本發(fā)明涉及一種含有病毒性出血敗血癥病毒(vhsv)n基因的病毒樣顆粒的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

病毒性出血敗血癥(viralhemorrhagicsepticemiaofsalmonids，vhsv)又稱鱒魚腹水病、新鱒魚病等。病原是一種彈狀病毒，能引起魚類急性或慢性內(nèi)臟性疾病，死亡率非常高。

病毒性出血敗血癥在歐洲流行已久，法國、意大利、瑞士、挪威、瑞典、波蘭等歐洲國家均有正式報(bào)導(dǎo)。近年來，該病已蔓延至在北美洲、大洋洲、東南亞等區(qū)域。

vhsv主要感染鱒魚及其他鮭科魚類，對其他養(yǎng)殖類非鮭科魚苗也有影響。通常當(dāng)水溫降至10℃附近時(shí)，魚群中會(huì)發(fā)病。出血性敗血癥的主要病理變化為組織器官的出血和變性壞死。肝、腎是靶器官，細(xì)胞出現(xiàn)空泡化或固縮化。

目前，vhsv檢測的常用方法有rt-pcr技術(shù)和熒光定量rt-pcr技術(shù)，為了保證檢測的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)中必須設(shè)立陽性對照或質(zhì)控品。通常使用病毒培養(yǎng)物或是由rna逆轉(zhuǎn)錄得到的cdna做標(biāo)準(zhǔn)品，但是前者存在生物安全的隱患且易被核糖核酸酶降解，后者不能體現(xiàn)核酸提取過程和反轉(zhuǎn)錄對試驗(yàn)的影響。本發(fā)明采用armoredrna技術(shù)，構(gòu)建包裹甲肝病毒基因的假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品，此假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品能夠避免核糖核酸酶對rna的降解，作為質(zhì)控品可以對從核酸提取至rt-pcr檢測的全過程進(jìn)行有效的監(jiān)控。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：構(gòu)建包裹病毒性出血敗血癥病毒(vhsv)n基因的假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品，此假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品能夠避免核糖核酸酶對rna的降解，作為質(zhì)控品可以對從核酸提取至rt-pcr檢測的全過程進(jìn)行有效的監(jiān)控。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，將編碼組氨酸標(biāo)簽序列插入ms2噬菌體編碼外殼蛋白的β發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)序列中，構(gòu)建含有重組組氨酸標(biāo)簽的ms2噬菌體外殼蛋白和表達(dá)成熟酶蛋白基因的pnh-ms2his重組質(zhì)粒。并通過rt-rcr技術(shù)擴(kuò)增vhsvn基因，將其克隆于pnh-ms2his中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pnh-ms2his-vhsv-n。并將其轉(zhuǎn)化于表達(dá)大腸桿菌bl21(de3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，表達(dá)的重組蛋白能夠自主裝配形成vlps，而且其中包裹有vhsvn基因的rna片段，并且該rna片段具有良好的穩(wěn)定性，可以作為rna病毒檢測時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品用于臨床及樣品檢測。

本發(fā)明設(shè)計(jì)了一組擴(kuò)增vhsv上的n基因引物，序列如下：

vhsv-nf1：5’-caagcttgcatgcctgcaggtcgac-3’；

vhsv-nr1：5’-gcggccgctctagagattgtgttta-3’；

5‘端和3’端分別加上hindiii和noti酶切位點(diǎn)。

本發(fā)明還提供一種pnh-ms2his重組質(zhì)粒，pnh-ms2his重組質(zhì)粒中插入的的vhsvn基因片段序列如下：

agcgttttcaggcctgaatgattgttaggatcgaccccaccggtggagagggacgggtacttgtacctggtgaagtggaactcatcgtgtatgttggtggatttggtaaggaagataggaaggtgattgtggatgcactctccgcactcgggggaccccagactgtgcaggcgttttccgtgcttctctcctatgtactccaagggaatacacaggaggacctagaaacaaagtgcaaggtcctcacagacatgggcttcaaggtgacacaggcagccagggctacgagcatcgaggcaggaatcatgatgcccatgagagaactggccctgactgtcaatgacgacaacctcatggaaatcgtgaaggggaccttgatgacatgctcccttctgaccaagtactcggtggacaagatgatcaagtacatcaccaagaaactcggggagctggcagacactcagggagttggggaactgcagcacttcaccgctgacaaggcagccatcaggaaactcgcagggtgtgtgcgtcccgggcagaagatcaccaaggccctctatgcattcatcctgaccgagatcgcagaccccaccacccagtcgagggcccgagccatgggggcgttgaggctcaacgggacaggaatgaccatgattgggctgttcacccaggccgccaacaacttgggcattgccccggcaaagctgctggaggacctctgcatggagtccctggttgagtcagccagacggatcatccagttgatgagacaggtgtcagaggcgaagtccatccaagagcgctacgccatcatgatgagtcggatgctgggagagtcctactacaagtcgtatggactcaatgacaactccaagatctcttacattctgtcacagatcagtgggaagtacgcagtggactccctggaaggcctggaggggatcaaggtgacagagaagttccgcgagttcgctgagcttgttgcagaagtcctggtggacaagtacgagaggattggagaggacagcacggaggtctcagatgtcatcagggaggcggccagacagcacgcgcgcaggacatccgccaagccagagccaaaggcccgcaacttcaggagctccaccggaagggggaaggagcaggagacgggggggtccgatgatgacgact。

本發(fā)明還提供一種制備含有vhsvn基因的vhsv病毒樣顆粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法，包括下列步驟：

(1)含有組氨酸標(biāo)簽的vlps重組質(zhì)粒pet-nh-ms2his的構(gòu)建

將pet32a質(zhì)粒使用xbai和ncoi消化，去除其中的xbai和ncoi兩個(gè)酶切位點(diǎn)間的序列，將人工合成的5’-po4-ctagattacaaggc-3’和5’-po4-catggccttgtaat-3’兩條互補(bǔ)的寡核苷酸復(fù)性后插入其中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pet-nh，測序鑒定；

采用一步法擴(kuò)增試劑盒以ms2pf1和ms2pr1為引物，以ms2rna為模板擴(kuò)增ms2目的片段；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收目的片段，用50μlddh2o洗脫，標(biāo)記為ms2dna；

采用onesteprt-pcr，以得到的ms2dna為模板，分別用引物ms2pf1和ms2hispr以及ms2hispf和ms2pr1擴(kuò)增ms2上和ms2下2個(gè)dna片段；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收試劑盒回收后，存于4℃?zhèn)溆?；再?個(gè)片段的混合物為模板，以ms2pf1和ms2pr1為引物做pcr，得到引入了編碼組氨酸標(biāo)簽序列的ms2dna，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后的pcr產(chǎn)物命名為ms2his；

分別將制備的pet-nh載體和回收的ms2his片段用限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和hindiii進(jìn)行酶切消化；將雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收試劑盒回收后與pet-nh載體用solutionⅰ連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落作進(jìn)行酶切鑒定；從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至5ml的含有amp抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提??；以提取的質(zhì)粒為模板，以ms2pf和ms2pr為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；將pcr產(chǎn)物于1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測；若可見載體與1700bp的ms2目的片段即為陽性。

(2)構(gòu)建含有vhsvn基因的原核表達(dá)載體pnh-ms2his-vhsv-n

按rna提取試劑盒說明書的方法提取vhsv總rna為模版，以vhsv-nf1和vhsv-nr1為引物，擴(kuò)增vhsvn基因，rt-pcr體系為：5×rt-pcrbuffer5μl，dntpmix1μl，enzymemix1μl，引物vhsv-nf1和vhsv-nr1各1μl，rna模板5μl，ddh2o補(bǔ)足25μl，反應(yīng)條件為，50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃滅火變性10min，然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物1.0％瓊脂糖凝膠電泳，可見1270bp條帶，寶生物凝膠回收試劑盒回收vhsvn基因片段。

hindiii和notⅰ雙酶切pnh-ms2his和vhsvn基因片段，膠回收試劑盒回收酶切的pnh-ms2his和vhsvn基因片段，回收產(chǎn)物16℃連接過夜；連接體系為載體pnh-ms2his和vhsvn基因片段分別為2μl和6μl，t4dna連接酶1μl，10×t4連接酶buffer1μl；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞，將涂板后獲得的重組克隆進(jìn)行pcr鑒定；將陽性克隆菌種送測序，鑒定為陽性的重組載體命名為pnh-ms2his-vhsv-n。

(3)誘導(dǎo)及純化重組pnh-ms2his-vhsv-n質(zhì)粒

將測序正確的pnh-ms2his-vhsv-n質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株bl21(de3)，將陽性克隆菌株接種于氨芐抗性的lb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至od600＝0.6，加入iptg至終濃度為1mmol/l，誘導(dǎo)表達(dá)6h；離心收集菌體；菌體中加入裂解緩沖液重懸，于冰上放置30min，離心去除菌體碎片，將上清加入預(yù)裝有ni-nta的純化柱中，使液體自然流出，加入3倍柱體積的洗滌緩沖液洗滌2次，然后加入洗脫緩沖液將病毒樣顆粒洗脫，命名為vhsv-n-vlps。

為了檢測vhsv，針對vhsv的n基因，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種鑒定引物和探針，序列如下：

正向引物vhsvp1：5’-aaa-ctc-gca-gga-tgt-gtg-cgt-cc-3’

反向引物vhsvp2：5’-tct-gcg-atc-tca-gtc-agg-atg-aa-3’

探針vhsvprobe：5’-fam-tag-agg-gcc-ttg-gtgatc-ttc-tg-tamra-3’

本發(fā)明中涉及的ms2及其相應(yīng)的引物都是本領(lǐng)域公知的，并且已經(jīng)商業(yè)化的生物材料。

本發(fā)明的有益效果為：

(1)高效便利：按照本發(fā)明方法能夠高效、便利的得到含有vhsvn基因的病毒樣顆粒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；(2)安全：由于病毒樣顆粒不具備在復(fù)制增殖的能力和傳染性，因此不會(huì)具有散毒的風(fēng)險(xiǎn)；(3)病毒樣顆粒具備病毒的結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)行核酸提取，因此可以對rna病毒檢測的全過程進(jìn)行監(jiān)控，避免了由于核酸抽提過程出現(xiàn)的假陰性風(fēng)險(xiǎn)；(4)病毒樣顆粒具有耐rnase的優(yōu)點(diǎn)，解決了rna標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性的問題；(5)該病毒樣顆粒在表面人工引入了組氨酸標(biāo)簽，可經(jīng)過親和層系進(jìn)行純化，方便大規(guī)模推廣應(yīng)用。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1.vhsvn基因片段電泳圖。m:dnamarkerdl2000；1:rt-pcr產(chǎn)物；2:陰性對照；markerdl2000的堿基對大小依次是2000、1000、750、500、250和100。

圖2.vhsv-n-vlps提取rna鑒定電泳圖。m:dnamarkerdl2000；1:rt-pcr產(chǎn)物；2:陰性對照；markerdl2000的堿基對大小依次是2000、1000、750、500、250和100。

圖3不同保存溫度vhsv-n-vlps的穩(wěn)定性測試；a.4℃下保存檢測b-20℃下保存檢測。

圖4是vhsv-n-vlpsdna熒光定量pcr檢測。起峰的是pnh-ms2his-vhsv-n的質(zhì)粒，其余的是vhsv-n-vlps的rna、vhsv-n-vlps和h2o。

圖5是vhsv-n-vlpsrna熒光定量rt-pcr檢測。起峰的是提取的vhsv-n-vlps的rna，其余的是hav5’-utr-vlps和h2o。

圖6虹鱒魚的vhsv的rna檢測。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1制備vhsv-n-vlps

含有vhsv-n基因的病毒樣顆粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：

(1)含有組氨酸標(biāo)簽的vlps重組質(zhì)粒pet-nh-ms2his的構(gòu)建

將pet32a質(zhì)粒使用xbai和ncoi消化，去除其中的xbai和ncoi兩個(gè)酶切位點(diǎn)間的序列，將人工合成的5’-po4-ctagattacaaggc-3’和5’-po4-catggccttgtaat-3’兩條互補(bǔ)的寡核苷酸復(fù)性后插入其中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pet-nh，測序鑒定。

采用一步法擴(kuò)增試劑盒以ms2pf1和ms2pr1為引物，以ms2rna為模板擴(kuò)增ms2目的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒(takara)回收目的片段，用50μlddh2o洗脫，標(biāo)記為ms2dna。

采用onesteprt-pcr，以得到的ms2dna為模板，分別用引物ms2pf1和ms2hispr以及ms2hispf和ms2pr1擴(kuò)增ms2上和ms2下2個(gè)dna片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收試劑盒回收后，存于4℃?zhèn)溆?。再?個(gè)片段的混合物為模板，以ms2pf1/ms2pr1為引物做pcr，得到引入了編碼組氨酸標(biāo)簽序列的ms2dna，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后的pcr產(chǎn)物命名為ms2his。

分別將制備的pet-nh載體和回收的ms2his片段用限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和hindiii進(jìn)行酶切消化。將雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收試劑盒回收后與pet-nh載體用solutionⅰ連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落作進(jìn)行酶切鑒定。從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至5ml的含有amp抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取。以提取的質(zhì)粒為模板，以ms2pf和ms2pr為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。將pcr產(chǎn)物于1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。若可見載體與1700bp的ms2目的片段即為陽性。

(2)構(gòu)建原核表達(dá)載體pnh-ms2his-vhsv-n

(2)構(gòu)建含有vhsvn基因的原核表達(dá)載體pnh-ms2his-vhsv-n

按rna提取試劑盒說明書的方法提取vhsv總rna為模版，以vhsv-nf1和vhsv-nr1為引物，擴(kuò)增vhsvn基因，rt-pcr體系為：5×rt-pcrbuffer5μl，dntpmix1μl，enzymemix1μl，引物vhsv-nf1和vhsv-nr1各1μl，rna模板5μl，ddh2o補(bǔ)足25μl，反應(yīng)條件為，50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃滅火變性10min，然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物1.0％瓊脂糖凝膠電泳，可見1270bp條帶，見圖1，寶生物凝膠回收試劑盒回收vhsvn基因片段。

hindiii和notⅰ雙酶切pnh-ms2his和vhsvn基因片段，膠回收試劑盒回收酶切的pnh-ms2his和vhsvn基因片段，回收產(chǎn)物16℃連接過夜；連接體系為載體pnh-ms2his和vhsvn基因片段分別為2μl和6μl，t4dna連接酶1μl，10×t4連接酶buffer1μl；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞，將涂板后獲得的重組克隆進(jìn)行pcr鑒定；將陽性克隆菌種送測序，鑒定為陽性的重組載體命名為pnh-ms2his-vhsv-n。

(3)誘導(dǎo)及純化重組pnh-ms2his-vhsv-n質(zhì)粒

將測序正確的pnh-ms2his-vhsv-n質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株bl21(de3)，將陽性克隆菌株接種于氨芐抗性的lb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至od600＝0.6，加入iptg至終濃度為1mmol/l，誘導(dǎo)表達(dá)6h；離心收集菌體；菌體中加入裂解緩沖液重懸，于冰上放置30min，離心去除菌體碎片，將上清加入預(yù)裝有ni-nta的純化柱中，使液體自然流出，加入3倍柱體積的洗滌緩沖液洗滌2次，然后加入洗脫緩沖液將病毒樣顆粒洗脫，命名為vhsv-n-vlps。

實(shí)施例2vhsv-n-vlps的特性檢測

對含有vhsvn基因的病毒樣顆粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性檢測，步驟如下：

(1)vhsv-n-vlps中rna的提取及rt-pcr檢測

將純化的病毒樣顆粒溶液100μl提取rna作為模板，按照權(quán)力4中vhsvn的引物序列進(jìn)行rt-pcr檢測，rt-pcr體系為：5×rt-pcrbuffer5μl，dntpmix1μl，enzymemix1μl，引物vhsv-f和vhsv-r各1μl，rna模板5μl，ddh2o補(bǔ)足25μl，反應(yīng)條件為，50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃滅火變性10min，然后95℃1min，59℃1.5min，72℃1min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測1247bp，見圖2，送測序。

(2)vhsv-n-vlps耐rnasea的檢測

取2份50μl經(jīng)ni-nta的純化的表達(dá)產(chǎn)物：第一份加100urnasea，第二份不加酶，37℃保溫1h后，提取核酸作為模板，使用熒光定量rt-pcr進(jìn)行檢測，每份重復(fù)3次，記錄ct值，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示無顯著差異。結(jié)果表明：vhsv-n-vlps耐酶性良好，純化得到了含有vhsvn基因的vlps。

(3)vhsv-n-vlps穩(wěn)定性檢測

將純化的病毒樣顆粒分別放置在4℃、-20℃放置1個(gè)月，期間每5天進(jìn)行一次熒光定量rt-pcr檢測，記錄ct值。結(jié)果顯示，在1個(gè)月保存期內(nèi)，病毒樣顆粒的濃度沒有明顯的變化，在不同的溫度下也沒有明顯的區(qū)別，結(jié)果表明，制備的vhsv-n-vlps的穩(wěn)定性良好。

(4)vhsv-n-vlps的dna熒光定量pcr檢測

分別以vhsv-n-vlps、vhsv-n-vlps提取的rna、pnh-ms2his-vhsv-n病毒樣顆粒原核表達(dá)質(zhì)粒以及h2o為模板，按照vhsvn的引物和探針進(jìn)行熒光pcr檢測，只有pnh-ms2his-vhsv-n病毒樣顆粒原核表達(dá)質(zhì)粒有擴(kuò)增信號，結(jié)果表明vhsv-n-vlps構(gòu)建成功，純化得到的vhsv-n-vlps檢測不到dna，能夠排除dna的干擾。結(jié)果見圖4。

(5)病毒樣顆粒rna熒光定量rt-pcr檢測

分別以vhsv-n-vlps提取的rna、hav5’-utr-vlps、h2o為模板，按照vhsvn的引物和探針進(jìn)行rt-pcr檢測，可以看到vhsv-n-vlps提取的rna有擴(kuò)增信號，未提取rna的vhsv-n-vlps沒有信號。結(jié)果表明，成功包裹了vhsv-n-vlps，見圖5。

實(shí)例3.檢測虹鱒體內(nèi)感染vhsv的應(yīng)用

以vhsv-n-vlps作為質(zhì)控樣品，檢測檢測虹鱒體內(nèi)感染vhsvrna，步驟如下。

1、病毒的分離

取活虹鱒魚的腦、脾、腎。將樣品按照常規(guī)方法勻漿后，用含有10倍抗生素的培養(yǎng)液按1:10稀釋懸液，于4℃過夜或者于室溫下孵育1h以釋放病毒。12000rpm離心15min，收集上清液。稀釋10倍和100倍，接種bf-2細(xì)胞。15℃(最高不高過18℃)培養(yǎng)3天。收集懸液，凍融一次后供檢測鑒定用。

2、rna的抽提

采用rna提取試劑盒提取rna。

3、引物探針

正向引物vhsvp1：5’-aaa-ctc-gca-gga-tgt-gtg-cgt-cc-3’

反向引物vhsvp2：5’-tct-gcg-atc-tca-gtc-agg-atg-aa-3’

探針vhsvprobe：5’-fam-tag-agg-gcc-ttg-gtgatc-ttc-tg-tamra-3’

4、熒光rt-pcr反應(yīng)體系

預(yù)混液組裝(在冰上進(jìn)行)

5、反應(yīng)條件

擴(kuò)增結(jié)果

分別以1份虹鱒魚病毒分離懸液提取rna、h2o、vhsv-n-vlps提取rna做熒光rt-pcr檢測，按照vhsv-n的引物和探針序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示只有vhsv-n-vlps提取rna起峰，說明hav5’-utr-vlps能夠起到陽性質(zhì)控的作用，結(jié)果見圖6。

核苷酸序列表

<110>山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心

<120>vhsv病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<221>primer_bind

caagcttgcatgcctgcaggtcgac25

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<221>primer_bind

gcggccgctctagagattgtgttta25

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

agcgttttcaggcctgaatgattgttaggatcgaccccaccggtggagagggacgggtacttgtacctggtgaagtggaactcatcgtgtatgttggtggatttggtaaggaagataggaaggtgattgtggatgcactctccgcactcgggggaccccagactgtgcaggcgttttccgtgcttctctcctatgtactccaagggaatacacaggaggacctagaaacaaagtgcaaggtcctcacagacatgggcttcaaggtgacacaggcagccagggctacgagcatcgaggcaggaatcatgatgcccatgagagaactggccctgactgtcaatgacgacaacctcatggaaatcgtgaaggggaccttgatgacatgctcccttctgaccaagtactcggtggacaagatgatcaagtacatcaccaagaaactcggggagctggcagacactcagggagttggggaactgcagcacttcaccgctgacaaggcagccatcaggaaactcgcagggtgtgtgcgtcccgggcagaagatcaccaaggccctctatgcattcatcctgaccgagatcgcagaccccaccacccagtcgagggcccgagccatgggggcgttgaggctcaacgggacaggaatgaccatgattgggctgttcacccaggccgccaacaacttgggcattgccccggcaaagctgctggaggacctctgcatggagtccctggttgagtcagccagacggatcatccagttgatgagacaggtgtcagaggcgaagtccatccaagagcgctacgccatcatgatgagtcggatgctgggagagtcctactacaagtcgtatggactcaatgacaactccaagatctcttacattctgtcacagatcagtgggaagtacgcagtggactccctggaaggcctggaggggatcaaggtgacagagaagttccgcgagttcgctgagcttgttgcagaagtcctggtggacaagtacgagaggattggagaggacagcacggaggtctcagatgtcatcagggaggcggccagacagcacgcgcgcaggacatccgccaagccagagccaaaggcccgcaacttcaggagctccaccggaagggggaaggagcaggagacgggggggtccgatgatgacgact1176

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<221>primer_bind

aaactcgcaggatgtgtgcgtcc23

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<221>primer_bind

tctgcgatctcagtcaggatgaa23

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<221>primer_bind

tagagggccttggtgatcttctg23