本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及WFDC21P在肝癌診治中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，是世界范圍內(nèi)腫瘤導(dǎo)致死亡的主要因素之一。80％的新發(fā)肝癌病例出現(xiàn)在發(fā)展中國家，肝細(xì)胞癌(HCC)是中國癌癥死亡的主要原因之一。盡管局部治療如手術(shù)和經(jīng)導(dǎo)管動脈化學(xué)栓塞能夠治療肝癌，但肝癌病人仍有很高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率。而HCC的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制目前仍然不是很清楚。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)在癌癥轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。特別是，已發(fā)現(xiàn)EMT可能是腫瘤轉(zhuǎn)移播散和治療時(shí)獲得抗藥性的重要原因。最近的數(shù)據(jù)也表明，表觀遺傳的改變，也參與了癌癥的轉(zhuǎn)移過程。

最近人們發(fā)現(xiàn)，在人類基因組中除了有microRNA這一具有強(qiáng)大調(diào)控和表觀遺傳修飾功能的微小非編碼RNA的存在，還存在著數(shù)以萬計(jì)的另一種非編碼RNA即長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)長鏈非編碼是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子，它們不具有編碼蛋白的功能。lncRNA起初被認(rèn)為是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音、垃圾”，不具有生物學(xué)功能。然而，最近的研究表明，它們可以通過DNA甲基化、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、RNA干擾、印跡基因等多種不同的機(jī)制、在多種層面上影響基因的表達(dá)水平。因此，lncRNA可能成為肝癌研究的新方向?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道m(xù)icroRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展以及耐藥中具有重要作用，但是同樣作為非編碼產(chǎn)物的lncRNA，其生物學(xué)功能以及其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用卻不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

目前，在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的異常表達(dá)的lncRNA可涉及全身各個(gè)系統(tǒng)，分布較為廣泛，但是由于lncRNA數(shù)量龐大，目前針對lncRNA在癌癥領(lǐng)域中的研究仍處在起步階段，因此探尋LncRNA肝癌的分子基礎(chǔ)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一，提供一種診斷產(chǎn)品，為實(shí)現(xiàn)肝癌的早期診斷提供基礎(chǔ)。

本發(fā)明的目的之二，提供一種用于肝癌臨床診斷和治療中以及機(jī)制研究的分子標(biāo)志物。

本發(fā)明的目的之三，提供一種治療手段和藥物組合物，通過降低靶向分子的轉(zhuǎn)錄水平，實(shí)現(xiàn)肝癌的精準(zhǔn)分子治療。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測WFDC21P轉(zhuǎn)錄水平的試劑在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中，WFDC21P在肝癌患者中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。

進(jìn)一步，所述試劑選自：

特異性識別WFDC21P的探針；或

特異性擴(kuò)增WFDC21P的引物。

本發(fā)明提供了一種診斷肝癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測樣本中WFDC21P的轉(zhuǎn)錄水平來診斷肝癌。所述“樣本”包括細(xì)胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支氣管清洗液、尿、糞便等。優(yōu)選的，所述樣本為組織、血液。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、制劑或試劑盒；其中，所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測WFDC21P轉(zhuǎn)錄水平的針對WFDC21P的寡核苷酸探針；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測WFDC21P轉(zhuǎn)錄水平的試劑。

本發(fā)明提供了WFDC21P基因在篩選預(yù)防或治療肝癌潛在物質(zhì)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種篩選預(yù)防或治療肝癌的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括：

用候選物質(zhì)處理表達(dá)或含有WFDC21P基因或的體系；和

檢測所述體系中WFDC21P基因的轉(zhuǎn)錄；

其中，若所述候選物質(zhì)可降低WFDC21P基因的轉(zhuǎn)錄水平(優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療肝癌的潛在物質(zhì)。所述體系選自：細(xì)胞體系、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。

所述候選物質(zhì)包括(但不限于)：針對WFDC21P基因或其上游或下游基因設(shè)計(jì)的干擾分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本發(fā)明提供了WFDC21P在制備治療肝癌的藥物組合物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述藥物組合物包括WFDC21P功能性表達(dá)的抑制劑，所述抑制劑選自：以WFDC21P或其轉(zhuǎn)錄本為靶序列、且能夠抑制WFDC21P基因表達(dá)或基因轉(zhuǎn)錄的干擾分子，包括：shRNA(小發(fā)夾RNA)、小干擾RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反義核酸，或能表達(dá)或形成所述shRNA、小干擾RNA、dsRNA、微小RNA、反義核酸的構(gòu)建物。優(yōu)選的，所述的抑制劑為siRNA。

進(jìn)一步，所述藥物組合物還包括與所述抑制劑配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

本發(fā)明提供了一種治療肝癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括：

WFDC21P功能性表達(dá)的抑制劑；和

藥學(xué)上可接受的載體。

藥學(xué)上可接受的載體包括(但不限于)緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、生理食鹽、賦形劑、填充劑、凝結(jié)劑與調(diào)和劑、界面活性劑、擴(kuò)散劑、消泡劑。

附圖說明

圖1是利用QPCR檢測WFDC21P在肝癌患者中的表達(dá)情況圖；

圖2是利用QPCR檢測WFDC21P在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況圖；

圖3是利用QPCR檢測轉(zhuǎn)染W(wǎng)FDC21P在肝癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖4是利用CCK8檢測WFDC21P對肝癌細(xì)胞增殖的影響圖；

圖5是利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測WFDC21P表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響圖。

具體的實(shí)施方式

本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過高通量方法，采用目前覆蓋數(shù)據(jù)庫最廣的lncRNA芯片，檢測肝癌標(biāo)本中l(wèi)ncRNA在肝癌患者和健康人中轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)其中具有明顯表達(dá)差異的lncRNA片段，探討其與肝癌的發(fā)生之間的關(guān)系，從而為肝癌的早期檢測及靶向治療尋找更好的途徑和方法。通過篩選，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了肝癌中WFDC21P顯著性上調(diào)。實(shí)驗(yàn)證明，siRNA干擾沉默WFDC21P，能夠有效地抑制肝癌細(xì)胞的增殖，為肝癌的個(gè)性化治療提供了新途徑。

WFDC21P基因

WFDC21P基因位于17號染色體長臂2區(qū)3號帶上，該基因目前存在8個(gè)轉(zhuǎn)錄本，一種代表性的人WFDC21P基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明中的WFDC21P包括野生型、突變型或其片段。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明的實(shí)用性并不局限于對本發(fā)明的靶標(biāo)基因的任何特定變體的基因表達(dá)進(jìn)行定量。如果當(dāng)核酸或其片段與其它核酸(或其互補(bǔ)鏈)最佳比對時(shí)(具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔?，在至少大約60％的核苷酸堿基、通常至少大約70％、更通常至少大約80％、優(yōu)選至少大約90％、及更優(yōu)選至少大約95-98％核苷酸堿基中存在核苷酸序列相同性，則這兩個(gè)序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

或者，當(dāng)核酸或其片段與另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)、一條鏈或其互補(bǔ)序列在選擇性雜交條件下雜交時(shí)，則其間存在基本同源或(相同性)。當(dāng)雜交比特異性整體喪失發(fā)生更具選擇性時(shí)，存在雜交選擇性。典型地，當(dāng)在至少大約14個(gè)核苷酸的一段序列存在至少大約55％相同性、優(yōu)選至少大約65％、更優(yōu)選至少大約75％及最優(yōu)選至少大約90％相同性時(shí)，發(fā)生選擇性雜交。如本文所述，同源對比的長度可以是較長的序列節(jié)段，在某些實(shí)施方案中通常為至少大約20個(gè)核苷酸，更通常為至少大約24個(gè)核苷酸，典型為至少大約28個(gè)核苷酸，更典型為至少大約32個(gè)核苷酸，及優(yōu)選至少大約36或更多個(gè)核苷酸。

因此，本發(fā)明的多核苷酸與SEQ ID NO.1優(yōu)選具有至少75％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％同源性。更優(yōu)選地，存在至少95％、更優(yōu)選至少98％同源性。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，測定基因表達(dá)的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上檢測生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。

檢測技術(shù)

本發(fā)明的lncRNA使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種核酸技術(shù)進(jìn)行檢測，這些技術(shù)包括但不限于：核酸測序、核酸雜交和核酸擴(kuò)增技術(shù)。

核酸測序技術(shù)的示例性非限制性實(shí)例包括但不限于鏈終止子(Sanger)測序和染料終止子測序。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，由于RNA在細(xì)胞中不太穩(wěn)定并且在實(shí)驗(yàn)中更易受到核酸酶攻擊，因此在測序前通常將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA。

本發(fā)明可在檢測前或與檢測同時(shí)地對核酸(例如，ncRNA)進(jìn)行擴(kuò)增。核酸擴(kuò)增技術(shù)的示例性非限制性實(shí)例包括但不限于：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，某些擴(kuò)增技術(shù)(例如，PCR)需要在擴(kuò)增前將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA(例如，RT-PCR)，而其他擴(kuò)增技術(shù)則直接擴(kuò)增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常稱為PCR的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用變性、引物對與相反鏈的退火以及引物延伸的多個(gè)循環(huán)，以指數(shù)方式增加靶核酸序列的拷貝數(shù)；TMA的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(在基本上恒定的溫度、離子強(qiáng)度和pH的條件下自身催化地合成靶核酸序列的多個(gè)拷貝，其中靶序列的多個(gè)RNA拷貝自身催化地生成另外的拷貝；LCR的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用與靶核酸的相鄰區(qū)域雜交的兩組互補(bǔ)DNA寡核苷酸；其他擴(kuò)增方法包括例如：通常稱為NASBA的基于核酸序列的擴(kuò)增；使用RNA復(fù)制酶(通常稱為Qβ復(fù)制酶)擴(kuò)增探針分子本身的擴(kuò)增；基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法；以及自我維持的序列擴(kuò)增。

本發(fā)明中非擴(kuò)增或擴(kuò)增的核酸可通過任何常規(guī)的手段檢測。

芯片、試劑盒

在本發(fā)明中芯片包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應(yīng)于WFDC21P所示的部分或全部序列。

所述固相載體包括無機(jī)載體和有機(jī)載體，所述無機(jī)載體包括但不限于有硅載體、玻璃載體、陶瓷載體等；所述有機(jī)載體包括聚丙烯薄膜、尼龍膜等。

“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補(bǔ)堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

本發(fā)明中的示例性探針包括PCR引物以及基因特異性DNA寡核苷酸探針，例如固定于微陣列基底上的微陣列探針、定量核酸酶保護(hù)檢驗(yàn)探針、與分子條形碼連接的探針、以及固定于珠上的探針。

這些探針具有與靶點(diǎn)基因的特定的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。這里，所謂“互補(bǔ)”，只要是雜交即可，可以不是完全互補(bǔ)。這些多核苷酸通常相對于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過PNA(Polyamide nucleic acid，肽核酸)、LNA(注冊商標(biāo)，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交聯(lián)化核酸)、ENA(注冊商標(biāo)，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。

本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒可用于檢測WFDC21P的表達(dá)。優(yōu)選的，所述的制劑或試劑盒中還含有用于標(biāo)記RNA樣品的標(biāo)記物，以及與所述標(biāo)記物相對應(yīng)的底物。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取RNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于：抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液等。此外，所述的試劑盒中還包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。

本發(fā)明中基因檢測試劑盒或基因芯片可用于檢測包括WFDC21P基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與肝癌相關(guān)的多個(gè)基因)的轉(zhuǎn)錄水平，將肝癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測，可大大提高肝癌診斷的準(zhǔn)確率。

抑制劑和藥物組合物

基于發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種WFDC21P的抑制劑，所述抑制劑的性質(zhì)對本發(fā)明來說并不重要，只要它抑制WFDC21P基因的功能性表達(dá)即可，這些抑制劑作為對于下調(diào)WFDC21P有用的物質(zhì)，可用于預(yù)防或治療肝癌。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述WFDC21P的抑制劑是一種WFDC21P特異性的小干擾RNA分子。如本文所用，所述的“小干擾RNA”是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個(gè)過程就是RNA干擾(RNA interference)過程。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個(gè)正義鏈和一個(gè)反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個(gè)雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈RNA復(fù)合物。

在篩選有效的siRNA序列時(shí)，本發(fā)明人通過大量的比對分析，從而找出最佳的有效片段。本發(fā)明人設(shè)計(jì)合成了多種siRNA序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，選出干擾效果最佳的siRNA，進(jìn)一步地在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明對于該siRNA在能有效的抑制細(xì)胞中WFDC21P基因的轉(zhuǎn)錄水平，以及肝癌細(xì)胞的增殖。

本發(fā)明的核酸抑制物如siRNA可以化學(xué)合成，也可以通過一個(gè)重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA之后進(jìn)行制備。siRNA等核酸抑制物，可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量的所述的WFDC21P的抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可用于抑制肝癌。任何前述的WFDC21P的抑制劑均可用于藥物組合物的制備。

如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞(宿主細(xì)胞)轉(zhuǎn)染試劑。

本發(fā)明可以采用用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的抑制劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。

優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進(jìn)行。比如，可直接將WFDC21P的抑制劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶WFDC21P的抑制劑的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等，或siRNA或shRNA)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá)活性的WFDC21P抑制劑，具體情況需視所述的抑制劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種抗癌劑。在具體的實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種抑制WFDC21P基因表達(dá)的化合物和至少一種化療劑。用于本發(fā)明的化療劑，包括但不限于：微管激活劑、烷化劑、抗贅生抗代謝物、鉑類化合物、DNA-烷化劑，抗腫瘤抗生素劑，抗代謝劑，微管蛋白穩(wěn)定劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素拮抗劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，HMG-COA抑制劑，CDK抑制劑，細(xì)胞周期蛋白抑制劑，胱天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三鏈螺旋DNA，核酸適體，和分子修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素試劑。

可藥用載體可包括但不限于：病毒、脂質(zhì)體、納米顆?；蚓酆衔锛捌淙我饨M合。相關(guān)的遞送載劑可包括但不限于：脂質(zhì)體、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、無機(jī)(包括金屬)顆粒、以及細(xì)菌或病毒(例如桿狀病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)、噬菌體、黏?；蛸|(zhì)粒載體。

本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療肝癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。

本發(fā)明的藥物組合物還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選與肝癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集10例肝癌患者的癌組織以及癌旁組織，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、RNA樣品的制備

利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進(jìn)行組織RNA的提取，按說明書的具體步驟進(jìn)行操作。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用Low RNA Input Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)用Cy3分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對照組。

4、雜交

基因芯片采用康城生物-Human lncRNA Array，按芯片使用說明書的步驟進(jìn)行雜交。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用Agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動以100％和10％PMT各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件自動合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用Feature Extraction進(jìn)行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Bioconductor程序包進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后Ratio值為實(shí)驗(yàn)組和對照組。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：ratio≥4為上調(diào)基因，ratio≤0.25為下調(diào)基因。

6、結(jié)果

與癌旁組織相比，WFDC21P在肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于癌旁組織。

實(shí)施例2QPCR測序驗(yàn)證WFDC21P基因的差異表達(dá)

1、對WFDC21P基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式收集肝癌組織和癌旁組織樣本各60例。

2、RNA提取步驟同實(shí)施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分：DEPC水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

(3)QPCR擴(kuò)增檢驗(yàn)

引物設(shè)計(jì)：

WFDC21P基因的引物序列為：

正向引物：5’-TCTATTGACTGAAGTTGAC-3’(SEQ ID NO.2)

反向引物：5’-ATTATGTCTCTGGGTCTT-3’(SEQ ID NO.3)

管家基因GAPDH的引物序列為：

正向引物：5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’(SEQ ID NO.5)

采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管，所有擴(kuò)增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。

配制以下反應(yīng)體系：SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA 2.0μl，無酶水8.5μl。各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35個(gè)循環(huán)。

以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進(jìn)行相對定量。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與癌旁組織相比，WFDC21P基因在肝癌組織中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例3WFDC21P基因在肝癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7和正常肝細(xì)胞系HL-7702，，以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO₂、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、RNA的提取

1)胰酶消化貼壁細(xì)胞，吹打獲得的細(xì)胞經(jīng)離心、重懸、清洗后，以含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸；

2)將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板，添加培養(yǎng)基至2m1/孔，輕搖6孔板使細(xì)胞均勻重懸；

3)細(xì)胞貼壁生長48h，去培養(yǎng)基；

4)以1mlTrizol試劑裂解細(xì)胞，反復(fù)吹打6孔板壁，盡量使細(xì)胞完全裂解；

5)轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液至1.5ml DEPC處理過的EP管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步驟同血液中RNA提取過程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實(shí)施例2.

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常肝細(xì)胞系相比，WFDC21P基因在肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7中表達(dá)均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例4WFDC21P基因的沉默

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2，以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO₂、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、siRNA設(shè)計(jì)

針對WFDC21P基因的siRNA序列：

陰性對照siRNA序列(siRNA-NC)：

正義鏈：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.6)，

反義鏈：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.7)；

siRNA1-WFDC21P：

正義鏈：5’-UCAACUUCAGUCAAUAGAGGU-3’(SEQ ID NO.8)，

反義鏈：5’-CUCUAUUGACUGAAGUUGACA-3’(SEQ ID NO.9)；

siRNA2-WFDC21P：

正義鏈：5’-AUCCUUAAGAUAACUCUUCAU-3’(SEQ ID NO.10)，

反義鏈：5’-GAAGAGUUAUCUUAAGGAUCA-3’(SEQ ID NO.11)；

siRNA3-WFDC21P：

正義鏈為5’-ACGAUCUUAGGGAAAGAUGAU-3’(SEQ ID NO.12)，

反義鏈為5’-CAUCUUUCCCUAAGAUCGUCA-3’(SEQ ID NO.13)

將細(xì)胞按2×10⁵/孔接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中細(xì)胞培養(yǎng)24h；

在無雙抗、含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購自于Invitrogen公司)的說明書轉(zhuǎn)染。

實(shí)驗(yàn)分為空白對照組(HepG2)、陰性對照組(siRNA-NC)和實(shí)驗(yàn)組(20nM)(siRNA1-WFDC21P、siRNA2-WFDC21P、siRNA3-WFDC21P)，其中陰性對照組siRNA與WFDC21P基因的序列無同源性，濃度為20nM/孔，同時(shí)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3、QPCR檢測WFDC21P基因的轉(zhuǎn)錄水平

3.1細(xì)胞總RNA的提取

具體步驟同實(shí)施例3。

3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實(shí)施例2。

3.3QPCR擴(kuò)增步驟同實(shí)施例2。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，干擾WFDC21P基因表達(dá)組與對照組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖3顯示，相比HepG2、轉(zhuǎn)染空載siRNA-NC、siRNA1-WFDC21P、siRNA3-WFDC21P組，siRNA2-WFDC21P組能夠顯著降低WFDC21P的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

實(shí)施例5CCK8檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例4

2、CCK8檢測細(xì)胞增殖

1)將對數(shù)增殖期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×10³個(gè)細(xì)胞；

2)實(shí)驗(yàn)分三組，分別是空白對照組、轉(zhuǎn)染siRNA-NC組和轉(zhuǎn)染siRNA2-WFDC21P，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；

3)分別在轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔CCK8試劑；

4)2h后使用酶標(biāo)儀檢測A450的吸光值。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、結(jié)果

圖4所示的結(jié)果顯示：空白對照組同空載組無明顯差異，而轉(zhuǎn)染siRNA2-WFDC21P組的細(xì)胞生長速度明顯低對照組的細(xì)胞生長速度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，上述結(jié)果表明WFDC21P的表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長。

實(shí)施例6軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

1、用0.25％胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，輕輕吹打使之成為單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，適當(dāng)稀釋后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10³個(gè)/ml。

3、制備兩個(gè)濃度分別為1.2％和0.7％的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃水浴中。

4、1.2％的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于CO₂溫箱中備用。

5、在無菌試管中1:1混合0.7％的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃度為5×10³個(gè)/ml的穩(wěn)定感染細(xì)胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)4個(gè)樣本。

6、待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％CO₂溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。

7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005％的龍膽紫染色90min。把平皿放置在倒置顯微鏡下觀察，每組細(xì)胞隨機(jī)選取10個(gè)低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細(xì)胞克隆數(shù)。

8、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA2-WFDC21P的細(xì)胞組單細(xì)胞克隆集落形成數(shù)顯著降低。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 王冬國

<120> WFDC21P在肝癌診治中的應(yīng)用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 630

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

gggggaagaa gaaaagagga tgccagtcct tgttcctagg ccaagacctg agccctgtaa 60

tattaatatt tggatctaaa atcagccttc caacagcaac atgaagttgg cagccttcct 120

cctcctgtga tcctcatcat cttcagccta gaggtacaag agcttcaggc tgcaggagac 180

cggcttttgg gtgtctgacc cttctcaaca cagcatcaga cagccacctc tattgactga 240

agttgacaat ggagaataaa actcattacc cctgctgaat ccaggggccc ctttttacag 300

atgagaaaag ttccagaaag acccagagac ataatcaggt acctgcgtcg agctctgcac 360

aggtgactgg gactgcaacc ccggagacca ctgtgtcagc aatgggtgtg gccatgagtg 420

tgttgcagga tgaagagtta tcttaaggat catctttccc taagatcgtc atcccttcct 480

ggagttccta tcttccaaga tgtgactgtc tggagttcct tgactaggaa gatggatgaa 540

aacagcaagc ctgtggatgg agactacagg ggatatggga ggcagggaag aggggttgtt 600

tcttttaata aatcatcatt gttaaaagca 630

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctattgact gaagttgac 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attatgtctc tgggtctt 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgggaaact gtggcgtgat gg 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

ucaacuucag ucaauagagg u 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

cucuauugac ugaaguugac a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

auccuuaaga uaacucuuca u 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaagaguuau cuuaaggauc a 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

acgaucuuag ggaaagauga u 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

caucuuuccc uaagaucguc a 21