本發(fā)明涉及一種抗菌六肽及其衍生物及它們的應(yīng)用，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：全球每年的細(xì)菌感染病患高達(dá)15億人，其中死亡人數(shù)460萬(wàn)，特別是多藥耐藥菌(mdrb)感染導(dǎo)致的高死亡率，嚴(yán)重威脅公眾健康。歐洲與美國(guó)每年因細(xì)菌感染防治的支出高達(dá)70億歐元和65億美元，而發(fā)展中國(guó)家則需為此承擔(dān)更為高昂的代價(jià)。mdrb感染在全球的快速蔓延與抗生素濫用及其研發(fā)斷代密切相關(guān)，即1962至2000年間并未開發(fā)出新結(jié)構(gòu)類型的抗生素；2000年以來(lái)僅有3個(gè)新結(jié)構(gòu)類型的抗菌藥物進(jìn)入市場(chǎng)。美國(guó)感染病學(xué)會(huì)(idsa)自2004年開始呼吁振興抗生素研發(fā)并給予項(xiàng)目資助，擬在2020年前開發(fā)10個(gè)結(jié)構(gòu)全新的抗菌藥物。可以預(yù)測(cè)，抗mdrb感染藥物的研發(fā)將獲得快速發(fā)展。鮑曼不動(dòng)桿菌(ab)是一種嚴(yán)重的醫(yī)源性病原菌，導(dǎo)致呼吸道、血液、尿道、軟組織及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，在病患之間通過(guò)直接或間接接觸方式傳播。根據(jù)2006-2007年國(guó)內(nèi)外院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)資料顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌在院內(nèi)感染中的檢出率居前四位，在免疫力低下的患者中，可以引起嚴(yán)重的甚至致死性的感染。它可以引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、敗血癥、腦膜炎、中耳炎、皮膚軟組織感染、泌尿系統(tǒng)感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等嚴(yán)重感染性疾病。由于鮑曼不動(dòng)桿菌感染引起的發(fā)病率和病死率增加，其被稱為“革蘭陰性的mrsa”。在常規(guī)ab感染中，多藥耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(mrab)的發(fā)生率從2004年的23％上升到2014年的63％，其平均發(fā)生率也顯著高于其他革蘭氏陰性菌(44％vs13％)。目前，95％的mrab對(duì)頭孢曲松有抗性，90％的mrab對(duì)頭孢他啶、左氧氟沙星、美羅培南、哌拉西林-他唑巴坦等藥物耐藥，是臨床耐藥菌感染疾病治療的一大難題。因此，篩選結(jié)構(gòu)新穎的抗菌藥物以應(yīng)對(duì)mrab感染將成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)?？咕?amp)是存在于所有生物體中的一類短肽，具有陽(yáng)離子性和兩親性的特點(diǎn)且結(jié)構(gòu)多樣，是生物體天然免疫系統(tǒng)對(duì)抗病原菌入侵的重要組成部分，在生物進(jìn)化過(guò)程中保持穩(wěn)定和高效。截至目前，文獻(xiàn)已報(bào)道約5000條amp序列，其中74條已進(jìn)入藥物開發(fā)階段。由于amp主要以細(xì)菌細(xì)胞膜為作用靶標(biāo)，與傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)制存在顯著區(qū)別，對(duì)mdrb具有顯著的抗菌效果，是對(duì)抗mdrb最具發(fā)展?jié)摿Φ暮蜻x結(jié)構(gòu)類型。然而，天然amp仍然存在氨基酸序列長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高，耐酶穩(wěn)定性差、體內(nèi)易降解，以及細(xì)胞溶解毒性等問(wèn)題，其在臨床應(yīng)用上面臨嚴(yán)重困境。通過(guò)化學(xué)合成方法獲得的非天然小分子抗菌肽(samp)，其序列僅由3-9氨基酸殘基構(gòu)成，由于非天然氨基酸(如d-型氨基酸或氨基酸殘基修飾物)的存在，使其具有活性顯著、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于合成、穩(wěn)定性好、安全性高等優(yōu)勢(shì)，受到研究人員的廣泛關(guān)注。因此，通過(guò)化學(xué)合成方法發(fā)現(xiàn)抗菌活性強(qiáng)、耐酶穩(wěn)定性好、體內(nèi)安全性高的samp及其類似物，是解決mrab感染問(wèn)題的有效途徑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有的問(wèn)題，本發(fā)明的第一目的在于提供一種抗菌六肽。本發(fā)明的第二目的在于提供該種抗菌六肽的應(yīng)用，本發(fā)明的第三目的在于提供一種抗菌六肽衍生物，第四目的在于提供該抗菌六肽衍生物的應(yīng)用。該抗菌六肽及抗菌六肽衍生物對(duì)革蘭氏細(xì)菌有廣譜抗菌活性，其中抗菌六肽衍生物對(duì)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出高效的抑制作用，并且該抗菌六肽及其衍生物的毒性小。為了實(shí)現(xiàn)上述第一目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種抗菌六肽，其特征在于：該抗菌六肽的序列為：arg-arg-trp-trp-arg-trp。為了實(shí)現(xiàn)上述第二目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：上述抗菌六肽應(yīng)用于制備治療或預(yù)防細(xì)菌感染的藥物中。為了實(shí)現(xiàn)上述第三目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種抗菌六肽衍生物，其特征在于：該抗菌六肽衍生物的序列為：arg-arg-trp-trp-arg-trp-β-苯乙胺(抗菌肽b)。為了實(shí)現(xiàn)上述第四目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：上述抗菌六肽衍生物應(yīng)用于制備治療或預(yù)防細(xì)菌感染的藥物中。進(jìn)一步的：所述細(xì)菌為耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌。此處的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為廣義上的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，包括耐單種藥的鮑曼不動(dòng)桿菌和耐多重藥的鮑曼不動(dòng)桿菌。本發(fā)明思路如下：在天然抗菌肽lactoferricinb4-9rrwqwr基礎(chǔ)上，結(jié)合虛擬組合庫(kù)設(shè)計(jì)技術(shù)，dnastar，bioedit，sequencelogo等分析軟件和網(wǎng)站，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)一條具有抗菌活性的全新多肽序列rrwwrw(arg-arg-trp-trp-arg-trp)，在其c端苯乙胺化后仍具有顯著的抗菌活性。新發(fā)現(xiàn)的抗菌六肽及其衍生物相比lfcinb4-9殺菌效果更佳，無(wú)溶血毒性，尤其是其衍生物對(duì)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺菌活性，溶血毒性小，有望作為治療細(xì)菌感染尤其是耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的新藥研究和開發(fā)。利用美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物公司生產(chǎn)的pioneer多肽合成儀基于固相合法制備本發(fā)明公開的抗菌六肽苯乙胺修飾物(抗菌肽b)和抗菌六肽(抗菌肽a)以及天然抗菌肽lactoferricinb4-9rrwqwr。利用瓊脂空板穴擴(kuò)散法和96孔板法檢測(cè)本發(fā)明抗菌六肽及其衍生物的抑菌和殺菌活性，以預(yù)先合成的天然抗菌肽lactoferricinb4-9rrwqwr為對(duì)照，進(jìn)行殺菌活性檢測(cè)，結(jié)果表明本發(fā)明的抗菌六肽及其衍生物的殺菌活性顯著強(qiáng)于對(duì)照的天然抗菌肽lactoferricinb4-9rrwqwr的殺菌活性。與抗菌肽a相比，本發(fā)明的抗菌肽b在低濃度的條件下就能高效抑制耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)。能夠應(yīng)用于治療或預(yù)防因耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌而引起的疾病的藥物中，如應(yīng)用于治療因耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌而引起的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、敗血癥、腦膜炎、中耳炎、皮膚軟組織感染、泌尿系統(tǒng)感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等嚴(yán)重感染性疾病的藥物中?？咕脑诟咝⒕耐瑫r(shí)也有可能作用于高等有機(jī)體包括人體細(xì)胞，因?yàn)榭咕牡淖饔梅绞蕉际窃诩?xì)胞膜上穿孔使得細(xì)胞發(fā)生滲漏死亡。所以把抗菌肽能否使紅細(xì)胞發(fā)生滲漏作為其是否有毒性的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，如果抗菌肽能使紅細(xì)胞中的血紅蛋白發(fā)生滲漏，就可以通過(guò)檢測(cè)其od490值確定毒性的大小。實(shí)驗(yàn)表明，在高濃度下本發(fā)明的抗菌六肽衍生物溶血率依然非常低，證實(shí)本發(fā)明抗菌六肽衍生物的溶血毒性極小。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的人工設(shè)計(jì)合成的抗菌六肽及其苯乙胺修飾物，可方便地采用固相合成法獲得。該合成抗菌肽及其衍生物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌具有廣譜殺傷活性，尤其其衍生物對(duì)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌活性，溶血毒性極小，能夠應(yīng)用于治療或預(yù)防因耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌而引起的疾病的藥物中。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明抗菌六肽衍生物的質(zhì)譜圖。圖2為抗菌六肽的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述：實(shí)施例1：化學(xué)合成抗菌肽a和抗菌肽b及對(duì)照抗菌肽lactoferricinb4-9。抗菌肽a:rrwwrw(arg-arg-trp-trp-arg-trp)抗菌肽b:rrwwrw-pea(arg-arg-trp-trp-arg-trp-β-苯乙胺)1、抗菌肽b(arg-arg-trp-trp-arg-trp-β-苯乙胺)的制備：a.用4倍量dmf洗滌樹脂并完全干燥之后，加入10ml20％(哌啶:dmf，質(zhì)量比)哌啶、dmf混合溶液后振蕩1min并干燥，然后再加入10ml20％(哌啶:dmf，質(zhì)量比)哌啶、dmf混合溶液振蕩30min；干燥反應(yīng)容器并用4倍量的dmf洗滌樹脂，確保沒(méi)有哌啶殘留，用茚三酮檢查樹脂顆粒應(yīng)為藍(lán)色。b.將fmoc保護(hù)氨基酸(1mmol)、2.1ml0.45mhbtm/hobt(1mmol)、248uldiea(2mmol)溶液加入樹脂并振蕩30min；干燥反應(yīng)容器并用4倍量dmf洗滌樹脂，用茚三酮檢查如果為無(wú)色，則重新準(zhǔn)備樹脂，如果為藍(lán)色則繼續(xù)加入氨基酸進(jìn)行反應(yīng)；重復(fù)上述氨基酸連接反應(yīng)直到多肽合成結(jié)束；偶聯(lián)完成后，用低濃度三氟乙酸進(jìn)行裂解，用醚沉淀，沉淀物加入溶劑(四氫呋喃或者其混合溶劑)中，然后再加入苯乙胺反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用高濃度三氟乙酸脫保護(hù)基，用醚沉淀。c.將多肽-樹脂加入至1ml乙酸(acoh)、2ml三氟乙醇(tfe)和7ml二氯甲烷(dcm)的混合溶液中，在室溫?cái)嚢?h；過(guò)濾樹脂并用2倍量的tfe/dcm(體積比2:8)混合溶液沖洗，確?；厥账挟a(chǎn)物；蒸餾濃縮產(chǎn)物溶液至5ml以內(nèi)；向含有100ml上述濃縮溶液的試管中加入乙醚，查看完全保護(hù)的多肽是否溶于乙醚；如果不溶，則再次向試管內(nèi)加入冰乙醚促使產(chǎn)物析出，抽濾獲得產(chǎn)物粗品；如果溶解，則向乙醚中加入水促使產(chǎn)物析出，然后再抽濾獲得產(chǎn)物粗品。d.稱取100mg干燥后的上述固體多肽粗品，溶于10ml0.1％三氟乙酸(tfa)，樣品用0.22μm濾膜過(guò)濾之后，在反相高效液相色譜(rp-hplc)上分離純化；洗脫液為0.1％tfa水溶液(a)和0.1％的乙腈(acn)溶液(b)，洗脫條件為0-60％b梯度洗脫30min，收集洗脫峰置于凍干機(jī)(-50℃)中冷凍干燥；純化干燥后的抗菌肽用hplc測(cè)定純度并用質(zhì)譜(ms)檢測(cè)分子質(zhì)量與理論計(jì)算的分子量相符。本文的抗菌肽合成、純化、鑒定實(shí)驗(yàn)在上海紫域生物科技有限公司完成。2、抗菌肽a和抗菌肽lfcinb4-9rrwqwr的制備按照標(biāo)準(zhǔn)的fmoc固相程序人工合成抗菌肽a和抗菌肽lactoferricinb4-9，合成肽經(jīng)反相hplc(vydac218tp1022柱2.2×25cm)純化，采用乙腈/水/三氟乙酸系統(tǒng)洗脫，maldi-tof和epi質(zhì)譜分析。抗菌肽合成由上海紫域生物科技有限公司。實(shí)施例2抗菌肽的抗菌活性檢測(cè)以下所使用的各種標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心，耐藥菌由第三軍醫(yī)大學(xué)提供。采用瓊脂板擴(kuò)散法對(duì)合成抗菌肽b和抗菌肽a的抗菌活性進(jìn)行檢測(cè)，并用天然抗菌肽lfcinb4-9作為對(duì)照，以評(píng)價(jià)本發(fā)明中抗菌肽b和抗菌肽a的殺菌活性。按以下步驟進(jìn)行測(cè)定抗菌肽的抗菌活性：a.菌種復(fù)蘇：用接種環(huán)分別挑取適量大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、mrsa、耐單種藥鮑曼不動(dòng)桿菌(對(duì)頭孢他啶耐藥，下同)、多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(對(duì)慶大霉素和頭孢他啶同時(shí)耐藥，下同)于各自培養(yǎng)基中劃線，標(biāo)記。37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)(12-16h)。b.菌種培養(yǎng)：分別挑選單個(gè)菌落到100ml液體mhb培養(yǎng)液，置37℃、160轉(zhuǎn)，搖床培養(yǎng)(12-16h)。c.菌懸液制備：制備菌懸液的濁度在0.5麥?zhǔn)蠞岫茸笥遥藭r(shí)細(xì)菌菌落數(shù)約為1.5×108cfu/ml，然后再按1:1000稀釋成105-106cfu/ml的菌懸液。d.抑菌實(shí)驗(yàn)：將稀釋好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、mrsa、耐單種藥鮑曼不動(dòng)桿菌、多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌懸液分別按0.2ml/平板(平板直徑為150mm)的量均勻涂于40ml固體lb培養(yǎng)基；待培養(yǎng)基完全凝固后，打孔直徑8mm6個(gè)/平板，標(biāo)記為+/-/caz/a/b/c，分別代表陽(yáng)性對(duì)照(慶大霉素)、陰性對(duì)照(去離子水)、頭孢他啶、三條多肽(a為抗菌肽a；b為抗菌肽b；c為lfcinb64-9)?！?”孔加50ul1mg/ml慶大霉素溶液；“-”孔加50μl去離子水；“caz”孔加50ul1mg/ml頭孢他啶溶液；a/b/c孔分別加50ul1mg/ml抗菌肽溶液。4℃靜置3h后，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12h后觀察肉眼抑菌圈大小并測(cè)定抑菌圈直徑。每條肽在每種菌種下獨(dú)立進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。表11mg/ml抗菌肽對(duì)不同細(xì)菌的抗菌活性注：caz-頭孢他啶；“–”表示無(wú)明顯抑菌圈從上表1看出本發(fā)明的抗菌肽b和抗菌肽a殺菌能力明顯且優(yōu)于天然抗菌肽。實(shí)施例3合成抗菌肽的抑菌活性檢測(cè)以下所使用的各種標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心，耐藥菌由第三軍醫(yī)大學(xué)提供。采用96孔板法對(duì)合成抗菌肽的殺菌活性進(jìn)行檢測(cè)，并用天然抗菌肽lfcinb4-9作為對(duì)照，以評(píng)價(jià)抗菌肽a、b的抑菌活性。按以下步驟進(jìn)行測(cè)定抗菌肽的抑菌活性：a.將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、mrsa、耐單種藥鮑曼不動(dòng)桿菌、多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在滅菌na培養(yǎng)基平板上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于滅菌mhb培養(yǎng)液，37℃170r/min培養(yǎng)18～24h。b.將培養(yǎng)后的菌液稀釋成105-106cfu/ml的菌懸液。分別將有抑菌活性的待測(cè)擬肽溶液按2倍連續(xù)稀釋后加入96孔微量培養(yǎng)板中，第1孔及第12孔留空不用(避免邊際效應(yīng)致使數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確)。除第2孔加入稀釋菌液160μl外，3-9各孔均加入100μl，繼于第2孔加入抗菌肽原液(濃度1280μg/ml)40μl，混合后吸出100μl加入第3孔中，依次稀釋至第9孔，棄去100μl。這樣待測(cè)抗菌擬肽的終濃度分別為:取濃度為1280μg/ml的待測(cè)擬肽稀釋為如下濃度(μg/ml)：編號(hào)a2a3a4a5a6a7a8a9濃度256128643216842第10孔生長(zhǎng)對(duì)照，第11孔為陽(yáng)性對(duì)照(亞胺培南)，加160μl菌液和40μl同濃度抗生素溶液混合后棄100μl。每個(gè)抗菌肽平行做3次。于37℃培養(yǎng)16h后，用elisa酶標(biāo)儀分別測(cè)od600值，最小的od600值所對(duì)應(yīng)的最小濃度便為該抗菌肽的mic值。據(jù)此計(jì)算抗菌肽a、b分別對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、mrsa、耐單種藥鮑曼不動(dòng)桿菌、多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的mic。表2抗菌肽對(duì)不同細(xì)菌的最小抑菌濃度(mic)上表中的最小抑菌濃度值越小，則代表抗菌能力越強(qiáng)。本發(fā)明的合成抗菌肽a和b的mic比lfcinb4-9均要小，合成抗菌肽a和b的抗菌能力大大強(qiáng)于抗菌肽lfcinb4-9，但是抗菌肽b特別對(duì)耐藥細(xì)菌鮑曼不動(dòng)桿菌殺菌效果更佳。實(shí)施例4體外溶血活性檢測(cè)本實(shí)施例用于檢測(cè)合成抗菌肽對(duì)人體紅細(xì)胞是否具有溶血活性，并用固相化學(xué)法合成的抗菌肽a和抗菌肽lfcinb4-9作為對(duì)照。使用的血樣取于無(wú)菌綿羊血。溶血活性的檢測(cè)步驟是：a.將無(wú)菌綿羊血離心5min3000rpm/min，并用pbs緩沖液沖洗3次，重復(fù)離心操作，棄去上清液，保留紅細(xì)胞。b.0.1ml紅細(xì)胞液用9.9mlpbs液稀釋(紅細(xì)胞最終濃度為1％)，分別取濃度為512、256、128、64、32、16、8μg/ml的抗菌肽200μl與200μl稀釋紅細(xì)胞液混合后在37℃孵育1小時(shí)，然后在4000rpm/min離心5分鐘，取懸浮液轉(zhuǎn)移到96孔elisa板并分別在414nm波長(zhǎng)檢測(cè)懸浮液的吸光值，計(jì)算每孔的溶血率。0.01mol/l的pbs作為陰性對(duì)照，0.1％triton-x100(聚乙二醇辛基苯基醚)作為陽(yáng)性對(duì)照。溶血率(％)＝(試驗(yàn)管吸光度-陰性對(duì)照管吸光度)/(陽(yáng)性對(duì)照管吸光度-陰性對(duì)照管吸光度)×100％。c.溶血率實(shí)驗(yàn)以抗菌肽a和lfcinb4-9為對(duì)照，獨(dú)立三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。表4三種抗菌肽溶血活血檢測(cè)結(jié)果抗菌肽的溶血率值越小，則代表抗菌肽的溶血毒性越小。從表中結(jié)果可以看出抗菌肽a、b的溶血毒性都在5％以下，即使在濃度升高的情況下其溶血毒性的增加也不明顯。相比于對(duì)照天然抗菌肽溶血毒性非常低，特別是在高濃度下未有大幅度的溶血現(xiàn)象發(fā)生，是下一步成藥的重要基礎(chǔ)。<210>1<211>6<212>prt<213>人工合成<220><223>抗菌肽a<400>1arg-arg-trp-trp-arg-trp156<210>1<211>6<212>prt<213>人工合成<220><223>抗菌肽b<400>2arg-arg-trp-trp-arg-trp-β-苯乙胺156當(dāng)前第1頁(yè)12