本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及水稻osat1蛋白在改善植物硼含量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

硼是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素之一，對(duì)植物生長(zhǎng)有重要的作用。研究表明：植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性都需要硼的存在(huandbrown.localizationofboronincellwallsofsquashandtobaccoanditsassociationwithpectin.plantphysiology,1994,105(2):681-689；matohetal.isolationandcharacterizationofaboron-polysaccharidecomplexfromradishroots.plantcellandphysiology,1993,34(4):639-642)，硼參與植物生殖代謝，在植物花粉形成、花粉管萌發(fā)和受精作用中具有重要作用，并對(duì)植物中各種物質(zhì)代謝起著重要的作用，如酚類物質(zhì)(ruizetal.relationshipbetweenboronandphenolicmetabolismintobaccoleaves.phytochemistry,1998,48(2):269-272)、iaa等激素(施益華和劉鵬.硼在植物體內(nèi)生理功能研究進(jìn)展.亞熱帶植物科學(xué),2002,31(2):64-69；wangetal.involvementofauxinandcksinborondeficiencyinducedchangesinapicaldominanceofpeaplants(pisumsativuml.).journalofplantphysiology,2006,163(6):591-600)。缺硼或硼過量均會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響，油菜“花而不實(shí)”(劉積述和陳智君.甘蘭型油菜缺硼癥狀與噴硼試驗(yàn).福建農(nóng)業(yè)科技,1979,5:6)、棉花“蕾而不花”(周世恭.硼與植物開花結(jié)果.1980,6:017)、小麥“穗而不實(shí)”(李文雄等，小麥大面積不結(jié)實(shí)原因的研究.東北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1978,3:19)等都是作物缺硼的典型病癥；而硼過量不僅會(huì)抑制植株生長(zhǎng)，造成葉尖或成熟葉緣失綠并出現(xiàn)黃褐色壞死斑(nableetal.,borontoxicity.plantandsoil,1997,193:181-1998；reidetal.,acriticalanalysisofthecausesofborontoxicityinplants.plant,cellandenvironment,2004,27:1405-1414)，而且會(huì)造成水稻和綠豆等作物籽粒變小，產(chǎn)量下降(ochiaietal,borontoxicityinrice(oryzasatival.).ⅰ.quantitativetraitlocus(qtl)analysisoftolerancetoborontoxicity.theoreticalandappliedgenetics,2008,117:125-133；chatterjeeetal,biochemicalchanges,yield,andqualityofgramunderboronstress.communicationsinsoilscienceandplantanalysis,2005,36:1763-1771)。但硼既不是酶的組分，也不參與電子傳遞和氧化還原能力，相較于其他營(yíng)養(yǎng)元素，人們對(duì)硼的吸收、運(yùn)輸和生理功能的認(rèn)識(shí)還比較缺乏。因此，明確植物吸收硼、分配硼的機(jī)理對(duì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量和改善品質(zhì)具有非常重要的意義。

不同的植物中硼含量變化很大，含量低的只有2mg.kg^-1，而含量高的可達(dá)100mg.kg^-1(陸景陵，植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)(上冊(cè)).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003)。土壤和植物中硼元素以不帶電荷的硼酸形式存在，植物體吸收和運(yùn)輸硼的主要形式為硼酸。硼酸主要通過兩種方式進(jìn)入植物根系細(xì)胞：一是通過細(xì)胞質(zhì)膜磷脂雙分子層的被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入根系細(xì)胞，通過共質(zhì)體和質(zhì)外體途徑裝載進(jìn)入木質(zhì)部導(dǎo)管，隨蒸騰流運(yùn)輸?shù)降厣喜?；二是通過通道蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控可促進(jìn)硼的擴(kuò)散并主動(dòng)運(yùn)輸硼進(jìn)入細(xì)胞；2002年，takano等在擬南芥中成功克隆到第一個(gè)硼的外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(efflux-typeboratetransporter)bor1，定位于木質(zhì)部周圍的中柱鞘細(xì)胞的內(nèi)膜，促進(jìn)硼向木質(zhì)部的裝載從而隨蒸騰流運(yùn)輸?shù)街参矬w的各個(gè)部位(takanoetal.,arabidopsisborontransporterforxylemloading.nature,2002,420(6913):337-340)，在低硼下負(fù)責(zé)將硼從根部運(yùn)向地上部；然而在高硼下，體內(nèi)的bor1會(huì)被內(nèi)吞體吸收并運(yùn)往液泡進(jìn)行降解(takanoetal.,endocytosisanddegradationofbor1,aborontransporterofarabidopsisthaliana,regulatedbyboronavailability.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2005,102(34):12276-12281)。隨后，在擬南芥中有發(fā)現(xiàn)atbor2、atbor4、atnip5；1、atnip6；1也具有轉(zhuǎn)運(yùn)硼的功能(miwaetal.,rolesofbor2,aboronexporter,incrosslinkingofrhamnogalacturonanⅱandrootelongationunderboronlimitationinarabidopsis.plantphysiol,2013,163:1699-1709；miwaetal.,plantstolerantofhighboronlevels.science,2007,318:1417；takanoetal.,thearabidopsismajorintrinsicproteinnip5；1isessentialforefficientboronuptakeandplantdevelopmentunderboronlimitation.plantcell,2006,18:1498-1509；tanakaetal.,nip6；1isaboricacidchannelforpreferentialtransportofborontogrowingshoottissuesinarabidopsis.plantcell,2008,20:2860-2875)。而在近幾年，在水稻也克隆到多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)硼的蛋白基因，osbor1是水稻中第一個(gè)報(bào)道定位于質(zhì)膜上的外向型硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并在內(nèi)皮層和外皮層同時(shí)表達(dá)，缺硼條件下參與硼高效吸收進(jìn)入根系細(xì)胞；與atbor1不同的是，osbor1不論是缺硼條件還是正常硼條件下，其在根中的表達(dá)量均高于地上部的表達(dá)量(nakagawaetal.,cell-typespecificityoftheexpressionofosbor1,ariceeffluxborontransportergene,isregulatedinresponsetoboronavailabilityforefficientboronuptakeandxylemloading.plantcell,2007,19:2624-2635)；osbor4是一個(gè)在花粉中特異表達(dá)的外向型硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)花粉的萌發(fā)和花粉管的延伸起重要作用(tanakaetal.,rolesofpollen-specificboroneffluxtransporter,osbor4,inthericefertilizationprocess.plantandcellphysiology,2013,54:2011-2019)；ospip2；4和ospip2；7是兩個(gè)編碼水稻質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因介導(dǎo)了硼的轉(zhuǎn)運(yùn)，在硼脅迫下，它們?cè)诘厣喜康谋磉_(dá)下調(diào)，而在根中被顯著上調(diào)，負(fù)責(zé)將水稻體內(nèi)過量的硼轉(zhuǎn)運(yùn)到體外，提高水稻對(duì)硼脅迫的抗性(kumaretal.,tworiceplasmamembraneintrinsicproteins,ospip2；4andospip2；7,areinvolvedintransportandprovidingtolerancetoborontoxicity.planta,2014,239:187-198)；osnip3；1是與atnip5；1和atnip6；1最相似的通道蛋白，主要在外皮層表達(dá)，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)水稻地上部和根之間硼的分布(hanaokaetal.,osnip3；1,ariceboricacidchannel,regulatesborondistributionandisessentialforgrowthunderboron-deficientconditions.theplantjournal,2014,78:890-8-902)；dte1與擬南芥中atnip5；1為直系同源基因，定位于細(xì)胞質(zhì)膜，主要在水稻根中的外皮層細(xì)胞表達(dá)；在缺硼條件下，該基因在地上部和根中大量誘導(dǎo)表達(dá)，主要負(fù)責(zé)在缺硼條件下通過影響硼的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)水稻生長(zhǎng)發(fā)育(liuetal.,dwarfandtiller-enhancing1regulatesgrowthanddevelopmentbyinfluencingboronuptakeinboronlimitedconditionsinrice.plantscience,2015,236:18-28)。

水稻osat1基因編碼一個(gè)陰離子通道蛋白，該基因與硅酸分泌通道基因lsi2編碼的蛋白屬于同一基因家族(maetal,aneffluxtransporterofsiliconinrice.nature,2007,448(12):209-213)，但其編碼的蛋白序列與lsi2一致性為56％，是一個(gè)新的通道蛋白，目前還沒有關(guān)于osat1具有硼轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)功能研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供水稻osat1蛋白在改善植物硼含量中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

水稻osat1蛋白在改善植物硼含量中的應(yīng)用。

所述應(yīng)用優(yōu)選為所述的水稻osat1蛋白在制備改善植物硼含量的藥物中的應(yīng)用，和/或所述的水稻osat1蛋白的編碼基因在制備改善植物硼含量的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

所述的水稻osat1蛋白具有如seqidno:2所示的氨基酸序列；或是具有通過突變、刪除、插入或取代方式將如seqidno.2所示的氨基酸序列中的至少1個(gè)氨基酸改變的序列。

編碼所述的水稻osat1蛋白的基因的核苷酸序列，如seqidno.1所示；或在嚴(yán)格條件下可與seqidno.1雜交并且編碼所述的水稻osat1蛋白的dna分子，所述的嚴(yán)格條件可為在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗雜交膜一次；或者與seqidno.1的序列有90％以上的同源性(優(yōu)選95％以上同源性)，并且編碼上述水稻osat1蛋白的dna分子。

編碼所述水稻osat1蛋白的基因的啟動(dòng)子，核苷酸序列優(yōu)選為如seqidno:3所示；或嚴(yán)格條件下可與seqidno:3所示的dna分子雜交且具有啟動(dòng)子功能的dna分子。

所述的嚴(yán)格條件是：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗雜交膜一次。

一種表達(dá)載體，是由所述水稻osat1蛋白的編碼基因插入到植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。

此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可以使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或者轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或是鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)區(qū)域。

為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)可以產(chǎn)生顏色變化的酶或是發(fā)光化合物的基因(如gus基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除秀劑基因)等。

以上所述任意一種表達(dá)載體，所述的植物表達(dá)載體為pcambia3301、pcambia1300、pcambia2301或pbi121，或其他衍生植物表達(dá)載體。

攜帶有本發(fā)明的水稻osat1蛋白的編碼基因的植物表達(dá)載體可以通過ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或是組織中。被轉(zhuǎn)化的宿主植物可以是水稻或其它作物。

一種改善植物硼含量的轉(zhuǎn)基因植物，通過包括如下步驟的制備方法制備得到：將所述的水稻osat1蛋白的編碼基因插入到植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建重組植物表達(dá)載體；將所述的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主植物進(jìn)行表達(dá)，得到所述的改善植物硼含量的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，osat1過量表達(dá)植株表現(xiàn)為水稻葉片硼含量顯著提高，籽粒千粒重下降，而osat1干涉植株水稻葉片硼含量顯著降低，籽粒千粒重略有增加；osat1蛋白和其編碼基因?qū)φ{(diào)控水稻硼含量有重要的實(shí)際意義，在實(shí)際應(yīng)用中可以將osat1基因轉(zhuǎn)入不同的水稻品種中以培育更加理想的水稻栽培品種，或調(diào)節(jié)osat1基因的表達(dá)獲得相應(yīng)的水稻硼含量的水稻品種。osat1蛋白及其編碼基因在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。

附圖說明

圖1是水稻osat1轉(zhuǎn)基因植株的表型照片圖；其中，osat1i9-5，osat1i8-3為osat1干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；wt為野生型植株中花11；osat1ov3-3，osat1ov4-1為osat1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

圖2是熒光定量pcr轉(zhuǎn)基因植株中osat1的表達(dá)量結(jié)果分析圖；其中，osat1i9-5，osat1i8-3表示osat1干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；wt表示野生型植株中花11；osat1ov3-3，osat1ov4-1表示osat1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

圖3是轉(zhuǎn)基因水稻葉片中硼含量測(cè)定的結(jié)果分析圖；其中，osat1i9-5表示osat1干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；wt表示野生型植株中花11；osat1ov3-3表示osat1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

圖4是測(cè)定不同酵母細(xì)胞中硼含量的結(jié)果分析圖；其中，pyes2表示pyes2空載體；osbor1表示酵母細(xì)胞表達(dá)osbor1；osat1表示酵母細(xì)胞表達(dá)osat1。

圖5是不同濃度硼處理下osat1轉(zhuǎn)基因植株的表型照片圖；其中，osat1i9-5表示osat1干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；wt:野生型植株中花11；osat1ov3-3表示osat1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

圖6是測(cè)定不同濃度硼處理下osat1轉(zhuǎn)基因植株的千粒重的結(jié)果分析圖；其中，osat1i9-5表示osat1干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；wt:野生型植株中花11；osat1ov3-3表示osat1干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1osat1基因的獲得

根據(jù)ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的關(guān)于該基因的cdna序列(seqidno:1)設(shè)計(jì)引物，

其中，過量表達(dá)載體引物序列如下：

osat1-f1:acgaagcttgttcttgattggcggcaatg(seqidno:4下劃線為限制性內(nèi)切酶hindiii識(shí)別位點(diǎn))

osat1-r1:actacgcgttcagttgcttctgatgagcag(seqidno:5下劃線為限制性內(nèi)切酶mlui識(shí)別位點(diǎn))

干涉表達(dá)載體引物序列如下：

osat1-f2:aacagagctcatcctgctctgcctctactg(seqidno:6下劃線為限制性內(nèi)切酶saci識(shí)別位點(diǎn))

osat1-r2:ccacaagcttccagcatgctcaatgtgatg(seqidno:7下劃線為限制性內(nèi)切酶hindiii識(shí)別位點(diǎn))

以粳稻品種中花11號(hào)2周的幼苗葉片cdna為模板，過量表達(dá)dna在引物osat1-f1和osat1-r1的引導(dǎo)下，用常規(guī)方法擴(kuò)增osat1基因。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化大約1600bp左右的dna片段；干涉表達(dá)dna在引物osat1-f2和osat1-r2的引導(dǎo)下，用常規(guī)方法擴(kuò)增osat1基因。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化大約400bp左右的dna片段，分別將片段克隆到pmd18-t載體(購自takara公司)上，獲得pmd18-t-osat1-1和pmd18-t-osat1-2載體，送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果表明，兩個(gè)dna片段的序列與seqidno:1所示序列的一致性為100％，并在其dna兩端引入了合適的酶切位點(diǎn)。

實(shí)施例2遺傳轉(zhuǎn)化鑒定目的基因的功能

分別將osat1基因克隆入植物過量表達(dá)載體pcambia1380(購自澳大利亞cambia公司)多克隆位點(diǎn)的hindiii和mlui酶切位點(diǎn)之間和干涉表達(dá)載體prnai-ubi(載體信息參考胡旭霞和劉耀光.植物rna干涉載體的構(gòu)建及其在水稻基因表達(dá)沉默中的應(yīng)用.分子植物育種,2006,4(5):621-626)多克隆位點(diǎn)的hindiii和saci酶切位點(diǎn)之間，分別得到含有osat1基因的過量表達(dá)和干涉表達(dá)的植物表達(dá)載體，然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化粳稻品種中花11號(hào)的成熟胚的愈傷組織，方法如下述文獻(xiàn)描述(hieietal,efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.plantj,1994,6(2):271-282)，經(jīng)過預(yù)分化、分化，轉(zhuǎn)化osat1過量表達(dá)得到16株轉(zhuǎn)化植株(下文將以osat1ov3-3、osat1ov4-1為代表轉(zhuǎn)化植株展開研究)，轉(zhuǎn)化osat1干涉載體獲得9株轉(zhuǎn)化植株(下文將以osat1i9-5、osat1i8-3為代表轉(zhuǎn)化植株展開研究)，經(jīng)過pcr鑒定，全部為陽性，pcr引物序列如下：

引物1：5’-ctgaactcaccgcgacgtctgtc-3'(seqidno:8)；

引物2：5’-tagcgcgtctgctgctccataca-3’(seqidno:9)；

pcr擴(kuò)增條件為：94℃2min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。

經(jīng)過pcr鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株后，提取t1代轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組dna進(jìn)行southernblot檢測(cè)插入基因的拷貝數(shù)，選擇單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株分單株收取種子，然后取100粒以上種子發(fā)芽后利用50毫克/升潮霉素進(jìn)行篩選，若沒有死亡則表明種子已經(jīng)純合；選擇已經(jīng)純合的轉(zhuǎn)基因種子和野生型水稻中花11種子萌發(fā)后，利用木村b營(yíng)養(yǎng)液(調(diào)ph為4.8)培養(yǎng)水稻至4葉期，然后提取水稻葉片rna，檢測(cè)總rna濃度和完整度后再合成cdna第一鏈，以水稻actin作為內(nèi)參基因，加入等量的cdna模板，在熒光定量pcr儀擴(kuò)增actin和osat1，從圖2可以看出，過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株葉片中osat1的表達(dá)較野生型水稻分別提高了15倍和18倍；干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株葉片中osat1的表達(dá)是野生型水稻的40％和60％，所用pcr引物序列如下：

actin-f:5’-gccacactgtccccatctatg-3'(seqidno:10)；

actin-r:5’-aggtcgagacgaaggatagcat-3'(seqidno:11)；

at1-f:5’-cgtcacctcccaccgcttct-3'(seqidno:12)；

at1-r:5’-tggtgacagggacgggcttc-3'(seqidno:13)；

pcr擴(kuò)增條件為：95℃10min；95℃15sec，60℃1min，40個(gè)循環(huán)；60-95℃分析溶解曲線。

木村b營(yíng)養(yǎng)液具體配方為：(nh4)2so4(0.365mm),kh2po4(0.182mm),kno3(0.183mm),k2so4(0.086mm),ca(no3)2(0.366mm),mgso4(0.548mm),edta-fe^ⅲ(0.020mm),mncl2·4h2o(0.091×10^-3mm),znso4·7h2o(0.77×10^-3mm),cuso4·5h2o(0.32×10^-3mm),h3bo3(0.0462mm),(nh4)6mo7o24·4h2o(0.145×10^-3mm)。

通過以上實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)獲得表達(dá)效果較好了過量表達(dá)和干涉表達(dá)osat1的轉(zhuǎn)基因植株，其成熟期的轉(zhuǎn)基因純合植株表型如圖1所示。通過測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片的不同元素的含量顯示(測(cè)定方法參考tanakaetal，rolesofpollen-specificboroneffluxtransporter,osbor4,inthericefertilizationprocess.plantcellandphysiology.2013,54(12):2011-2019)：只有硼元素在過量表達(dá)植株中較野生型植株提高了3.6倍；而干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株硼元素含量下降了40％(圖3)，而硅、砷、鋁、鋅、鎘、鎳、鈉、鎂、鉀、錳、磷、硫、鉬、硒、鉻均沒有明顯差異。

實(shí)施例3酵母細(xì)胞中鑒定目的基因的功能

根據(jù)ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的關(guān)于osat1(seqidno:1)和osbor1(seqidno:18)的cdna序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：

osat1-f3:tatcaagcttgcaatggcgatggagccgac(seqidno:14下劃線為限制性內(nèi)切酶hindiii識(shí)別位點(diǎn))

osat1-r3:gtcagagctcttcagttgcttctgatgagc(seqidno:15下劃線為限制性內(nèi)切酶saci識(shí)別位點(diǎn))

osbor1-f1:cacgggtaccaaaatggaggagagcttcgt(seqidno:16下劃線為限制性內(nèi)切酶kpni識(shí)別位點(diǎn))

osbor1-r1:gactctcgagcttcactttggtgttgatcc(seqidno:17下劃線為限制性內(nèi)切酶xhoi識(shí)別位點(diǎn))

以粳稻品種中花11號(hào)2周的幼苗葉片cdna為模板，在引物對(duì)osat1-f3、osat1-r3和osbor1-f1、osbor1-r1的引導(dǎo)下，用常規(guī)方法擴(kuò)增osat1和osbor1基因。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，分別回收并純化大約1600bp和2100bp的dna片段；分別將片段克隆到pyes2載體(購自invitrogen公司)上，獲得pyes2-osat1和pyes2-osbor1載體，送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，兩個(gè)重組dna片段的序列分別與序列1(seqidno:1)和18(seqidno:18)的一致性為100％，并在其dna兩端引入了合適的酶切位點(diǎn)。將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母菌(invsc1,購自invitrogen公司)，在sc-u固體培養(yǎng)基選擇平板上挑選單菌落，接種于15毫升sc-u液體培養(yǎng)基上，30℃過夜培養(yǎng)；測(cè)定od600＝4～6，加入到50毫升sc-u誘導(dǎo)培養(yǎng)基中使od600＝0.4，5000rpm，5min，4℃。去上清，將沉淀溶于1～2毫升sc-u誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入到50mlsc-u誘導(dǎo)培養(yǎng)基30℃過夜培養(yǎng)20小時(shí)后，5000rpm，5min，4℃離心；棄去上清，加入新鮮的sc-u誘導(dǎo)培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為200微摩爾的硼酸，再誘導(dǎo)1小時(shí)，5000rpm，5min，4℃。將細(xì)胞用冰水反復(fù)沖洗幾次，去掉酵母細(xì)胞外的硼酸等物質(zhì)，用1毫升超純水懸浮后，100℃加熱30分鐘充分裂解酵母，12000rpm，10min，上清用于硼酸的含量測(cè)定，沉淀為酵母重量。通過icp-ms測(cè)定(方法參考tanakaetal，rolesofpollen-specificboroneffluxtransporter,osbor4,inthericefertilizationprocess.plantcellandphysiology.2013,54(12):2011-2019)上清中硼元素表明：表達(dá)osat1和osbor1的酵母細(xì)胞中硼含量只有對(duì)照的70％左右(圖4)，說明osat1是一個(gè)外向的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

其中，本實(shí)施例涉及的培養(yǎng)基配方如下：

(1)sc-u固體培養(yǎng)基：6.7gl^-1ynb+1gl^-1adenine+1gl^-1arginine+1gl^-1cysteine+1gl^-1leucine+1gl^-1lysine+1gl^-1threonine+1gl^-1tryptophan+0.05gl^-1asparticacid+0.05gl^-1proline+0.05gl^-1histidine+0.05gl^-1serine+0.05gl^-1isoleucine+0.05gl^-1tyrosine+0.05gl^-1methionine+0.05gl^-1valine+0.05gl^-1phenylanine+20gl^-1d-glucose+15gl^-1agar。

(2)sc-u液體培養(yǎng)基：6.7gl^-1ynb+1gl^-1adenine+1gl^-1arginine+1gl^-1cysteine+1gl^-1leucine+1gl^-1lysine+1gl^-1threonine+1gl^-1tryptophan+0.05gl^-1asparticacid+0.05gl^-1proline+0.05gl^-1histidine+0.05gl^-1serine+0.05gl^-1isoleucine+0.05gl^-1tyrosine+0.05gl^-1methionine+0.05gl^-1valine+0.05gl^-1phenylanine+20gl^-1d-glucose。

(3)sc-u誘導(dǎo)培養(yǎng)基：6.7gl^-1ynb+1gl^-1adenine+1gl^-1arginine+1gl^-1cysteine+1gl^-1leucine+1gl^-1lysine+1gl^-1threonine+1gl^-1tryptophan+0.05gl^-1asparticacid+0.05gl^-1proline+0.05gl^-1histidine+0.05gl^-1serine+0.05gl^-1isoleucine+0.05gl^-1tyrosine+0.05gl^-1methionine+0.05gl^-1valine+0.05gl^-1phenylanine+20gl^-1d-galactose。

實(shí)施例4不同濃度硼處理轉(zhuǎn)基因植株鑒定目的基因的功能

選擇已經(jīng)純合的轉(zhuǎn)基因種子和野生型水稻中花11種子萌發(fā)后，利用木村b營(yíng)養(yǎng)液(調(diào)ph為4.8)培養(yǎng)水稻至4葉期，分別用不同濃度的硼酸處理3周，處理溶液分別為木村b溶液去掉硼酸，木村b溶液和木村b溶液中加入至終濃度460微摩爾的硼酸，圖5和圖6的分析結(jié)果表明：硼酸處理后，osat1過量表達(dá)植株高度明顯變矮，千粒重變小，只有未加硼的60～70％；而osat1干涉植株與野生型植株高度在硼處理后差異不大，osat1干涉植株的千粒重比野生型植株略高。

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)分析均采用excel軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后用spss19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各平均數(shù)的多重比較采用最小顯著差數(shù)法(lsd)，比較結(jié)果采用字母標(biāo)記法標(biāo)記，相同字母的兩組數(shù)據(jù)之間未達(dá)到5％顯著水平，標(biāo)記不同的兩組數(shù)據(jù)之間達(dá)到5％顯著水平。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>水稻osat1蛋白在改善植物硼含量中的應(yīng)用

<130>1

<160>18

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2587

<212>dna

<213>oryzasativajaponica

<400>1

gggtgtacacatcatcctcatcaatgagtagagagaagagtagagggtagtagagagcca60

aaaaaaatcgatcatggagaggccatgtggagctcgccaagtgtgagcatttaccttctt120

ggaaagaatcccaagctagaaatccacagaattatctgctctcaaacattggctcatctg180

ctcaacaatcctatcctcctcctcctcctcactggcagtgattcccccaaccccatttct240

ctctgaattgggcttgtttctttgctgaattattattttgctcattccactctggttgct300

tgttcagagactccatgtacaattagttgaccattcttctagttagcttctcttgtgttc360

ttggagttggagctggtctgtccatgtgagccatgttgcagattgggctagctttgggag420

caagagagtggtagatcttcttcttgccagatttattgtagatacaatacaatcccattt480

cttgttcagatttcttggtgaaaattcctagctagatccatactttctccagtgtagtgt540

gtagagaagaagaggccttgtgaatcttatcttgggaaaaagaggtatatccatccaccc600

atctgtgtgctgttcttgattggcggcaatggcgatggagccgacggtgaaggtggcgct660

ggggacggcggcgttcgggatcttctgggtgctggcggtgttcccggcggtgccattcct720

gccgatcgggaggacggcggggtcgctgctgggcgcgatgctgatggtgctgttcggcgt780

gatgtccgccgacgaggcgtacgccgccgtggacctccccatcctcggcctcctgttcgg840

caccatggtggtgagcgtctacctggagcgcgccgacatgttcaagcacctcgggaggct900

gctgtcatggcggagccagggcggcaaggacctgctcgtccgcacctgcgtcgtggcggc960

gctcgcgtcggcgctcttcaccaacgacacctgctgcgtcgtgctcaccgagttcatcct1020

caagatcgcgcggcagaacaacctcccgcccaagccgttcctcctggcgctcgcgtccag1080

cgccaacatcggctccgccgcgacgcccatcggcaacccgcagaacctggtcatcgccgt1140

ccagagcggcatctccttcggccagttcgtgttcggcatcctcccggccaccctcgtcgg1200

cgccgtcgtcaacgccgccatcctgctctgcctctactggcgccacctctccgacgagaa1260

gtgcgtcgaggtcgtcgccccggtccccaccgacgtcgtcgaagaggaggacgtcacctc1320

ccaccgcttctcgccggcgaccatgtcacacccccgttcctcctcccaccaccaccacca1380

ccagcagcctggcagctcgctgtcgtcgcctgactgcgaggtgttcgagccagtgaagcc1440

cgtccctgtcaccagcaatggcgactccaacaacaagccggacgccgccgacgccgccgt1500

cgtcgtcgggatccaccagaggcgcggcggcgtcggcggcggcgtgaggatgaaggagga1560

acatgcgttccggtgggtggaggagaaggaggaggccatggagcaatggaagagcacggt1620

gtggaagacgggtgtgtacgtcatcacattgagcatgctggtggcgctgctgttgggtct1680

caacatgtcatggagcgccatcaccgccgcactcgccctcatcgtcctcgacttcaagga1740

tgcccgcccctgcctcgagaaggtttcctatccacttctactcttcttctgtgggatgtt1800

catcactgtggatggattcaacaagacgggcattcctagcgcattctgggaattcatgga1860

gccctatgcacggatcgatacaccgaccgggatagtaatcctcgccctggttattcttct1920

cctctcaaatgtggcgtcaaatgttccaactgttctcctgcttggtgctcgggtggcagc1980

gtcagcagcggccatctcccctgcagcagagaccaatgcctggctcatcctggcctgggt2040

cagcacggtggccggcaacctctccctccttggctccgccgcgaacttgatcgtttgcga2100

gcaagctcgcaggtcggagcagtacggatacaccctctccttcttcagccacctccagtt2160

cggcttcccggcgacgctcatcgtcaccgggattggcctactgctcatcagaagcaactg2220

aaaaatggtacagaacatatatatgaagaagacatggatatcaggacatgtacaaaaaga2280

atgtgaattttcaggtcaggtcgattgtatttctgcaaagattcaattgtgggataaaag2340

aaaaatgtctatctttgcctcggaattaagcacggatatcatggtgcttggaggcttttt2400

gagctgtacatttgttagttcatattggggggagaagatgtatatgttgcagtagcaagg2460

atcataaaagggaaatgtatatttttgttcagcattctacttgtaatccatatatatttt2520

ttgaagtcgaataatttgtataggcaggagaagagaaaatcaatgaaatgcatgccccta2580

tcgatgc2587

<210>2

<211>530

<212>prt

<213>oryzasativajaponica

<400>2

metalametgluprothrvallysvalalaleuglythralaalaphe

151015

glyilephetrpvalleualavalpheproalavalpropheleupro

202530

ileglyargthralaglyserleuleuglyalametleumetvalleu

354045

pheglyvalmetseralaaspglualatyralaalavalaspleupro

505560

ileleuglyleuleupheglythrmetvalvalservaltyrleuglu

65707580

argalaaspmetphelyshisleuglyargleuleusertrpargser

859095

glnglyglylysaspleuleuvalargthrcysvalvalalaalaleu

100105110

alaseralaleuphethrasnaspthrcyscysvalvalleuthrglu

115120125

pheileleulysilealaargglnasnasnleuproprolysprophe

130135140

leuleualaleualaserseralaasnileglyseralaalathrpro

145150155160

ileglyasnproglnasnleuvalilealavalglnserglyileser

165170175

pheglyglnphevalpheglyileleuproalathrleuvalglyala

180185190

valvalasnalaalaileleuleucysleutyrtrparghisleuser

195200205

aspglulyscysvalgluvalvalalaprovalprothraspvalval

210215220

gluglugluaspvalthrserhisargpheserproalathrmetser

225230235240

hisproargserserserhishishishishisglnglnproglyser

245250255

serleuserserproaspcysgluvalphegluprovallysproval

260265270

provalthrserasnglyaspserasnasnlysproaspalaalaasp

275280285

alaalavalvalvalglyilehisglnargargglyglyvalglygly

290295300

glyvalargmetlysglugluhisalapheargtrpvalgluglulys

305310315320

gluglualametgluglntrplysserthrvaltrplysthrglyval

325330335

tyrvalilethrleusermetleuvalalaleuleuleuglyleuasn

340345350

metsertrpseralailethralaalaleualaleuilevalleuasp

355360365

phelysaspalaargprocysleuglulysvalsertyrproleuleu

370375380

leuphephecysglymetpheilethrvalaspglypheasnlysthr

385390395400

glyileproseralaphetrpgluphemetgluprotyralaargile

405410415

aspthrprothrglyilevalileleualaleuvalileleuleuleu

420425430

serasnvalalaserasnvalprothrvalleuleuleuglyalaarg

435440445

valalaalaseralaalaalaileserproalaalagluthrasnala

450455460

trpleuileleualatrpvalserthrvalalaglyasnleuserleu

465470475480

leuglyseralaalaasnleuilevalcysgluglnalaargargser

485490495

gluglntyrglytyrthrleuserphepheserhisleuglnphegly

500505510

pheproalathrleuilevalthrglyileglyleuleuleuilearg

515520525

serasn

530

<210>3

<211>2000

<212>dna

<213>oryzasativajaponica

<400>3

caaacatgctcactaattaaattgtgagagggcgaagcagaagtgatcaacttccaaact60

tgtggtaaccaatcagtaacaggaactgtcgtcacaggttatactaccatagcaccatat120

cttttatttctctataacctatatgagatgcaatcgtatataatcattatcgacccatct180

ggttatagataaatgctagttttgactttgagttgttctacttcgaacaatatttttttt240

aataatttaactatttagcattaaaattatgccattagatttgtaaccagaaatagttta300

ctagtactatcttacatttaaatatattcgctttgatatcacttagaagcaactgttgaa360

attcatctactatatttgtttttttaatacataacgttattaacttttgaaataatgttt420

gatcattcgcattatttaaaaatttactcctttcattttatattgtaagtcgttttggct480

ttttcctagtcaaactcgtttaagtttgactaaatttttggaaaatctaaaataccgaat540

tggttttatttaatctagcattgaatatattttgataatatgctattataattttctata600

tactcggtcaaactcaaataaagttgactaaaaaaaagttaaaacgacttacaatatgaa660

acgaacggaataatatagatatgttaagatataagttatacttaaagtttatttaaagat720

aaaacaagtcatatcaaaataaatcatatttatatatattataaatggacataggaagta780

caatacttgtgttgagatccgtcaattatttattaacagagaaagtataatgcctttata840

ttagagtataaataaaatgcccctaagtgtgaatttagtgatataatattcacgtagaca900

atttagctgagtttgttatattggtgaacaagctgatgaagaggcatgaggtaataattc960

atctgaatatgttactagtagtagttagtgatattttaagactcagcagagggtgagaaa1020

cgttccacccatgcatctctttgcctgtcaattagtgacaataatagtatacaaaaatca1080

gctgatatgaaagcaacattcttacatgtggcggtgaatcatcgttaccaagtaaaaaaa1140

actctgtggtaataacatgatcgtattgtcaagtttccaggagaaattctcaaatataaa1200

cccagaaatcaaacattttattccttgtgcagctaggatccaatagagacatgtctgtag1260

taatcatgttcatgtaaacaaatgaggtgagcagaccgcagcgagtgagctcacatgcgc1320

caaccatttttctgcacatgaaaatacaagaatgtttttttcttttttctttgggtgtac1380

acatcatcctcatcaatgagtagagagaagagtagagggtagtagagagccaaaaaaaat1440

cgatcatggagaggccatgtggagctcgccaagtgtgagcatttaccttcttggaaagaa1500

tcccaagctagaaatccacagaattatctgctctcaaacattggctcatctgctcaacaa1560

tcctatcctcctcctcctcctcactggcagtgattcccccaaccccatttctctctgaat1620

tgggcttgtttctttgctgaattattattttgctcattccactctggttgcttgttcaga1680

gactccatgtacaattagttgaccattcttctagttagcttctcttgtgttcttggagtt1740

ggagctggtctgtccatgtgagccatgttgcagattgggctagctttgggagcaagagag1800

tggtagatcttcttcttgccagatttattgtagatacaatacaatcccatttcttgttca1860

gatttcttggtgaaaattcctagctagatccatactttctccagtgtagtgtgtagagaa1920

gaagaggccttgtgaatcttatcttgggaaaaagaggtatatccatccacccatctgtgt1980

gctgttcttgattggcggca2000

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物osat1-f1

<400>4

acgaagcttgttcttgattggcggcaatg29

<210>5

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物osat1-r1

<400>5

actacgcgttcagttgcttctgatgagcag30

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物osat1-f2

<400>6

aacagagctcatcctgctctgcctctactg30

<210>7

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物osat1-r2

<400>7

ccacaagcttccagcatgctcaatgtgatg30

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物1

<400>8

ctgaactcaccgcgacgtctgtc23

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物2

<400>9

tagcgcgtctgctgctccataca23

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物actin-f

<400>10

gccacactgtccccatctatg21

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物actin-r

<400>11

aggtcgagacgaaggatagcat22

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物at1-f

<400>12

cgtcacctcccaccgcttct20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物at1-r

<400>13

tggtgacagggacgggcttc20

<210>14

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物osat1-f3

<400>14

tatcaagcttgcaatggcgatggagccgac30

<210>15

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物osat1-r3

<400>15

gtcagagctcttcagttgcttctgatgagc30

<210>16

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物osbor1-f1

<400>16

cacgggtaccaaaatggaggagagcttcgt30

<210>17

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物osbor1-r1

<400>17

gactctcgagcttcactttggtgttgatcc30

<210>18

<211>2828

<212>dna

<213>oryzasativajaponica

<400>18

attgccctctgagtctctgaaatcctgaagcttcttcttcttcttccttcctcctcttgc60

tctcttgctcttcctatgctagcactctccatgctcttcttgcccttgtagcattggctc120

cttggtttccatccatggatccacgctaaatgcattgcgaggctgcaaattggtagcatt180

cccttccccgttgcatctgctgcaactatgtaagcaggagtgtctgatttgacacgcctg240

aatacagcttctcagatcttcagttttgttgtttgtctgagaaaaggagagagagagagg300

cctcttttgggtccaagaagagaaaaatggaggagagcttcgtgcccctccgtggcatca360

agaacgacctccatgggaggctccagtgctacaagcaggattggaccggaggattccgcg420

ccggtatcaggatccttgcgccgaccacctacatattcttcgcttcggccataccggtga480

tatcgttcggagagcaattggagaggaacactgatggtgttctgacagcagttcagacat540

tggcatccactgcactttgtggcataatccactcctttcttggagggcagcctctgctga600

tcctcggtgtggccgagccgacggtgctcatgtacacattcatgttcaactttgccaagg660

acaggcctgatcttggaaggaggctgttcctcgcatggaccggttgggtttgtgtctgga720

cagcaattttgctgttcttgctggcgatactaggcgcgtgctcgatcatcaaccggttca780

cccgcatcgcgggtgagctgtttgggctcctgattgcaatgctcttcatgcagcaggcta840

tcaaggggcttgttgacgagttccgcatccctgagagggagaacagaaaggcattagagt900

ttgtttcatcatggaggttcgccaacggaatgtttgctatcgtcttgtcgtttggccttt960

tgctcactgcactgcggagcaggaaggctcgatcatggcgctatggaacaggttggctcc1020

gtggcttcatcgccgactatggtgtcccactgatggtgctagtatggacaggagtttcct1080

acattccatatggtagtgttccaaaaggaattccacggcgccttttcagccccaacccat1140

ggtcccctggtgcatatgataattggacagtcatcagggacatgccaaatgtgccactcc1200

tctacattattggtgccttcataccagcaacgatgatagccgtcctgtactacttcgatc1260

acagtgttgcttctcagcttgctcagcagaaggagttcaatttgaggaagcccccatctt1320

tccattatgatttgcttctcctgggtttcctgacattattgtgtggccttattggtatcc1380

ctccggcgaatggtgtcattccacagtctccaatgcatacgaagagtttggctactctca1440

aacatcaactactccgtaaccgactagtagccacagcccgacaaagcatgagccagaatg1500

cgagcttgagccagctgtatggcagcatgcaggaagcttaccagcagatgcagacaccac1560

tgatttaccagcaaccgtcagtcaagggattgaatgagctcaaggactcaacagtccaaa1620

tggcttcaagcatgggcaacatcgatgcgccagttgatgagacagtctttgacatcgaga1680

aagaaatcgatgacctgctgcctatcgaggtcaaggagcagaggttgagcaacttgctcc1740

aggccacaatggttgggggttgtgttgctgctatgccattgctcaagaagatcccgactt1800

ctgtcctctggggctacttcgccttcatggccattgagagcttgcctggtaaccagttct1860

gggagaggatcttgctgctcttcactgctcccagcagaagatacaaggtgttagaagagt1920

accacaccacgtttgtcgagaccgtgccattcaagacgatagccatgttcacactcttcc1980

agacaatgtatctactcgtctgcttcgggatcacatggatcccgattgctggggttcttt2040

tccccctcatgatcatgctgctggttccagtcaggcagtacatcctcccaaagctcttca2100

aaggtgcacatctgactgatctggatgcagcagagtatgaggagtcaccagctataccgt2160

tcattgccgcgcaagatattgatgttgcattggcgcgcacccagagtgcagaaatccttg2220

atgacattgtcactagaagccgtggtgaaatcaagcgcctgaacagtcctaagatcacca2280

gctccggtggcacaccagtggcagaacttaaaggaatccgcagcccttgtatctctgaga2340

gggcatacagcccttgtatcaccgagttgaggcatgaccgcagccctctaggaggaagag2400

gcagcccaaggaccggtgagacccgatcgtccaagttgggcgaaggatcaacaccaaagt2460

gaagcaagaatgatgcactgctcatatgagctatgcaactacctgaaatcagctatacta2520

atgatttctgtataactatggcgtacggttatatgatgtcttatgatcaagtatcaagta2580

tgagtctatgagaatgtttatgtatatctctagcctagtatatcaccccttcctcttttt2640

ttggtgtatttcctgatttggagcaccatatgtgtaatctctgaactaccagaatattag2700

agtgactacttggtaaccttttgagtttcatttgctaaattcctgtcagaacttgtggat2760

gattcatactgaaaactatttgtattcattaattctttaaaagaaacaggattatagttg2820

gcatcctt2828