本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種新型恒溫pcr-反向斑點雜交基因檢測方法。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈式反應(yīng)是一種用于放大擴增特定的dna片段的分子生物學技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊dna復制，pcr的最大特點，是能將微量的dna大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸、皮膚或血液，只要能分離出dna，就能用pcr加以放大，進行比對。

現(xiàn)代分子生物學技術(shù)發(fā)展迅猛，以聚合酶鏈反應(yīng)為代表的基于核酸的檢測技術(shù)發(fā)展更為迅猛，然而pcr技術(shù)一直無法擺脫精密儀器設(shè)備的依賴、高潔凈度要求的操作條件、反應(yīng)時間過長等局限。此時以核酸等溫擴增技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展。等溫擴增技術(shù)(isothermalamplificationtechnology)是一種核酸體外擴增技術(shù)，其特點是反應(yīng)過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加不同活性的酶和特異性引物來達到快速擴增核酸的目的。與pcr相比，核酸等溫擴增對儀器設(shè)備的要求大大降低，反應(yīng)時間也大大縮短。目前技術(shù)較為成熟的等溫pcr包括環(huán)介導等溫擴增、依賴解旋酶等溫擴增、依賴核酸序列等溫擴增。

依賴核酸序列等溫擴增是一種以rna為模板的基于rna序列的核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)的基本原理是將基因的體外逆轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄過程偶聯(lián)起來根據(jù)靶rna3端序列，帶有t7啟動子的特異引物，在該引物和逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成rna-cdna雜交分子，接著t7rna聚合酶以帶有t7啟動子的cdna為模板，大量轉(zhuǎn)錄mrna，新生成的mrna在另一個特異引物的作用下，再次逆轉(zhuǎn)錄為cdna，此時新產(chǎn)生的cdna為第二特異引物和t7啟動子間的序列片段。經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄之間不斷往復的循環(huán)過程，最終能產(chǎn)生大量的單鏈dna。

反向斑點雜交是指將樣品點在支持膜上進行分子雜交的技術(shù)。如將核酸點在能與核酸結(jié)合的膜(如硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚偏氟乙烯膜等)上，經(jīng)處理(如80℃烘烤、紫外光照等)使核酸固定在膜上，然后與標記探針進行分子雜交，用放射自顯影或非放射性顯色檢測?？勺鞫ㄐ曰虬攵糠治?。

目前在基因檢測方面多采用測序或熒光pcr技術(shù)進行檢測，但測序方法周期長，所需儀器成本高，操作環(huán)境要求嚴格，熒光pcr技術(shù)也有所需儀器成本高，操作環(huán)境要求嚴格等缺點，且pcr產(chǎn)物為dna，容易造成環(huán)境的污染，進而產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種新型恒溫pcr-反向斑點雜交基因檢測方法。

本發(fā)明將恒溫pcr與反向斑點雜交技術(shù)相結(jié)合，以rna為模板進行恒溫pcr擴增，并對擴增產(chǎn)物進行反向斑點雜交檢測。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提供一種新型恒溫pcr-反向斑點雜交基因檢測方法，包括恒溫pcr反應(yīng)體系方法和反向斑點雜交體系方法。

所述的恒溫pcr反應(yīng)中，pcr反應(yīng)液中上游和下游引物濃度均為200nm。

所述的pcr反應(yīng)液中還包含有10×reactionbuffer、t7rna聚合酶、rntps、10×pcrbuffer、mmlv、rnasin。

所述的t7rna聚合酶反應(yīng)終濃度為25-100u。

所述的rntps反應(yīng)終濃度為15-25mm。

所述的mmlv反應(yīng)終濃度為20-60u。

所述的rnasin反應(yīng)終濃度為10-30u。

所述的10×pcrbuffer反應(yīng)終濃度為1×pcrbuffer。

所述的pcr反應(yīng)程序為37-50℃，35-55min。

所述的分子雜交體系方法包括以下步驟：

(1)含有不同特異性檢測探針的尼龍雜交膜的制備。

(2)將固定有不同檢測探針的尼龍膜置于雜交管中，加入1.5ml雜交液。

(3)向雜交液中加入10ul擴增產(chǎn)物，110rpm下，室溫雜交100min。

(4)棄雜交液，用洗滌液洗膜15min，洗2次，每次8min。

(5)棄洗滌液，加入1100倍稀釋的堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素，室溫反應(yīng)25min。

(6)棄去酶液，用洗滌液洗膜15min，洗2次，每次8min。

(7)棄去底物，采用去離子水終止反應(yīng)，待膜干燥后判定結(jié)果，出現(xiàn)藍紫色斑點的為陽性結(jié)果，無斑點的判定為陰性結(jié)果。

所述的雜交液含有1×sspe、0.1％sds、25％甲酰胺。

所述的洗滌液含50mmtris-hcl(ph7.5)、150mmnacl。

所述的特異性檢測探針采用生物素進行標記。

本發(fā)明的有益效果是：本試劑盒有效的將恒溫pcr和反向斑點雜交相結(jié)合，操作簡單、快速、靈敏度高且特異性強，對儀器設(shè)備和操作環(huán)境要求低、以rna為pcr擴增模板可有效避免核酸污染造成的假陽性檢測結(jié)果，可有效縮短基因檢測周期和成本，能夠?qū)Ω鞣N基因的rna進行檢測，可應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如基因分型，耐藥性檢測及致病菌檢測等，具有廣闊的應(yīng)用前景。。

附圖說明

圖1為不同基因型bcr-abl融合基因恒溫pcr擴增電泳圖譜。其中a為b2a2基因型、b為b3a2基因型、c為e1a2基因型、d為e19a2基因型陰性對照擴增結(jié)果、e、f、g、h分別為b2a2基因型、b3a2基因型、e1a2基因型、e19a2基因型擴增結(jié)果，m為dl5000dnamarker。

圖2為反向斑點雜交檢測結(jié)果圖。其中a為b2a2基因型、b為b3a2基因型、c為e1a2基因型、d為e19a2基因型檢測結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明將恒溫pcr與分子雜交技術(shù)相結(jié)合，以rna為模板進行恒溫pcr擴增，并對擴增產(chǎn)物進行分子雜交檢測。

所述的恒溫pcr反應(yīng)中，pcr反應(yīng)液中上游和下游引物濃度均為200nm。

所述的pcr反應(yīng)液中還包含有10×reactionbuffer、t7rna聚合酶、rntps、10×pcrbuffer、mmlv、rnasin。

所述的t7rna聚合酶反應(yīng)終濃度為25-100u。

所述的rntps反應(yīng)終濃度為15-25mm。

所述的mmlv反應(yīng)終濃度為20-60u。

所述的rnasin反應(yīng)終濃度為10-30u。

所述的10×pcrbuffer反應(yīng)終濃度為1×pcrbuffer。

所述的pcr反應(yīng)程序為42℃，45min。

反向斑點雜交包括以下步驟：

(1)含有不同特異性檢測探針的尼龍雜交膜的制備。

(2)將固定有不同檢測探針的尼龍膜置于雜交管中，加入1.5ml雜交液(1×sspe、0.1％sds、25％甲酰胺)。

(3)向雜交液中加入10ul擴增產(chǎn)物，110rpm下，室溫雜交100min。

(4)棄雜交液，用洗滌液洗膜2次，每次8min。

(5)棄洗滌液，加入1100倍稀釋的堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素，室溫反應(yīng)25min。

(6)棄去酶液，用洗滌液洗膜2次，每次8min。

(7)棄去底物，采用去離子水終止反應(yīng)，待膜干燥后判定結(jié)果，出現(xiàn)藍紫色斑點的為陽性結(jié)果，無斑點的判定為陰性結(jié)果。

所述的雜交液含有1×sspe、0.1％sds、25％甲酰胺。

所述的洗滌液含50mmtris-hcl(ph7.5)、150mmnacl。

所述的特異性檢測探針采用生物素進行標記。

實施例1

本實施例以bcr-abl融合基因b2a2、b3a2、e1a2、e19a2四種基因型rna為模板進行檢測，對照組在恒溫pcr過程中不加入rna模板。

1.恒溫pcr擴增：

其中恒溫pcr反應(yīng)中，pcr反應(yīng)液中上游和下游引物濃度均為200nm、t7rna聚合酶反應(yīng)終濃度為40u、rntps反應(yīng)終濃度為120mm、mmlv反應(yīng)終濃度為40u、rnasin反應(yīng)終濃度為20u、10×pcrbuffer反應(yīng)終濃度為1×pcrbuffer。

用于擴增b2a2融合基因的上游引物為5’-ggggctctatgggtttctga-3’(seqidno:1)。

用于擴增b2a2融合基因的下游引物為5’-ggacccagtgaaaatgaccc-3’(seqidno:2)。

用于擴增b3a2融合基因的上游引物為5’-ggattcctttgggtattttgtg-3’(seqidno:3)。

用于擴增b3a2融合基因的下游引物為5’-ggacccagtgaaaatgaccc-3’(seqidno:4)。

用于擴增e1a2融合基因的上游引物為5’-cggttgtcgtgtccgaggcca-3’(seqidno:5)。

用于擴增e1a2融合基因的下游引物為5’-ggacccagtgaaaatgaccc-3’(seqidno:6)。

用于擴增e19a2融合基因的上游引物為5’-ctgcccgagcccctcttcactg-3’(seqidno:7)。

用于擴增e19a2融合基因的下游引物為5’-ggacccagtgaaaatgaccc-3’(seqidno:8)。

pcr反應(yīng)液總體積為50ul，pcr擴增程序為42℃，45min。

2.反向斑點雜交：

(1)含有不同特異性檢測探針的尼龍雜交膜的制備，根據(jù)檢測目的，將尼龍膜分為4行4列，以便每一行加相同的檢測探針，檢測探針均采用為生物素標記，每一列加相同的擴增產(chǎn)物。第一列檢測b2a2融合基因的探針為5’-tggatttaagcagagttcaa-3’(seqidno:9)、第二列檢測b3a2融合基因的探針為5’-acgcgcgtctacagggacacagct-3’(seqidno:10)、第三列檢測e1a2融合基因的探針為5’-aacgatggcgagggcgccttccatgga-3’(seqidno:11)、第四列檢測e19a2融合基因的探針為5’-ttctaccccaacttcgcagagggcat-3’(seqidno:12)。

(2)將固定有不同檢測探針的尼龍膜置于雜交管中，加入1.5ml雜交液(1×sspe、0.1％sds、25％甲酰胺)。

(3)向雜交液中加入10ul擴增產(chǎn)物，110rpm下，室溫雜交100min。

(4)棄雜交液，用洗滌液(50mmtris-hcl(ph7.5)、150mmnacl)洗膜2次，每次8min。

(5)棄洗滌液，加入1100倍稀釋的堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素，室溫反應(yīng)25min。

(6)棄去酶液，用洗滌液洗膜2次，每次8min。

(7)棄去底物，采用去離子水終止反應(yīng)，待膜干燥后判定結(jié)果，出現(xiàn)藍紫色斑點的為陽性結(jié)果，無斑點的判定為陰性結(jié)果。

3.實驗結(jié)果：

在pcr擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果中，b2a2(圖1e)、b3a2(圖1f)、e1a2(圖1g)、e19a2(圖1h)融合基因均有單一的電泳條帶，而b2a2(圖1a)、b3a2(圖1b)、e1a2(圖1c)、e19a2(圖1d)融合基因擴增的陰性對照均無擴增產(chǎn)物電泳條帶。對分子雜交結(jié)果進行觀察，其中圖2中a列為b2a2融合基因檢測結(jié)果，b列為b3a2融合基因檢測結(jié)果，c列為e1a2融合基因檢測結(jié)果，d列為e19a2融合基因檢測結(jié)果，均有相應(yīng)雜交信號，說明可對目標基因進行分型檢測。

本發(fā)明的目的在于提供一種新型恒溫pcr-反向斑點雜交基因檢測方法。將恒溫pcr與反向斑點雜交技術(shù)相結(jié)合，以rna為模板進行恒溫pcr擴增，并對擴增產(chǎn)物進行分子雜交檢測。恒溫pcr大大縮短了常規(guī)pcr的反應(yīng)時間，以rna作為模板有效的避免了以dna為模板經(jīng)常出現(xiàn)的實驗環(huán)境污染進而產(chǎn)生的假陽性檢測結(jié)果，采用反向斑點雜交作為檢測方法有效的提高了檢測的特異性，能夠?qū)Ω鞣N基因的rna進行檢測，可應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如基因分型，耐藥性檢測及致病菌檢測等，具有廣闊的應(yīng)用前景。

在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認為是說明性的而非限制性的。

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<110>上海睿玻生物科技有限公司

<120>一種新型恒溫pcr-反向斑點雜交基因檢測方法

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