一株植物內(nèi)生真菌的制作方法

文檔序號(hào)：11400519閱讀：456來源：國(guó)知局

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本發(fā)明涉及一株能防治植物寄生線蟲的水生植物內(nèi)生真菌菌株，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植物寄生線蟲是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，僅根結(jié)線蟲已知種類就達(dá)70多種，為害3000多種植物，每年造成巨大的損失。我國(guó)植物寄生線蟲主要危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋參等經(jīng)濟(jì)作物，造成的損失十分驚人。據(jù)全國(guó)煙草病蟲害防治信息中心不完全統(tǒng)計(jì)，2000年全國(guó)僅煙草根結(jié)線蟲發(fā)病面積已達(dá)50萬公頃，直接經(jīng)濟(jì)損失5億多元。僅云南省發(fā)病面積就達(dá)2.7萬公頃，直接經(jīng)濟(jì)損失約1億元，間接損失更為嚴(yán)重。黑龍江省僅大豆胞囊線蟲每年造成的損失達(dá)8億元之多。松材線蟲被稱為無煙森林火災(zāi)，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺(tái)灣、香港等部份地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，有向全國(guó)漫延的趨勢(shì)。在山東、廣東、海南和云南等蔬菜主產(chǎn)區(qū)，蔬菜根結(jié)線蟲呈上升趨勢(shì)。貴州省西洋參因嚴(yán)重發(fā)生根結(jié)線蟲而只好停產(chǎn)。更嚴(yán)重的是由于根結(jié)線蟲侵染后造成作物傷口，致使作物根部病害嚴(yán)重發(fā)生。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，線蟲病害使我國(guó)各種作物年平均產(chǎn)量損失達(dá)10-15％，全球每年因線蟲造成的損失達(dá)1000億美元（weischer,1994）。

目前線蟲的防治主要依靠化學(xué)殺線蟲劑，但化學(xué)殺線蟲劑多為滅生性巨毒農(nóng)藥，不僅產(chǎn)生抗藥性，更造成環(huán)境污染，危害人體健康。相繼有不少被禁用或即將禁用。美國(guó)溴甲烷于2000年、二溴甲烷于2005年分別停止使用。目前生產(chǎn)上大量使用的鐵滅克雖然對(duì)線蟲有很好的防效，但毒性高，破壞土壤微生物區(qū)系?；瘜W(xué)殺線蟲劑在防治線蟲危害，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的同時(shí)，給人類健康和環(huán)境帶來了嚴(yán)重的負(fù)面影響。由于農(nóng)藥殘留超標(biāo)，我國(guó)對(duì)外出口的茶葉、三七、鴨梨、哈密瓜、果汁、花卉、蜂蜜及多種畜禽產(chǎn)品屢屢發(fā)生商品退賠事件，直接影響農(nóng)產(chǎn)品出口。同時(shí)目前國(guó)內(nèi)使用的化學(xué)殺線蟲劑主要為國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格過于昂貴。因此，研制開發(fā)線蟲生防制劑顯得尤為重要。

線蟲生防制劑早在上個(gè)世紀(jì)70年代就已上市。但經(jīng)過幾十年的發(fā)展，到今天其使用和推廣仍不廣泛，包括中國(guó)在內(nèi)的很多國(guó)家仍未使用。許多在室內(nèi)試驗(yàn)中對(duì)線蟲表現(xiàn)出很強(qiáng)侵染能力的菌株在實(shí)際應(yīng)用中的效果不理想。在田間試驗(yàn)中，生防菌的防治效果會(huì)受各種因素的影響。土壤環(huán)境(有機(jī)質(zhì)含量、濕度、溫度等)對(duì)生防菌劑在土壤中的存活、定殖、擴(kuò)散等有重要的影響。此外，土壤中殘留的化學(xué)農(nóng)藥，土壤中存在的一些金屬離子都會(huì)影響生防菌劑在土壤中的存活、定殖以及對(duì)線蟲的防治效果。

生防菌株是研究生防菌劑的一個(gè)重要前提。不同菌株的生物學(xué)特性，對(duì)線蟲的防治效果差異較大。自然界中，線蟲的天敵是很多的，主要有：真菌、細(xì)菌、螨、捕食性線蟲等。其中最多的是真菌，目前研究最多且成為產(chǎn)品上市的也主要是真菌。根據(jù)其侵染線蟲的特性主要分為：

1、捕食菌物：通過營(yíng)養(yǎng)菌絲特化形成的捕食器捕捉線蟲；

2、寄生菌物：通過寄生線蟲的卵、雌蟲、胞囊等的菌物；

3、產(chǎn)毒菌物：能夠產(chǎn)生毒素毒殺線蟲的菌物。

目前成為產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)的主要是食線蟲菌物，包括捕食菌物和寄生菌物。迄今國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的的食線蟲菌物約有400種，其中捕食線蟲菌物約有12個(gè)屬，常見的有輪蟲霉屬、節(jié)叢孢屬、單頂孢屬和隔孢屬等。內(nèi)寄生線蟲菌物有關(guān)屬約有13個(gè)，常見的有毒蟲霉屬、鉤絲孢屬和被毛孢等。機(jī)會(huì)菌物約200種，確定的屬大約有71個(gè)，研究較多的的有節(jié)叢孢屬、隔指孢屬、綠僵菌屬、擬青霉屬、普可尼亞屬和木霉屬等。產(chǎn)毒菌物主要有絲霉屬和側(cè)耳屬。迄今為止，能殺滅植物寄生線蟲的水生黑曲霉菌株還未見文獻(xiàn)報(bào)到。

微生物菌株對(duì)植物寄生線蟲的作用，一方面通過菌株自身生長(zhǎng)對(duì)線蟲直接發(fā)生作用，這就是簡(jiǎn)稱的“一代產(chǎn)品”，作用的主體是微生物菌體或細(xì)胞，沒有菌體或細(xì)胞的參與，就不表現(xiàn)出微生物對(duì)線蟲的抑制或殺滅作用；另一面通過菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)植物寄生線蟲發(fā)生作用，這就是簡(jiǎn)稱的“二代產(chǎn)品”，作用的主體是微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，通過代謝產(chǎn)物間接抑制或殺死線蟲。代謝產(chǎn)物具有抗環(huán)境能力強(qiáng)、使用方便、作用快速等“一代產(chǎn)品”不具備的優(yōu)勢(shì)。由黑曲霉產(chǎn)生、能作用植物寄生線蟲的代謝產(chǎn)物目前發(fā)現(xiàn)的多為草酸、檸檬酸等有機(jī)酸和曲霉毒素，而黑曲霉不產(chǎn)生曲霉毒素，通過草酸、檸檬酸對(duì)植物寄生線蟲的作用多為抑制作用，作用的對(duì)象是二齡幼蟲或蟲卵，同時(shí)對(duì)兩者起作用的黑曲霉菌株代謝產(chǎn)物較少或作用不強(qiáng)，能同時(shí)作用于線蟲的卵、幼蟲并能有效殺死線蟲的黑曲霉菌株代謝產(chǎn)物和菌株，特別是水生環(huán)境的菌株除了發(fā)明人申請(qǐng)的專利還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有生防技術(shù)菌株之不足，提供一株能殺滅植物根結(jié)線蟲的生防菌株。本發(fā)明的菌株已保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（cgmcc），地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，分類命名為：黑曲霉（aspergillusniger）e34，保藏編號(hào)為：cgmccno.11339，保藏日期為2015年9月10日。

本發(fā)明的菌株來源于自然土壤環(huán)境，其培養(yǎng)物對(duì)植物根結(jié)線蟲的殺滅作用超過60%，對(duì)植物根結(jié)線蟲的防治效果大于60%。

本發(fā)明的菌株與發(fā)明人申請(qǐng)的其它黑曲霉專利的菌株不同，屬于分類學(xué)上的同種但是不同的菌株。

本發(fā)明的特點(diǎn)：e34菌株能對(duì)線蟲的卵、幼蟲都有致死作用，其致死率優(yōu)于其它菌株。其致死成分除菌體外還有水溶性和脂溶性成分，不同于其它曲霉菌株的草酸或檸檬酸。

本發(fā)明通過以下方式實(shí)現(xiàn)：

一、菌株的獲得：

本發(fā)明的菌株按微生物土壤分離的常規(guī)普通方法進(jìn)行涂布分布，挑取單菌落，進(jìn)行純化培養(yǎng)獲得，采用的培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)，經(jīng)真菌its鑒定為aspergillusniger，定名為e34；

形態(tài)：菌絲發(fā)達(dá)，蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀,多分枝，有多核，頂囊大球形，小梗雙層。菌叢呈黑褐色。分生孢子頭球狀，直徑700～800μm，褐黑色放射狀，分生孢子梗長(zhǎng)短不一。分生孢子為球形，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙。分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌絲細(xì)胞（足細(xì)胞）上垂直生出；分生孢子頭狀如“菊花”。

二、e34菌株的培養(yǎng)：

首先，無菌收集平板上培養(yǎng)好已產(chǎn)生的孢子，將孢子接種到預(yù)先滅菌并含有玻璃珠的液體pda培養(yǎng)基中，28℃145rpm/min培養(yǎng)2-3天，視培養(yǎng)基中長(zhǎng)滿細(xì)小的菌絲球?yàn)橹箓溆?，此為液體種子。然后，將長(zhǎng)好的液體種子無菌接入預(yù)先滅菌的液體pda培養(yǎng)基中，接入量按新培養(yǎng)基裝液量的10%計(jì)算。28℃145rpm/min培養(yǎng)4-7天，線蟲生測(cè)后達(dá)到最大殺蟲效果是時(shí)，即為e34有效培養(yǎng)物。

三、e34對(duì)植物根結(jié)線蟲的防治效果測(cè)定：

取出含有大量卵囊番茄根系，用水輕輕沖洗，小心取下卵囊，放在0.5％次氯酸鈉中消毒3min，再用無菌水沖洗3次，把卵囊放在內(nèi)有少量無菌水的培養(yǎng)皿里，25℃恒溫箱中培養(yǎng)，24h后收集一次新孵化的二齡幼蟲備用。

將有效培養(yǎng)物加入32孔的培養(yǎng)板中，每孔加入100μl有效培養(yǎng)物，分別向處理和對(duì)照中各加入新孵化的根結(jié)線蟲二齡幼蟲，每孔50條。放入25℃培養(yǎng)箱中，60min、120min后調(diào)查擊倒率，12h后記錄線蟲死亡率，計(jì)算校正死亡率。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例的發(fā)明內(nèi)容法同發(fā)明內(nèi)容部分的描述。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說明。

實(shí)例一：

1.用pda平板培養(yǎng)e34菌株，待平板上長(zhǎng)出黑色孢子時(shí)，取出備用；