yīng)的上下游引物進行pcr擴增，pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

pcr擴增體系：

pcr擴增條件：

1)預(yù)變性：95℃5min；

2)變性：98℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃10s；共循環(huán)30次；

3)后延伸：72℃10min；

4)4℃保存。

pcr擴增結(jié)束后，擴增產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳來檢測，結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物為單一條帶，大小分別為1400bp與1100bp左右。用dna回收純化試劑盒對擴增產(chǎn)物進行純化回收，具體步驟參照純化試劑盒說明書。

二、表達載體和工程菌的構(gòu)建

表達載體pet-28a(+)和pcr擴增產(chǎn)物分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶在37℃雙酶切3h。酶切體系如表1所示：

表1酶切體系

酶切完成后用dna純化試劑盒對酶切產(chǎn)物進行純化回收以去除限制性內(nèi)切酶和酶切下來的核苷酸小片段。雙酶切后的pcr擴增產(chǎn)物用t4dna連接酶將其連接至具有相對應(yīng)切口的表達載體pet-28a(+)上，連接體系如下表1所示：

表2pet-28a(+)-gabt重組表達質(zhì)粒連接體系

將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)感受態(tài)細胞中，涂平板、挑單菌落至lb液體培養(yǎng)，pcr法鑒定構(gòu)建成功的陽性轉(zhuǎn)化子，并由測序公司來驗證插入序列的正確性。驗證后無誤的基因工程菌即為重組氨基酸脫氫酶表達菌株，加入終濃度為25％的無菌甘油后，編號，置于-80℃保藏備用。下表為構(gòu)建的氨基酸脫氫酶庫：

表3所構(gòu)建氨基酸脫氫酶庫

*gludh:谷氨酸脫氫酶；leudh：亮氨酸脫氫酶；aladh：丙氨酸脫氫酶；valdh：纈氨酸脫氫酶。以上編號用于區(qū)分各氨基酸脫氫酶，因各氨基酸脫氫酶均具有ncbi登錄號，故未在序列表中列出。

實施例2菌體的培養(yǎng)及粗酶液的制備

一、菌體的培養(yǎng)

lb液體培養(yǎng)基組成：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，用去離子水溶解后定容，121℃滅菌20min，待用。

將含有氨基酸脫氫酶基因的工程菌在經(jīng)平皿劃線活化后，挑單菌落接種至含50μg/ml卡那霉素的5mllb液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12h。按2％的接種量轉(zhuǎn)接至50ml同樣含50μg/mlkan的新鮮lb液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至od600達到0.8左右時，加入iptg至其終濃度為0.5mm，18℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)16h。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液10000rpm離心10min，棄上清，收集菌體，放到-80℃超低溫冰箱中保存，待用。

二、粗酶液的制備

將培養(yǎng)結(jié)束后收集到的菌體，用50mmph8.0的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體兩次。之后將菌體重懸于ph8.0的磷酸鹽緩沖液中，400w功率超聲破碎30次，每次超聲持續(xù)3s，間歇7s。將此細胞破碎液12000g4℃離心3min去除沉淀，得到的上清為含重組氨基酸脫氫酶的粗酶液。

實施例3酶庫酶活的測定

標準酶活檢測體系：25g/l濕菌體(超聲波破碎)、10mm底物、20mm輔酶(nadh或nadph)、750mmnh4cl，總體系為400μl，反應(yīng)介質(zhì)為ph8.0磷酸鹽緩沖液。單位酶活的定義：在標準的反應(yīng)條件下，每分鐘生成1μmoll-草銨膦所需要的酶量。

按照上述標準酶活檢測體系配置反應(yīng)溶液，于30℃金屬浴振蕩反應(yīng)器內(nèi)反應(yīng)6h，加入40μl5mnaoh終止反應(yīng)后置于冰上保存。樣品稀釋一定倍數(shù)后利用柱前衍生化高效液相檢測其l-草銨膦的濃度，并計算酶活。

表4酶庫酶活測定結(jié)果

注釋：1：n.d為未檢測出酶活；2：unkwn表示輔酶特異性未知，檢測酶活時分別添加nadh或nadph。

實施例4菌體的大規(guī)模制備

因l-草銨膦的制備實驗中，需使用大量的生物催化劑，因此要進行菌體的大規(guī)模制備。所用培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基，具體配方見實施例2。

將保藏有重組酶工程菌的甘油管經(jīng)平皿劃線活化后，挑單菌落接種至含50μg/ml卡那霉素的50mllb液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12h。按2％的接種量轉(zhuǎn)接至1l同樣含50μg/mlkan的新鮮lb液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至od600達到0.8左右時，加入iptg至其終濃度為0.5mm，18℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)16h。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液10000rpm離心10min，棄上清，收集菌體，放到-80℃超低溫冰箱中保存，待用。

粗酶液的制備見實施例2。

實施例5谷氨酸脫氫酶(e1)單酶制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e1的基因工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nadph、nh4cl到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液ph＝8.0，加入20ml粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為20mm，nadph的終濃度為20mm，nh4⁺為0.5m，濕菌體濃度為20g/l。通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃；磁力攪拌，反應(yīng)時間為24h后利用非手性液相色譜檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢測l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余4.3mm，轉(zhuǎn)化率78.5％。l-ppt的生成濃度為15.3mm，產(chǎn)率為76.5％，產(chǎn)物ee值達99％以上。

實施例6谷氨酸脫氫酶(e2)單酶制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e2的基因工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nadph、nh4cl到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液ph＝8.0，加入20ml粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為20mm，nadph的終濃度為20mm，nh4⁺為0.5m，濕菌體濃度為20g/l。通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃；磁力攪拌，反應(yīng)時間為24h后利用非手性液相色譜檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢測l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余11.5mm，轉(zhuǎn)化率42.5％。l-ppt的生成濃度為8.3mm，產(chǎn)率為41.5％，產(chǎn)物ee值達99％以上。

實施例7亮氨酸脫氫酶(e3)單酶制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達亮氨酸脫氫酶e3的基因工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nadh、nh4cl到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液ph＝8.0，加入20ml粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為20mm，nadh的終濃度為20mm，nh4⁺為0.5m，濕菌體濃度為20g/l。通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃；磁力攪拌，反應(yīng)時間為24h后利用非手性液相色譜檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢測l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余17.6mm，轉(zhuǎn)化率12.0％。l-ppt的生成濃度為2.08mm，產(chǎn)率為10.4％，產(chǎn)物ee值達99％以上。

實施例8谷氨酸脫氫酶(e4)單酶制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e4的基因工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nadph、nh4cl到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液ph＝8.0，加入20ml粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為20mm，nadph的終濃度為20mm，nh4⁺為0.5m，濕菌體濃度為25g/l。通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃；磁力攪拌，反應(yīng)時間為24h后利用非手性液相色譜檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢測l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余0mm，轉(zhuǎn)化率100％。l-ppt的生成濃度為19.5mm，產(chǎn)率為97.5％，產(chǎn)物ee值達99％以上。

實施例9谷氨酸脫氫酶(e5)單酶制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e5的基因工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nadph、nh4cl到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入20ml粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為20mm，nadph的終濃度為20mm，nh4⁺為0.5m，濕菌體濃度為25g/l。通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃；磁力攪拌，反應(yīng)時間為24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余0mm，轉(zhuǎn)化率100％。l-ppt的生成濃度為19.57mm，產(chǎn)率為97.9％，ee值達99％以上。

實施例10丙氨酸脫氫酶(e7)單酶制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達丙氨酸脫氫酶e7的基因工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nadh、nh4cl到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入20ml粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為20mm，nadh的終濃度為20mm，nh4⁺為0.5m，濕菌體濃度為25g/l。通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃；磁力攪拌，反應(yīng)時間為24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余18.1mm，轉(zhuǎn)化率9.5％。l-ppt的生成濃度為1.8mm，產(chǎn)率為9.0％，ee值達99％以上。

實施例11纈氨酸脫氫酶(e9)單酶制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達纈氨酸脫氫酶e9的基因工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nadh、nh4cl到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入20ml粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為20mm，nadh的終濃度為20mm，nh4⁺為0.5m，濕菌體濃度為25g/l。通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃；磁力攪拌，反應(yīng)時間為24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余19.8mm，轉(zhuǎn)化率1％。l-ppt的生成濃度為0.0mm。

實施例12谷氨酸脫氫酶(e10)單酶制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e10的基因工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nadph、nh4cl到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入20ml粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為20mm，nadph的終濃度為20mm，nh4⁺為0.5m，濕菌體濃度為25g/l。通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃；磁力攪拌，反應(yīng)時間為24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余5.2mm，轉(zhuǎn)化率74％。l-ppt的生成濃度為14.1mm，產(chǎn)率為70.5％，ee值達99％以上。

實施例13谷氨酸脫氫酶(e11)單酶制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e11的基因工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nadph、nh4cl到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入20ml粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為20mm，nadph的終濃度為20mm，nh4⁺為0.5m，濕菌體濃度為25g/l。通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃；磁力攪拌，反應(yīng)時間為24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余0mm，轉(zhuǎn)化率100％。l-ppt的生成濃度為19.7mm，產(chǎn)率為98.5％，ee值達99％以上。

實施例14谷氨酸脫氫酶(e4)，葡萄糖糖脫氫酶(來源于枯草芽胞桿菌bacillussubtilis168，ncbi登錄號為np_388275.1)雙酶耦聯(lián)制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠谷氨酸脫氫酶(e4)和葡萄糖糖脫氫酶的工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nh4cl、葡萄糖到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入10ml谷氨酸脫氫酶粗酶液與10ml醇脫氫酶粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為50mm，nadp⁺的終濃度為1mm，nh4⁺為0.5m，葡萄糖濃度為100mm，谷氨酸脫氫酶濕菌體濃度為20g/l，醇脫氫酶濕菌體濃度為10g/l，通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃。反應(yīng)時間24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余1.7mm，轉(zhuǎn)化率96.6％。l-ppt的生成濃度為48.1mm，產(chǎn)率為96.2％，ee值達到99％以上。

實施例15谷氨酸脫氫酶(e4)，醇脫氫酶(lactobscilluskefirdsm20587，ncbi登錄號為aap94029.1)雙酶耦聯(lián)制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e4和醇脫氫酶的工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nh4cl、異丙醇到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入10ml谷氨酸脫氫酶粗酶液與10ml醇脫氫酶粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為50mm，nadp⁺的終濃度為1mm，nh4⁺為0.5m，異丙醇濃度為100mm，谷氨酸脫氫酶濕菌體濃度為20g/l，醇脫氫酶濕菌體濃度為20g/l，通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃。反應(yīng)時間24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余6.3mm，轉(zhuǎn)化率87.4％。l-ppt的生成濃度為42.3mm，產(chǎn)率為84.6％，ee值達到99％以上。

實施例16谷氨酸脫氫酶(e5)，葡萄糖糖脫氫酶(來源于枯草芽胞桿菌bacillussubtilis168，ncbi登錄號為np_388275.1)雙酶耦聯(lián)制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e5和葡萄糖糖脫氫酶的工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nh4cl、葡萄糖到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入10ml谷氨酸脫氫酶粗酶液與10ml醇脫氫酶粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為50mm，nadp⁺的終濃度為1mm，nh4⁺為0.5m，葡萄糖濃度為100mm，谷氨酸脫氫酶濕菌體濃度為20g/l，醇脫氫酶濕菌體濃度為10g/l，通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃。反應(yīng)時間24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余0.3mm，轉(zhuǎn)化率99.4％。l-ppt的生成濃度為49.1mm，產(chǎn)率為98.2％，ee值達到99％以上。

實施例17谷氨酸脫氫酶(e5)，醇脫氫酶(lactobscilluskefirdsm20587，ncbi登錄號為aap94029.1)雙酶耦聯(lián)制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e5和醇脫氫酶的工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nh4cl、異丙醇到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入10ml谷氨酸脫氫酶粗酶液與10ml醇脫氫酶粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為50mm，nadp⁺的終濃度為1mm，nh4⁺為0.5m，異丙醇濃度為100mm，谷氨酸脫氫酶濕菌體濃度為20g/l，醇脫氫酶濕菌體濃度為20g/l，通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃。反應(yīng)時間24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余3.7mm，轉(zhuǎn)化率92.6％。l-ppt的生成濃度為45.6mm，產(chǎn)率為91.2％，ee值達到99％以上。

實施例18谷氨酸脫氫酶(e11)，葡萄糖脫氫酶(來源于枯草芽胞桿菌bacillussubtilis168，ncbi登錄號為np_388275.1)雙酶耦聯(lián)制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e11和葡萄糖脫氫酶的工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nh4cl、葡萄糖到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入10ml谷氨酸脫氫酶粗酶液與10ml葡萄糖脫氫酶粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為50mm，nadp⁺的終濃度為1mm，nh4⁺為0.5m，葡萄糖濃度為100mm，谷氨酸脫氫酶濕菌體濃度為20g/l，葡萄糖脫氫酶濕菌體濃度為10g/l。通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃；磁力攪拌，非手性hplc監(jiān)測反應(yīng)進行，其反應(yīng)進程如附圖5所示。

反應(yīng)時間24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余0mm，轉(zhuǎn)化率100％。l-ppt的生成濃度為49.6mm，產(chǎn)率為99.2％，ee值達到99％以上。

反應(yīng)液樣品(24h)高效液相檢測圖譜(非手性分析)見附圖6，反應(yīng)液(24h)柱前衍生化hplc檢測圖譜(手性分析)見附圖7。

實施例19谷氨酸脫氫酶(e11)，醇脫氫酶(lactobscilluskefirdsm20587，ncbi登錄號為aap94029.1)雙酶耦聯(lián)制備l-草銨膦

按實施例4的方法培養(yǎng)能夠表達谷氨酸脫氫酶e11和醇脫氫酶的工程菌，離心收集細胞，并超聲破胞制備粗酶液。

定量稱取ppo、nh4cl、異丙醇到100ml反應(yīng)器中，用30％氨水調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0，加入10ml谷氨酸脫氫酶粗酶液與10ml醇脫氫酶粗酶液，用100mmph8.0的磷酸鹽緩沖液定容到100ml，使ppo的終濃度為50mm，nadp⁺的終濃度為1mm，nh4⁺為0.5m，異丙醇濃度為100mm，谷氨酸脫氫酶濕菌體濃度為20g/l，醇脫氫酶濕菌體濃度為20g/l，通過水浴控制反應(yīng)溫度為37℃。反應(yīng)時間24h后利用非手性hplc檢測ppo的殘余濃度，同時利用柱前衍生化高效液相色譜檢查l-ppt的生成量與ee值。

反應(yīng)結(jié)束數(shù)據(jù)如下：ppo剩余0mm，轉(zhuǎn)化率100％。l-ppt的生成濃度為49.3mm，產(chǎn)率為98.6％，ee值達到99％以上。

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<110>浙江大學(xué)

<120>一種利用氨基酸脫氫酶制備l-草銨膦的方法

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