本發(fā)明涉及抗b型肝炎病毒核心抗原的單克隆抗體，分泌所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，以及所述單克隆抗體在b型肝炎病毒核心抗體檢測中的用途。

背景技術(shù)：

b型肝炎病毒(hepatitisvirusb，hbv)屬dna病毒，是一種嗜肝病毒，為有包膜的部分雙鏈環(huán)狀dna病毒。b型病毒性肝炎的傳染方式主要通過輸血、注射和母嬰傳播。b型肝炎病毒(hbv)感染是世界性的難題，全球范圍內(nèi)慢性感染者多達(dá)4億，發(fā)展中國家是b型肝炎的重災(zāi)區(qū)。b型肝炎通常會造成慢性感染，可進(jìn)展為肝硬化乃至肝細(xì)胞癌，對人類健康有巨大的威脅。

共價閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸(covalenflyclosedcirculardna即cccdna)是b型肝炎病毒(hbv)復(fù)制中的重要環(huán)節(jié)，是mrna和前基因組rna的合成模板，也是hbv難以治愈的關(guān)鍵因素，其長期存在與b型肝炎的慢性化以及抗病毒治療后復(fù)發(fā)有著重要關(guān)系。故做好cccdna的檢測工作對于了解患者病情變化、評估治療效果有著十分重要的意義。但肝組織內(nèi)cccdna的檢測需要做肝組織活檢，患者往往難以接受，所以尋找一種操作方便，靈敏度高的血清學(xué)標(biāo)志很有必要。

隨著對b型肝炎病毒血清標(biāo)志物研究的深入，人們認(rèn)識到了檢測血清中b型肝炎病毒核心抗體(hepatitisbcoreantibody即hbcab)在hbv感染的監(jiān)測及治療中所具有的重要臨床意義。乙肝核心抗體(hbcab)是乙肝病毒核心抗原的對應(yīng)抗體，它不是保護(hù)性抗體，它的存在反而是受到乙肝病毒侵害的指標(biāo)之一。hbcab的存在可作為乙肝傳染性活動性病變的標(biāo)志，同時有助于乙肝病情和預(yù)后的判斷。

但是，現(xiàn)有的hbcab檢測方法主要是化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法(cmia)、酶聯(lián)免疫競爭抑制一步法(elisa)和膠體金法。無論使用何種檢測方法，其檢測結(jié)果的優(yōu)劣與測定中所使用的單克隆抗體的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性密切相關(guān)。因此，為了獲得更好的hbcab檢測方法，尋找靈敏度、特異性與穩(wěn)定性俱佳的hbcag單克隆抗體成為人們一直追求的目標(biāo)。另外，由于檢測試劑、試紙條的保存條件有時并不能盡如人意，所以人們通常希望檢測試劑與試紙條在經(jīng)過惡劣的環(huán)境變化后還能保持高度的穩(wěn)定性與可信度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明制備了特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好的抗b型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體，以及分泌所述抗體的雜交瘤細(xì)胞。

本發(fā)明采用經(jīng)典的雜交瘤單克隆抗體技術(shù)。以四川邁克生物新材料技術(shù)有限公司自產(chǎn)的重組hbcag批號(150827)免疫2只balb/c小鼠，用血清篩選后選取抗體效價較好的小鼠用于細(xì)胞融合，融合后經(jīng)有限稀釋法篩選出1株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株(12e4)，該細(xì)胞株以保藏號cctccno：c201747保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。發(fā)明人繼而制備純化后的抗體，經(jīng)間接elisa檢測其效價，使用上?？迫A生物工程股份有限公司b型肝炎病毒核心抗體檢測試劑盒檢測活性，并制備成檢測試劑盒檢測臨床樣本，經(jīng)過反復(fù)凍融及熱加速處理后繼續(xù)制備成檢測試劑盒檢測臨床樣本，證實了我們制備的可分泌抗b型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體能與目的蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合，該高效價、高靈敏度、高特異性、高穩(wěn)定性的單克隆抗體能在膠體金平臺(競爭抑制法)準(zhǔn)確快速地檢測血清中hbcab。

附圖說明

圖1展示了本發(fā)明的單克隆抗體a與兩種商業(yè)化抗b型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體b與c的抗體效價檢測的結(jié)果。以log(稀釋度)作為橫坐標(biāo)，抗體od值作為縱坐標(biāo)。

圖2展示了使用本發(fā)明的抗b型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體的膠體金檢測試紙的示意圖。1-pvc底板，2-樣品墊，3-膠體金墊，4-檢測區(qū)(t線)，5-質(zhì)控區(qū)(c線)，6-吸水墊，7-包被膜。

實施方式

本文包括以下的實施例，用于以例證的方式更清楚、明確地闡述本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的公開應(yīng)當(dāng)理解，可以在所公開的特定的實施方式中進(jìn)行許多改變但是仍然獲得相似或類似的結(jié)果，而不偏離本發(fā)明的思想和范圍。本發(fā)明的具體實施方式僅用于解釋本發(fā)明，而非意圖通過任何方式限制本發(fā)明。

實施例1

雜交瘤細(xì)胞株的制備與篩選

⑴重組hbcag(四川邁克生物新材料技術(shù)有限公司，批號150827)免疫小鼠

將大腸桿菌表達(dá)的hbcag重組蛋白用生理鹽水稀釋到2.0mg/ml，與弗氏完全佐劑(sigma公司，貨號slbf-9338v)等體積混合，用1ml注射器乳化為油狀乳液，直至滴入水中的油狀乳液不分散方可停止乳化。將該乳液以150μl/只的劑量四肢腋窩皮下施給balb/c小鼠(成都達(dá)碩實驗動物中心，6周齡雌性，2只)。第一次免疫14天后增強免疫，取抗原與弗氏不完全佐劑(sigma公司，貨號slbm9367v)等體積混合后乳化，免疫劑量為75μl/只，以后每隔一周增強免疫一次。每次免疫之前采尾血，分離血清，用間接elisa法測定效價。免疫8次后，所有小鼠血清效價大于1：10⁶，即可用于融合。融合前3天，取hbcag重組蛋白用生理鹽水稀釋到2.0mg/ml，再與生理鹽水等體積混合尾靜脈追加免疫，劑量為50μl/只。

⑵雜交瘤細(xì)胞系的制備

①飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

以正常的10周齡balb/c鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞。在融合前1天，balb/c取眼血拉頸處死，0.1％新潔爾滅浸泡1分鐘，轉(zhuǎn)入75％酒精浸泡1分鐘，超凈臺內(nèi)無菌操作下用剪刀剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器腹腔注入rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液3ml，后以滴管取出，再加入7mlrpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液反復(fù)沖洗?；厥諞_洗液，1000rpm離心5分鐘留沉淀，用已加入20％新生牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2-5×10⁵個/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃、5％co2培養(yǎng)。

②免疫脾細(xì)胞的制備

小鼠追加免疫三天后，在無菌條件下取出脾臟，置于平皿中，rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗一次，剪碎、研磨、過濾后得到分散的脾細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘留沉淀離心，rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，3％乙酸稀釋計數(shù)。

③骨髓瘤細(xì)胞的制備

小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)經(jīng)8-氮鳥嘌呤篩選后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取6大瓶(75cm²)制成細(xì)胞懸液，1000rpm離心5分鐘留沉淀，用rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸、計數(shù)，按0.5-2×10⁵個/ml的細(xì)胞濃度進(jìn)行分瓶培養(yǎng)(一般情況每1-2天更換一次15-30ml完全1640培養(yǎng)基)。

④細(xì)胞融合及hat選擇培養(yǎng)雜交瘤

將骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1:5的比例混合，在50ml錐形離心管內(nèi)用rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗1次，1000rpm離心5分鐘留沉淀。將細(xì)胞混勻，緩慢加入1.2ml50％的peg4000融合，融合1分鐘后加入30ml的rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止細(xì)胞融合。700rpm/min離心5分鐘后重懸于含有1％hat與20％新生牛血清的1640培養(yǎng)基中，平均滴入20套96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。37℃，5％co2培養(yǎng)，次日補加含有1％hat與20％新生牛血清的1640培養(yǎng)基至孔滿。5天后半換培養(yǎng)基，7天后再次半換培養(yǎng)基。

⑤陽性細(xì)胞株的篩選

用0.06mph9.6碳酸緩沖溶液稀釋重組hbcag(桂康生物)至2.5μg/ml，96孔酶標(biāo)板中每孔包被100μl，用于檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清。放置于冰箱中2-8℃過夜。第二天拋棄孔中液體，elisa洗液洗板三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01mph7.2的pbs，150μl/孔，37℃封閉2小時，拍干，真空封裝待用。脾細(xì)胞融合后第九天，取細(xì)胞上清100μl于上述96孔檢測板中，37℃孵育40分鐘，elisa洗板機洗五次后加入12000倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠igg(四川新材料生物科技有限公司)100μl，37℃孵育30分鐘同上洗后，每孔加入100μl含0.1％(m/v)鄰苯二胺，0.1％(v/v)雙氧水，ph5.0檸檬酸磷酸緩沖液，37℃孵育10分鐘，每孔加入50μl2m硫酸溶液終止反應(yīng)，測450nm吸收值。以融合時小鼠血清稀釋至100倍為陽性對照，rpmi1640完全培養(yǎng)液作為陰性對照，陰性對照od值＜0.2，陽性對照od值＞1.8為檢測系統(tǒng)有效，樣本od值≥2×陰性對照od值時，為陽性，反之為陰性。分泌抗體陽性細(xì)胞孔以1個細(xì)胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽性孔依上法連續(xù)克隆四次，使其達(dá)到100％單克隆，轉(zhuǎn)入24孔繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿80％時轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶擴大培養(yǎng)后，待細(xì)胞長滿細(xì)胞瓶80％時分瓶傳代，傳代的細(xì)胞生長至對數(shù)期時，用適量無血清rpmi-1640培養(yǎng)基分散細(xì)胞瓶內(nèi)細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于錐形離心管中，記錄細(xì)胞懸液體積v，取適量細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，得到細(xì)胞懸液密度(個/ml)，其余1000rpm離心5min后棄上清液，根據(jù)細(xì)胞密度和離心前體積算出沉淀的細(xì)胞數(shù)，向細(xì)胞沉淀中加入適量凍存液調(diào)整細(xì)胞密度至4-8×10⁶個/ml(取適量進(jìn)行計數(shù)確認(rèn)，如果細(xì)胞數(shù)未在范圍內(nèi)，則重新離心按照細(xì)胞計數(shù)總量，重新加入適量凍存液，最終使細(xì)胞濃度在4-8×10⁶個/ml)，然后分裝于無菌凍存管中，每只凍存管加細(xì)胞液0.5ml。細(xì)胞融合共獲得1株能穩(wěn)定分泌抗b型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞hbcab-12e4，于2015年8月1日保藏在四川邁克生物新材料技術(shù)有限公司，并于2017年3月30日以保藏號cctccno：c201747保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢武漢大學(xué))。

實施例2

單克隆抗體的制備

選6-8周健康的balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml液體石蠟(天津科密歐)，7天后每只小鼠腹腔注射0.5～1×10⁶個雜交瘤細(xì)胞。接種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠瀕死之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一只小鼠可獲1-5ml腹水。收集的腹水離心取上清，取小樣放于-20℃冰箱保存。腹水用硫酸氨飽和沉淀后，再用蛋白a親合層析柱純化，sds-page檢測本發(fā)明制得的單克隆抗體純度大于90％。

實施例3

⑴雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價檢測

用0.06mph9.6碳酸緩沖溶液稀釋重組hbcag(桂康生物)至2.5μg/ml，96孔酶標(biāo)板中每孔包被100μl。放置于冰箱中2-8℃過夜，第二天拋棄孔中液體，elisa洗板機洗三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01mph7.2的pbs，150μl/孔，37℃封閉2小時棄液體，拍干，用于檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、腹水及抗體效價。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價檢測第一孔為原倍上清培養(yǎng)液，從第二孔至第四孔以0.01mph7.2的pbs緩沖液10倍逐級稀釋，第五孔至第十孔以2倍逐級稀釋。第十一孔以融合時小鼠血清稀釋至100倍作陽性對照，第十二孔以rpmi1640完全培養(yǎng)液作陰性對照，每孔樣本體積為100μl。37℃孵育40分鐘，elisa洗板機洗五次后加入12000倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠igg(四川新材料生物科技有限公司)100μl，37℃孵育30分鐘同上洗后，每孔加入100μl含0.1％(m/v)鄰苯二胺，0.1％(v/v)雙氧水，ph5.0檸檬酸磷酸緩沖液，37℃孵育10分鐘，每孔加入50μl2m硫酸溶液終止反應(yīng)，測450nm吸收值。陰性對照od值＜0.2，陽性對照od值＞1.8為檢測系統(tǒng)有效，當(dāng)od值≥2×陰性對照od值時，為陽性，反之為陰性。檢測值最低陽性孔所對應(yīng)的稀釋比例即為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價，本雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價大于1：2000。

⑵腹水效價檢測

elisa檢測方法同上⑴。稀釋方法不同，具體為：第一孔為原倍腹水，以0.01mph7.2的pbs緩沖液從第二孔至第七孔10倍逐級稀釋，從第八孔至第十一孔以2倍逐級稀釋。檢測值最低陽性孔所對應(yīng)的稀釋比例即為腹水效價，本雜交瘤細(xì)胞所制備的腹水效價大于1：10⁶。

⑶抗體效價檢測

先將本發(fā)明的單克隆抗體a以0.01mph7.2的pbs緩沖液統(tǒng)一稀釋為1mg/ml，后再稀釋100倍作為初始第一孔，從第二孔開始至第十孔作5倍逐級稀釋，第十一孔以融合時小鼠血清稀釋至100倍作陽性對照，第十二孔以pbs作陰性對照，每孔樣本體積為100μl。37℃孵育50分鐘，elisa洗板機洗五次后加入12000倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠igg(四川新材料生物科技有限公司)100μl，37℃孵育1h同上洗后，每孔加入100μl含0.1％(m/v)鄰苯二胺，0.1％(v/v)雙氧水，ph5.0檸檬酸磷酸緩沖液，37℃孵育15分鐘，每孔加入50μl2m硫酸溶液終止反應(yīng)，檢測450nm吸收值。陰性對照od值＜0.2，陽性對照od值＞1.8為檢測系統(tǒng)有效。

抗體效價判定標(biāo)準(zhǔn)：以log(稀釋度)為橫坐標(biāo)，以抗體od值為縱坐標(biāo)作曲線，曲線方程為y＝min+(max-min)/(1+10^((logec50-x)×hillslope))，通過sigmaplot數(shù)據(jù)處理軟件擬合曲線，取中值效價＝10^logec50。結(jié)果顯示本發(fā)明單克隆抗體a的中值效價大于8×10⁴。以同樣方法對照檢測兩種商業(yè)化抗b型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體b(廈門市波生生物技術(shù)有限公司)和c(洛陽市佰泰科生物技術(shù)有限公司)，通過擬合，中值效價均低于8×10⁴，低于本雜交瘤細(xì)胞獲得的單克隆抗體a。表1與圖1列出了效價測定結(jié)果，可明顯看出本發(fā)明的單克隆抗體效價遠(yuǎn)高于市售單克隆抗體b和c的效價。

表1：抗體效價檢測

實施例4

抗體活性測定：采用上?？迫A生物工程股份有限公司b型肝炎病毒核心抗體檢測試劑盒檢測本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗體。將本發(fā)明的單克隆抗體a與商業(yè)化抗b型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體b和c抗體作為樣本，以0.01mph7.2的pbs緩沖液10倍逐級稀釋，檢測3個抗體競爭性。結(jié)果顯示本發(fā)明的單克隆抗體a稀釋10000倍后仍可檢測出陽性，其od值為0.497(cutoff＝陰性均值×0.3＝0.698，小于0.698為陽性)，b抗體稀釋至1000倍后顯示弱陽性，c抗體稀釋至100倍后顯示陽性。這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的單克隆抗體與商業(yè)化的上?？迫A生物工程股份有限公司b肝病毒核心抗體檢測試劑盒中試劑有較強的競爭性，其活性大于商業(yè)化的單克隆抗體b與c。表2中列出了檢測結(jié)果。

表2：抗體活性測定

實施例5

使用本發(fā)明單克隆抗體的試紙條及其穩(wěn)定性

⑴使用本發(fā)明單克隆抗體制備試紙條

本發(fā)明的抗b型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體能應(yīng)于膠體金平臺，從而快速定性檢測血清、血漿中的b型肝炎病毒核心抗體。

檢測試紙條由pvc底板及其上的樣品墊、膠體金墊、包被膜、吸水墊組成，所述膠體金墊中含有重組hbcag膠體金復(fù)合物及兔igg膠體金復(fù)合物，包被膜上沿著從樣品墊到吸水墊的方向在膜本體上順次分布有互相間隔開的質(zhì)控區(qū)(c線)與檢測區(qū)(t線)，c、t間距固定為6mm(卡上絲印已為固定位置，故無需優(yōu)化間距)。c線包被有抗兔igg抗體，t線包被有抗b型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體即下述鼠抗hbcag單克隆抗體。圖2為該試紙條的示意圖，1-pvc底板，2-樣品墊，3-膠體金墊，4-檢測區(qū)(t線)，5-質(zhì)控區(qū)(c線)，6-吸水墊，7-包被膜。包被優(yōu)選方案見表3與表4。

表3包被濃度

表4包被od

當(dāng)檢測樣本為陽性時，樣本先與膠體金標(biāo)記重組hbcag復(fù)合物結(jié)合形成復(fù)合物，隨側(cè)流層析效應(yīng)在包被膜(硝酸纖維素膜)上移動，重組hbcag膠體金復(fù)合物不與t線(檢測線)結(jié)合，僅在c線(質(zhì)控線)處聚集顯色。當(dāng)檢測樣本為陰性時則檢測線和質(zhì)控線都聚集顯色，顯色結(jié)果于15-20分鐘內(nèi)判定。

⑵采用上述試紙條檢測臨床樣本

采用上述試紙條檢驗100例陽性樣本與100例陰性樣本。下表a為本抗體配制的試劑，b為商業(yè)化試劑(英科新創(chuàng)科技有限公司)，檢驗結(jié)果表明用本發(fā)明的單克隆抗體制備的膠體金試紙條靈敏度及特異性均高于商業(yè)化試劑，在表5中列出了檢測結(jié)果。

表5陽性與陰性樣本檢驗

⑶本發(fā)明單克隆抗體在惡劣環(huán)境下的穩(wěn)定性

將本發(fā)明的單克隆抗體a在以下條件下處理：a-20℃反復(fù)凍融2次；b-20℃反復(fù)凍融3次；c-20℃反復(fù)凍融4次；d-20℃反復(fù)凍融5次；e-20℃保存7個月；f37℃熱加速3天；g37℃熱加速7天，其他條件不變，按上述方法制備成檢測試劑分別檢驗15份陽性參考品與15份陰性參考品，符合率均為100％。表明本抗體穩(wěn)定性良好，且利用本抗體制備的檢測試劑精密性良好。選取效價及活性較好的商業(yè)化抗b型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體b(廈門市波生生物技術(shù)有限公司)，以上述同樣條件處理后制備成檢測試劑分別檢測15份陽性參考品與15份陰性參考品，結(jié)果顯示其反復(fù)凍融3至4次或-20℃保存7個月或熱加速3天后已開始部分降解，檢驗結(jié)果與參考品不完全符合。在表6中列出了檢測結(jié)果。

表6參考品檢測

由此可見，本發(fā)明的單克隆抗體穩(wěn)定性高，由其制成的b型肝炎病毒核心抗體檢測試劑及試紙條在較為惡劣的環(huán)境條件下還能保持很高的穩(wěn)定性與可靠性，這一點在臨床以及實驗室應(yīng)用中均是非常寶貴的進(jìn)步。