本發(fā)明涉及一種連續(xù)接種產(chǎn)酶水解菊芋的方法，屬于生物質(zhì)水解領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前生物質(zhì)燃料存在的問(wèn)題主要為生產(chǎn)成本高導(dǎo)致的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力不強(qiáng)，僅靠政府的扶持是不能使我國(guó)的能源重心從價(jià)格較低的石化和煤炭能源上移至目前生產(chǎn)成本較高的生物制乙醇上來(lái)的，在生物質(zhì)乙醇的生產(chǎn)中，糖源成本和乙醇的分離成本是關(guān)鍵。

近年來(lái)對(duì)于菊芋水解的研究仍主要集中在新菌株的篩選和水解條件的優(yōu)化上，二者的目的都是為了減少水解過(guò)程的酶耗成本，因?yàn)樯虡I(yè)菊粉酶價(jià)格高昂，并不適用于工業(yè)生產(chǎn)。但即使獲得了高產(chǎn)酶活力的菌株，其培養(yǎng)產(chǎn)酶周期仍然很長(zhǎng)，至少在72h以上，若要獲得更高的酶活，酵母需要在培養(yǎng)液里培養(yǎng)100h以上。粗酶液需要在4℃的低溫下才能長(zhǎng)期保持活力，大量的液體培養(yǎng)基占用可觀的制冷空間，也是能耗。如果對(duì)菊粉酶進(jìn)行提取和純化，其步驟復(fù)雜，又耗時(shí)耗力。水解條件的優(yōu)化可以提高菊粉的水解效率，但是價(jià)格高昂的菊粉酶仍然不能夠回收再利用，酶耗成本的下降空間并不大。([1]sarchami,t.andl.rehmann.optimizingenzymatichydrolysisofinulinfromjerusalemartichoketubersforfermentativebutanolproduction[j],biomassandbioenergy,2014,69(0):175-182.)([2]wang,l.,etal.jerusalemartichokepowder:ausefulmaterialinproducinghigh-optical-purityl-lactateusinganefficientsugar-utilizingthermophilicbacilluscoagulansstrain[j],bioresourcetechnology,2013,130(0):174-180.)([3]liu,x.-y.,etal.inulinhydrolysisandcitricacidproductionfrominulinusingthesurface-engineeredyarrowialipolyticadisplayinginulinase[j],metabolicengineering,2010,12(5):469-476.)([4]sirisansaneeyakul,s.,etal.productionoffructosefrominulinusingmixedinulinasesfromaspergillusnigerandcandidaguilliermondii[j],worldjournalofmicrobiology&biotechnology,2007,23(4):543-552.)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)因?yàn)樯虡I(yè)菊粉酶價(jià)格高昂無(wú)法工業(yè)生

產(chǎn)，以及使用菊粉酶培養(yǎng)產(chǎn)酶周期時(shí)間長(zhǎng)、而且需要消耗培養(yǎng)基的問(wèn)題，提供一種連續(xù)接種產(chǎn)酶水解菊芋的方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種連續(xù)接種產(chǎn)酶水解菊芋的方法，將酵母直接接種至菊芋料液中，得到混合溶液，本方法將產(chǎn)酶和水解環(huán)節(jié)耦合，能夠?qū)崿F(xiàn)快速菊芋酶解。

所述混合溶液中的水解液或料渣作為種子植入新一批次的菊芋料液中進(jìn)行第二批次產(chǎn)酶水解耦合；重復(fù)此過(guò)程，即再取第二批次的水解液/料渣做為種子植入下一批次的菊芋料液中進(jìn)行第三批次的耦合過(guò)程，實(shí)現(xiàn)連續(xù)接種的多批次產(chǎn)酶水解耦合工藝。

所述酵母為該酵母發(fā)酵后產(chǎn)生的酶能夠?qū)沼筮M(jìn)行水解的酵母；

所述酵母包括克魯維酵母；

所述菊芋料液的制備方法為將菊芋粉末溶解在水中。

當(dāng)酵母處于對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期的，取混合溶液中的固態(tài)物質(zhì)(料渣)直接接種至新的待水解的菊芋料液中，即可繼續(xù)對(duì)菊芋進(jìn)行水解。

所述對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期為酵母接種至菊芋料液中12-28h時(shí)。

固態(tài)物質(zhì)的最佳接種量為1-10％(v/v)。

菊芋料液中菊芋粉末的質(zhì)量濃度為5％～40％。

有益效果

1、一種連續(xù)接種產(chǎn)酶水解菊芋的方法，將可發(fā)酵糖的生產(chǎn)時(shí)長(zhǎng)縮短至24h，并能夠獲得高于86％的水解率。

2、通過(guò)對(duì)體系中的總糖濃度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在耦合過(guò)程中并未觀察到總糖濃度的明顯降低，可見(jiàn)酵母并未消耗大量的還原糖。

3、在水解過(guò)程中不斷有新的生菊粉酶被分泌出來(lái)參與水解，補(bǔ)充了菊粉酶失活的不足。

4、酵母使用量很少，且沒(méi)有添加任何培養(yǎng)基。

附圖說(shuō)明

圖1為菊芋酶解的cbp過(guò)程；

圖2為不同接種量時(shí)(圖a，b，c，d分別對(duì)應(yīng)接種量2％，4％，6％，8％)接種方式對(duì)產(chǎn)酶水解耦合工藝的影響；

圖3為不同果糖添加量下的產(chǎn)物抑制曲線；

圖4為連續(xù)接種耦合工藝的穩(wěn)定性考察。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

克魯維酵母在純菊芋提取物中的培養(yǎng)：取一環(huán)保存在yepd平板培養(yǎng)基上的克魯維酵母，接種至裝有100ml滅菌冷卻后的2wt％菊芋提取物的250ml錐形瓶中，在30℃下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm。每隔一段時(shí)間取出3ml培養(yǎng)液，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600nm下進(jìn)行od600的測(cè)定，測(cè)定所采用的空白樣為未進(jìn)行克魯維酵母培養(yǎng)的菊芋提取物溶液。

克魯維酵母產(chǎn)酶及菊芋酶解過(guò)程的耦合(cbp)：取一環(huán)保存在yepd平板培養(yǎng)基上的克魯維酵母，直接接種至裝有100ml10wt％菊芋料液的250ml容器中。在30℃下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm。此步稱為對(duì)產(chǎn)酶、水解環(huán)節(jié)的第一次整合生物工藝(thefirstconsolidatedbioprocessing，cbp)。每隔一定時(shí)間取樣，離心后測(cè)定上清液的還原糖，總糖，菊粉酶活力。離心條件：8000rpm，5min。

圖1所示，在耦合過(guò)程的前10個(gè)小時(shí)，因?yàn)轶w系中菊粉酶的含量較低，無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定，但是從菊粉酶酶活測(cè)量曲線可以看到，克魯維酵母在菊芋料液中培養(yǎng)時(shí)能夠快速的產(chǎn)酶，并且在培養(yǎng)后期仍呈現(xiàn)出一個(gè)快速的上升趨勢(shì)，在整個(gè)耦合工藝過(guò)程中，克魯維酵母保持著良好的產(chǎn)酶能力，使得體系中不斷有高活力的菊粉酶被生產(chǎn)出來(lái)，參與到水解反應(yīng)中去，從體系的還原糖變化曲線也可以得到相同的結(jié)果，耦合過(guò)程中還原濃度不斷增加，并維持增高趨勢(shì)直至24h后達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定期，此時(shí)的菊粉水解率已達(dá)到91.2％。通過(guò)對(duì)體系中的總糖濃度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在耦合工藝過(guò)程中并未觀察到總糖濃度的明顯降低，證明克魯維酵母并未消耗大量的還原糖。

實(shí)施例2

取實(shí)施例1cbp過(guò)程中的水解液直接接入新的一批10wt％菊芋料液中，置于30℃下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm。

取實(shí)施例1cbp過(guò)程中的水解液，在無(wú)菌條件下8000rpm離心5min后，將沉淀物(即料渣)接入新的一批10wt％菊芋料液中，置于30℃下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm。

圖2呈現(xiàn)了不同接種量下固、液兩種接種方式對(duì)連續(xù)耦合工藝過(guò)程菊粉水解率的影響。當(dāng)接種量為2％(v/v)時(shí)，如圖2(a)所示，在水解初期，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果相似，采用液態(tài)接種法的水解體系中菊粉水解率要高于采用固態(tài)接種法的水解體系，但隨著耦合工藝的進(jìn)行，固態(tài)接種法的水解率逐漸趕上了液態(tài)接種法，最終達(dá)到相近的結(jié)果。當(dāng)接種量為4％，6％，8％(v/v)時(shí)，菊粉水解率與預(yù)測(cè)結(jié)果截然相反。如圖2(b)所示，在反應(yīng)的前14h，液態(tài)接種方式的水解速率略高于固態(tài)接種，但在14h后出現(xiàn)了反轉(zhuǎn)，固態(tài)接種體系中的菊粉水解率超過(guò)了液態(tài)接種，優(yōu)勢(shì)逐漸擴(kuò)大并最終將優(yōu)勢(shì)保持到了反應(yīng)結(jié)束。在接種量為6％的時(shí)候，觀察到了同樣的結(jié)果(如圖2c)。在反應(yīng)的前12h，液態(tài)接種體系中的菊粉水解率要高于固態(tài)接種，12h時(shí)兩個(gè)體系里菊粉水解率達(dá)到相同的高度，而后固態(tài)接種的水解優(yōu)勢(shì)逐漸體現(xiàn)并維持到反應(yīng)結(jié)束。

如圖3所示，果糖的添加對(duì)菊粉酶解產(chǎn)生了產(chǎn)物抑制作用，當(dāng)添加量為2％時(shí)，抑制并不明顯，但當(dāng)果糖添加量達(dá)到10％時(shí)，觀察到了明顯的果糖抑制，水解速率和最終的水解率均下降，表明產(chǎn)物抑制程度隨著果糖的添加量增大而增強(qiáng)。則說(shuō)明果糖濃度越高，菊粉酶的活力越弱。

圖4所示，采用固態(tài)接種法和接種量6％(v/v)進(jìn)行了連續(xù)接種耦合工藝，對(duì)每一批次料液在24h的水解率進(jìn)行計(jì)算?？梢钥吹剑谶B續(xù)進(jìn)行了5個(gè)批次的水解后，每批次的水解率仍能夠維持在86％以上。

表1本發(fā)明結(jié)果與背景技術(shù)的文獻(xiàn)中水解結(jié)果的對(duì)比

表1為本發(fā)明結(jié)果與背景技術(shù)的文獻(xiàn)中水解結(jié)果的對(duì)比。從表中可以看出，在底物相同的時(shí)候，文獻(xiàn)[2]中得糖率只有60％，本發(fā)明可以達(dá)到80％以上，并且文獻(xiàn)中使用為價(jià)格高昂的商業(yè)酶。此外，與多數(shù)文獻(xiàn)相比，本發(fā)明所用底物為較難水解的菊芋原料，水解溫度也更溫和，能源消耗小，最為明顯的優(yōu)勢(shì)是本發(fā)明將產(chǎn)酶和水解工藝進(jìn)行了耦合，將還原糖的生產(chǎn)周期縮短至24h，節(jié)約了時(shí)間成本。