本申請是申請?zhí)枮?01380038217.5、申請日為2013年7月18日、名稱為“傳感裝置及方法”的中國專利申請的分案申請。

背景技術(shù)：

在過去的二十年中，伴隨著現(xiàn)有可獲得的裝置儀器的測量范圍的增加，在核酸分析，特別是核酸擴(kuò)增和dna測序技術(shù)領(lǐng)域已有了快速發(fā)展。檢測和分析核酸序列的傳統(tǒng)方法主要依賴于熒光核酸染料、熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針、熒光或放射性標(biāo)記的核苷酸。

隨后，一種利用基于半導(dǎo)體的檢測系統(tǒng)，例如離子敏場效應(yīng)晶體管(ionsensitivefieldeffecttransistor)(isfet)分析核酸合成和測序的新方法已被開發(fā)，參見例如我們的pct公布文本wo03/073088。一種離子敏場效應(yīng)晶體管為基礎(chǔ)的平臺，不同于傳統(tǒng)的基于熒光的核酸分析系統(tǒng)，檢測不需要昂貴的光學(xué)儀器或危險的放射性同位素，因此使得該平臺低成本、安全和簡單替換(simplealternative)以用于測序和核酸擴(kuò)增分析。

具體地，已經(jīng)采用測量溶液中離子濃度的isfte通過檢測由反應(yīng)引起的氫離子(h⁺，質(zhì)子)濃度變化以檢測核苷酸結(jié)合到核酸鏈中。

在核酸聚合反應(yīng)過程中釋放出氫離子。例如，如下化學(xué)式i顯示通過dna聚合酶調(diào)解單個核苷酸水解促進(jìn)氫離子釋放：

dntp→dnmp+ppi+zh⁺(化學(xué)式i)

其中dntp為三磷酸核苷，dnmp為一磷酸核苷，z為描述每個核苷酸轉(zhuǎn)交(nucleotideturnover)產(chǎn)生質(zhì)子的平均數(shù)的整數(shù)或分?jǐn)?shù)，h⁺為質(zhì)子和ppi為焦磷酸鹽(離去基團(tuán)或反應(yīng)產(chǎn)物)

可以通過將焦磷酸鹽水解形成兩個正磷酸鹽(pi)驅(qū)動所述反應(yīng)以進(jìn)一步產(chǎn)生更多的氫離子。焦磷酸酶促進(jìn)這種二次化學(xué)反應(yīng)，且描述于化學(xué)式ii中：

ppi→2pi+zh⁺(化學(xué)式ii)

現(xiàn)有的“合成測序(sequencing-by–synthesis)”方法的工作流程可以大體上分為模板制備、測序和檢測，以及數(shù)據(jù)分析。所述第一步驟，模板制備，通常包括無性系擴(kuò)增所述模板以獲得足夠數(shù)量的擴(kuò)增模板以確保在測序步驟中檢測核苷酸合并信號(incorporationsignal)。目前，這種無性系擴(kuò)增步驟通常在與測序反應(yīng)相分離的隔間中進(jìn)行，典型的在分隔裝置(separatemachine)中進(jìn)行。然而，這種兩個步驟的空間上的分離需要熟練技工，按時安排大量人手(highlevelsofhandsontime)，引入增加誤差并可能增加樣品損失，因此降低了對測序的檢測敏感性并提高成本。

通常練習(xí)(standardpractice)是用來擴(kuò)增所述核酸以方便準(zhǔn)確的測序。公知各種各樣擴(kuò)增核酸的方法。實(shí)際上，pct公布文本(wo2008/107014)披露了一種使用固態(tài)(solid-state)ph傳感器，例如isfet，監(jiān)測qpcr的方法。反應(yīng)監(jiān)測是在靶向(核酸)序列存在下，當(dāng)擴(kuò)增進(jìn)行超過了用于克服樣品的緩沖能力的循環(huán)閾值時，借助檢測質(zhì)子釋放所引起的ph變化。其并沒有披露通過合成測序(sequencing-by-synthesis)進(jìn)行序列檢測，僅檢測了擴(kuò)增的自身活性(amplificationactivity)。wo2008/076406a2也公開了在isfet背景下的各種各樣的擴(kuò)增方法，例如橋式擴(kuò)增。

使用isfet用于測定的測序方法也是公知的。us2010/031398a1披露了一種在測序方法中使用的裝置，該裝置包括一組微孔和傳感器，其可以是isfet，所述傳感器具有浮柵結(jié)構(gòu)(floatinggatestructure)，該浮柵結(jié)構(gòu)相應(yīng)地(inturn)具有與分析物分離的設(shè)置在浮柵上方的保護(hù)材料層。保護(hù)材料具有達(dá)到約的厚度。同時提供了制備方法。然而，這些測序方法和關(guān)于dna的預(yù)制備[無性系]的特定過程(distinctprocess)一樣操作。

因此，本發(fā)明一個目標(biāo)是提供一種用于擴(kuò)增和測序的離子敏感裝置，以及用于核酸擴(kuò)增和測序的方法，其克服了或減輕了現(xiàn)有測序方法中存在的不足。

本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是提供用于擴(kuò)增和測序的離子傳感裝置，其克服了來自于需要將擴(kuò)增和隨后的測序兩者在沒有任何空間隔離下相結(jié)合所引起的困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為此在本發(fā)明的第一個方面提供了一種傳感裝置，該傳感裝置包括用于集成樣品中的模板多核苷酸的擴(kuò)增和測序的芯片(chip)，所述裝置包括：

-芯片，所述芯片在阱(well)或室(chamber)中有至少一個isfet；

-擴(kuò)增裝置，所述擴(kuò)增裝置位于所述芯片的表面上用于擴(kuò)增所述模板多核苷酸，且該擴(kuò)增裝置包括至少一個加熱裝置，所述加熱裝置適于在高于室溫的溫度下引導(dǎo)模板多核苷酸的擴(kuò)增；以及

-測序裝置，所述測序裝置用于測序位于所述阱(well)或室(chamber)中的所述擴(kuò)增模板多核苷酸。

根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了一種測定多個模板多核苷酸的序列的方法，該方法包括：

向多個阱提供所述模板，每個阱與isfet相接觸；

任選地，擴(kuò)增所述模板；

使每個阱中的至少一個模板固定；然后

在每個阱中創(chuàng)建無性系種群；以及然后

測序所述阱中的所述模板菌落。

根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供了一種測定多個模板多核苷酸序列的方法，該方法包括：

向多個阱中提供所述多個模板，每個阱與isfet相接觸；

在每個阱的固體襯底上無性系地擴(kuò)增所述模板；以及

測序所述阱中的所述擴(kuò)增模板。

根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，提供了一種用于多個模板多核苷酸的擴(kuò)增和測序的傳感裝置，所述裝置包括：

-半導(dǎo)體芯片，所述半導(dǎo)體芯片具有多個isfet；

-微流體結(jié)構(gòu)，所述微流體結(jié)構(gòu)定義了多個阱，其中每個阱與isfet中的至少一個相接觸；

-擴(kuò)增裝置，所述擴(kuò)增裝置用于擴(kuò)增所述模板多核苷酸，且包括至少一個加熱裝置，所述加熱裝置適于在高于室溫的溫度下引導(dǎo)模板多核苷酸的擴(kuò)增；以及

-其中設(shè)置所述阱以在每個阱中創(chuàng)建無性系種群(clonalpopulation)；

-測序裝置，所述測序裝置用于在每個阱中測序模板菌落。

根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，提供了一種用于對多個模板多核苷酸的擴(kuò)增和測序的傳感裝置，該裝置包括：

-半導(dǎo)體芯片，所述半導(dǎo)體芯片具有多個isfet；

-微流體結(jié)構(gòu)，所述微流體結(jié)構(gòu)定義了多個阱，每個阱與isfet中的至少一個相接觸；

-擴(kuò)增裝置，所述擴(kuò)增裝置用于固定和擴(kuò)增所述阱中的所述模板多核苷酸，且包括至少一個加熱裝置，所述加熱裝置適于在高于室溫的溫度下引導(dǎo)模板多核苷酸的擴(kuò)增；以及

-測序裝置，所述測序裝置用于測序所述阱中的所述擴(kuò)增的模板多核苷酸。

在阱內(nèi)的擴(kuò)增期間，特別優(yōu)選提供可拆卸密封。這樣有助于封閉(例如抑制和隔離)在相鄰的阱中發(fā)生的擴(kuò)增反應(yīng)?？刹鹦睹芊饷狈乐沽嗽跀U(kuò)增期間反應(yīng)之間的蒸發(fā)和交叉污染，因此為最大化的擴(kuò)增效率提供了最佳條件?？刹鹦睹芊饷笨梢詾橐后w或固體材料。液體密封帽可以是礦物油或硅油。固體密封帽可以為耐熱硅墊或熱塑性彈性材料(tpe)。

此處提供用于擴(kuò)增和測序兩個階段都適用的試劑并論述作為各擴(kuò)增和測序裝置的一部分用于遞送它們的裝置。盡管如此，應(yīng)該理解的是，基礎(chǔ)試劑包括所述模板多核苷酸、具有適當(dāng)緩沖器的液體環(huán)境、核苷酸(用于擴(kuò)增和/或測序)源和用于各反應(yīng)的合適的聚合酶。

用于測序所述阱或室中的擴(kuò)增模板多核苷酸的測序裝置包括用作插入物的核苷酸源，例如dntps。而且本發(fā)明因此提供裝置以實(shí)現(xiàn)這個目的。優(yōu)選這些裝置包括核苷酸源，優(yōu)選三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(deoxynucleotidetriphosphates)(dntps)。優(yōu)選所述源包括4個以上的不同的供應(yīng)物(supplies)，每個dntp(datp、dctp、dgtp、dttp和dutp)有一個。在一個實(shí)施方式中，可以為每個datp、dctp、dgtp、dttp和dutp提供一個供應(yīng)物，這樣允許dna或rna模板通過相同的設(shè)備測序。優(yōu)選源或供給物還包括用于所述核苷酸的泵。合適的路線(routing)和控制機(jī)制(controlmechanisms)為已知；參見例如us2010/031391a1中圖8和附隨的描述，特此納入?yún)⒖肌?/p>

用于熱循環(huán)和等溫擴(kuò)增的合適的擴(kuò)增聚合酶包括但不限于taq聚合酶、pfu聚合酶、phusion聚合酶、vent聚合酶、bst聚合酶、沒有外切酶活性的(exo-klenow)聚合酶、phi29dna聚合酶，以及它們的突變體和衍生物?？梢栽谔砑铀鰳悠坊蚰０搴塑账嶂埃缤ㄟ^印刷或測定點(diǎn)位(spotting)在芯片上提供所述擴(kuò)增pols(聚合酶)。優(yōu)選地，在這種情況下，在所述擴(kuò)增完全后還滅活它們?？蛇x擇地，在需要時可以添加它們到在所述芯片中/上的所述擴(kuò)增位點(diǎn)。為此當(dāng)需要時考慮合適的泵、路線和控制裝置。

合適的測序聚合酶(不限于rna或dna聚合酶兩者)包括但不限于沒有外切酶活性的片段dna聚合酶i、t4沒有外切酶活性的(exo-)、therminator、bst聚合酶、phi29dna聚合酶以及它們的突變體和衍生物?？梢栽谔砑铀鰳悠坊蚰０搴塑账嶂埃缤ㄟ^印刷或測定點(diǎn)位(spotting)在芯片上提供所述測序pols(聚合酶)。優(yōu)選地，在這種情況下，在擴(kuò)增期間還滅活它們并當(dāng)擴(kuò)增完成時恢復(fù)活性?？蛇x擇地，在需要時可以添加它們到測序位點(diǎn)(例如所述阱)。為此如果需要考慮合適的泵、路線和控制裝置。

擴(kuò)增可以是借助橋式擴(kuò)增(bridgeamlification)、聚合酶連鎖反應(yīng)、核酸依賴性擴(kuò)增(nucleicacidsequencebasedamplification)(nasba；deimanb等，2002)、鏈置換擴(kuò)增(strand-displacementamplification)(sda；andrasc，2001)、滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircleamplification)(us5714320)，和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loopmediatedisothermalamplification)(lamp)，這些全是本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)。

優(yōu)選地，所述isfet監(jiān)控(momitors)所述擴(kuò)增反應(yīng)。在任何情況下放置所述isfet以便可能在阱處或在阱中檢測測序，這樣當(dāng)在所述阱處也發(fā)生擴(kuò)增時，還可以采用所述isfet監(jiān)控擴(kuò)增。在另一個選擇中，可以在擴(kuò)增期間關(guān)閉所述isfet以節(jié)省能量。監(jiān)控所述擴(kuò)增反應(yīng)允許系統(tǒng)確定當(dāng)在阱中出現(xiàn)合適的大量無性系模板時，可以向控制器反饋確定結(jié)果以改變或停止在阱或所有阱中的擴(kuò)增過程。

在本發(fā)明的進(jìn)一方面，提供了一種測定模板核酸的序列的方法，該方法包括擴(kuò)增樣品中的模板核酸和測序在現(xiàn)有裝置中的擴(kuò)增核酸。其他優(yōu)選的方法步驟為本文中如上且一般性描述的，然而更優(yōu)選的是，在擴(kuò)增前斷裂樣品中的核酸以分解其為有效的尺寸部分(sizedportions)。例如，可以按這種方式測序大的dna分子，甚至整個基因組。

優(yōu)選地，在同一個阱或室中擴(kuò)增和接著測序樣品中的核酸。

在一些實(shí)施方式中，所述傳感裝置具有至少一個固定在每個阱中的寡核苷酸，其中寡核苷酸與多核苷酸不結(jié)合但適合結(jié)合到模板多核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，所述傳感裝置包括設(shè)置的可拆卸密封以覆蓋微流體結(jié)構(gòu)的表面，這樣本質(zhì)上使每個阱與相鄰的阱隔離。

在一些實(shí)施方式中，固體可拆卸密封為柔性膜或粘合劑例如壓敏材料粘合劑。

在一些實(shí)施方式中，設(shè)置所述裝置，這樣每個模板的擴(kuò)增發(fā)生在與該模板測序相同的阱中。

在一些實(shí)施方式中，采取方法對所述傳感裝置的每個阱的表面修飾以固定寡核苷酸。還可優(yōu)選的是一種傳感裝置，在該裝置中在每個阱中僅可獲得單一的寡核苷酸以與樣品中的模板多核苷酸雜交。在一些實(shí)施方式中，可以使用微珠作為用于固定擴(kuò)增核酸的表面。

所述裝置可以包括加熱裝置，其中所述加熱裝置為集成在芯片中的電阻加熱單元，在一些實(shí)施方式中從一個以上的金屬層形成的路徑。

在一些實(shí)施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括步驟如下：

-向所述阱提供所述模板，按照模板與阱的比率為1:0.4-2，優(yōu)選約為1:1；

-向所述阱提供密封以在所述模板的擴(kuò)增期間隔離相鄰的阱；

-在所述擴(kuò)增模板測序前去除所述密封。

在一些實(shí)施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：

在每個阱中提供單一的模板結(jié)合位點(diǎn)；

向所述阱提供密封以在所述模板的擴(kuò)增期間隔離相鄰的阱；以及

在所述擴(kuò)增模板測序前去除所述密封。

所述單一的模板結(jié)合位點(diǎn)可以在微珠上，在一些實(shí)施方式中，其中或者(a)通過僅足夠大到結(jié)合一個微珠的結(jié)合位點(diǎn)，將所述微珠結(jié)合到每個阱的表面，或者(b)篩選所述微珠以便于僅一個這樣的微珠可以適應(yīng)進(jìn)入每個阱。

在又一個實(shí)施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括在與每個阱相接觸的電極上控制電荷，以吸引模板到每個阱的步驟，在一些實(shí)施方式中其中在每個阱中的單個電極上的電荷被去除或在檢測結(jié)合到該阱表面的模板時被反轉(zhuǎn)。

在一個實(shí)施方式中，優(yōu)選所述寡核苷酸為序列特定以便將一個以上的目標(biāo)模板型鏈結(jié)合到單個固體襯底。

在一些實(shí)施方式中通過用蠟覆蓋所述寡核苷酸可以隔絕固定在所述阱表面或者在所述阱內(nèi)的所述寡核苷酸。在一些實(shí)施方式中在從阱中清洗未結(jié)合的模板后可以通過加熱蠟去除隔絕的固定的寡核苷酸。

優(yōu)選所述方法進(jìn)一步包括向每個阱提供多個具有進(jìn)一步結(jié)合位點(diǎn)的微珠的步驟，所述結(jié)合位點(diǎn)用于結(jié)合在阱中的所述模板的無性系擴(kuò)增。

優(yōu)選所述方法進(jìn)一步包括在測序前從所述阱中清洗去除未結(jié)合的模板的步驟。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種傳感裝置，該傳感裝置包括用于集成模板多核苷酸的擴(kuò)增和測序在樣品中的芯片，該裝置包括芯片，該芯片在阱或室中具有至少一個isfet；擴(kuò)增裝置，該擴(kuò)增裝置用于在所述芯片表面上擴(kuò)增模板多核苷酸且包括至少一個加熱裝置，該加熱裝置適于在高于室溫的溫度下引導(dǎo)擴(kuò)增模板多核苷酸；以及測序裝置，該測序裝置用于測序在所述阱或室中的擴(kuò)增的模板多核苷酸。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種測定模板核酸的序列的方法，該方法包括擴(kuò)增樣品中的模板核酸測序且隨后測序擴(kuò)增的核酸，使用根據(jù)任一前述權(quán)利要求的所述裝置。

根據(jù)本發(fā)明的又一的方面，提供一種用于對多個模板多核苷酸的擴(kuò)增和測序的傳感裝置，該裝置包括：

-半導(dǎo)體芯片，所述半導(dǎo)體芯片具有多個isfet；

-微流體結(jié)構(gòu)，所述微流體結(jié)構(gòu)定義多個阱，每個阱與isfet中的至少一個相接觸；

-擴(kuò)增裝置，所述擴(kuò)增裝置用于固定和擴(kuò)增在所述阱內(nèi)的所述模板多核苷酸，且包括至少一個加熱裝置，所述加熱裝置適于在高于室溫的溫度下引導(dǎo)模板多核苷酸的擴(kuò)增；以及

-測序裝置，所述測序裝置用于測序在所述阱中的所述擴(kuò)增的模板多核苷酸。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種測定多個模板多核苷酸的序列的方法，該方法包括：

向多個阱提供多個模板，每個阱與isfet相接觸；

在每個阱中在固體襯底上無性系擴(kuò)增所述模板；以及

測序所述阱中的擴(kuò)增的模板。

附圖說明

圖1是ph檢測系統(tǒng)的剖面圖；

圖2是在同樣的阱中集成核酸擴(kuò)增和測序的一種實(shí)施方式的示意圖；以及

圖3是cmos與isfets、溫度傳感器、加熱器、信號處理電路和模擬向數(shù)字轉(zhuǎn)換一起制造的ic的一種實(shí)施方式的示意圖；

圖4是阱結(jié)構(gòu)的一種實(shí)施方式的剖面圖；

圖5是可拆卸密封的不同實(shí)施方式的示意圖；

圖6是根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的芯片的俯視圖，顯示出了平行線式加熱元件、溫度傳感器和isfet傳感器；

圖7是在圖6的線aa截取的芯片的剖視圖，顯示出了平行線式加熱元件、溫度傳感器和isfet傳感器；

圖8是顯示說明相對于isfet感測器的各種各樣設(shè)置的加熱元件的實(shí)施例；

圖9是根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的芯片的俯視圖，顯示出了像素化(pixelated)的加熱元件、溫度傳感器和isfet傳感器；

圖10是在圖6的線bb截取的芯片的剖視圖，顯示出了像素化的加熱元件、溫度傳感器和isfet傳感器；以及

圖11是根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的加熱器驅(qū)動電路的示意圖。

附圖標(biāo)記說明

71.阱/室

72.頂層金屬電阻加熱器81.isfet傳感器

73.isfet傳感柵82.集成測序芯片

74.第二金屬層83.溫度傳感器

75第三金屬層

76.多晶硅柵

77.柵極氧化層

78.介電層

73.p-襯底

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的發(fā)明人已設(shè)計了結(jié)合兩者(靶向核酸的擴(kuò)增和測序)的方法與裝置，因此提供了一種集成設(shè)備。這種設(shè)計的一個優(yōu)勢為其能夠加速輸出的供應(yīng)(provision)，也就是說所述靶向核酸的序列。另一個優(yōu)勢為集成系統(tǒng)解決了(addresses)許多習(xí)慣通過手工過程和實(shí)驗(yàn)室工具解決的挑戰(zhàn)。另外，這種集成可以加快工作流程的速度以最小化的動手時間并減少樣品損失。此外，以進(jìn)一步自動化的集成系統(tǒng)，將可能把用于測序的應(yīng)用從實(shí)驗(yàn)室的專業(yè)科學(xué)家轉(zhuǎn)移到為專業(yè)人員、護(hù)士或技術(shù)人員使用的更商業(yè)化的環(huán)境。

然而，在結(jié)合擴(kuò)增和測序的步驟中的困難是對于每個的最佳條件可能非常不同，且在儀器間幾乎不存在可以實(shí)現(xiàn)的協(xié)同。通常這些步驟的每一步需要復(fù)雜的儀器，每臺儀器被機(jī)械上、電氣上和生化上優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)它的功能。例如，用于擴(kuò)增的乳液pcr需要混合油和含有未標(biāo)記核苷酸的水性液體以及生物化學(xué)品/裝置以檢測僅有單一的無性系種群的微珠。相反地該測序步驟需要具有標(biāo)記的核苷酸的生物化學(xué)品和裝置以檢測熒光性。而且在測試中使用的帶有儀器提供的全部功能的一次性部分常常相當(dāng)簡單(例如載玻片)。

在一個方面中，本發(fā)明提供了一種方法和裝置，為了降低確定的儀器的復(fù)雜性和通過使用重疊化學(xué)和裝置(overlappingchemistryandapparatus)以結(jié)合過程步驟，該方法和裝置給一次性部分帶來功能。

應(yīng)該理解的是，術(shù)語核酸包括多核酸，例如dna或rna且以單鏈(singlestranded)或雙鏈(doublestranded)形式，視情況而定，其中任意一種為優(yōu)選的。

特此將我們的公開的wo2008/107014的內(nèi)容納入?yún)⒖?，其在多核酸的擴(kuò)增方面是有用的。

雖然根據(jù)上述優(yōu)選的實(shí)施方式已描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施方式僅用于說明，且權(quán)利要求并不限于這些實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)公開的內(nèi)容做出修改和變型，這些修改和變型應(yīng)考慮落入隨附的權(quán)利要求的范圍。不論是以單獨(dú)的形式還是以與本文中公開或說明的任何其他特征的任何適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合的形式，可以將本說明書中公開或說明的每個特征并入本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種用于半導(dǎo)體測序的離子敏感裝置和方法。該方法(approach)能使得無性系擴(kuò)增和無性系擴(kuò)增的核酸(例如dna)的測序兩者在同樣的阱中發(fā)生。因此，優(yōu)選提供一種充分集成的裝置，提供用于樣品測序(sample-to-sequencing)結(jié)果系統(tǒng)的裝置。

所述裝置允許核酸模板(包括通過分離產(chǎn)生的多個不同核酸模板，或其他物質(zhì))的同時無性系擴(kuò)增(優(yōu)選pcr、橋式擴(kuò)增或等溫擴(kuò)增)。所述無性系擴(kuò)增可以發(fā)生在阱中，該阱在感測平臺(sensingplatform)上被空間隔離(即慎重的(discreet))。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于被空間隔離(例如微阱)和密封的多個核酸模板實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的裝置，接下來在同一個阱中準(zhǔn)備所述擴(kuò)增的多個dna用于隨后的經(jīng)合成的測序反應(yīng)。其中使用多個不同的核酸模板，本發(fā)明還提供了用于在每個為了擴(kuò)增的阱中分配單一模板的裝置。本發(fā)明還提供了用于在每個為了擴(kuò)增的阱中分配單一物種的模板的裝置。

半導(dǎo)體芯片

通過在化學(xué)敏感層的表面和反應(yīng)介質(zhì)(即酶/電解液界面)之間產(chǎn)生電荷離子(chargedions)交換的fet功能：

例如，包括氮化硅是有益的，因?yàn)榕c不具有氮化硅可獲得的相比它提供了對ph變化的增加的且更加快速的敏感性。此外，氮化硅幫助保護(hù)fet免受水合作用以及電荷遷移的影響。

非-能斯特響應(yīng)(non-nernstianresponse)考慮了fet的即刻敏感性(immdiatesensitivity)，所述響應(yīng)起因于帶電離子在絕緣門(insulatinggate)氮化硅表面處的快速的質(zhì)子依賴性的結(jié)合與釋放，這將導(dǎo)致跨越氮化硅層的電壓下降(voltagedrop)中的可重復(fù)性變化?？缭降鑼拥碾妷合陆档淖兓cph的變化有關(guān)。使用測試電路(instrumentationcircuitry)監(jiān)測所述電壓下降，從而允許檢測單獨(dú)的核苷酸插入。測量的電壓被稱為臨界電壓(thresholdvoltage)。

在圖1中顯示的一種實(shí)施方式中，離子敏感裝置21可以為在cmos微芯片24上的多個isfet，隨即具有通過歧管26限定的微流體阱25。該cmos微芯片還可以包含一個以上的加熱器22和溫度傳感器23。向與isfet相接觸的阱中添加核酸合成反應(yīng)混合物，該核酸合成反應(yīng)混合物包含核酸模板、一種或多種聚合酶以及一種或多種核苷酸。每個isfet輸出通過信號處理器監(jiān)控的電信號。優(yōu)選isfet包括鈍化層和/或傳感層。這些可以官能化以對質(zhì)子敏感。該傳感層可以由金屬氧化物或金屬氮化物制備，金屬氧化物和金屬氮化物可以選自由al2o3、sio2、si3n4、al2o3、ta2o5、hfo3、wo3、以及超能斯特(super-nernstian)材料組成的組或者這些材料的混合物或者具有不同材料層的層壓結(jié)構(gòu)，每層厚度范圍為1nm-50nm。但核苷酸水解并結(jié)合到生長(growing)的核酸鏈時，將釋放質(zhì)子并通過信號處理器檢測作為isfet電輸出中的變化。isfet的電信號中的變化在核酸合成期間表示核酸的結(jié)合。該裝置可以包含可拆卸的密封帽27。可以將固體密封帽耦合到機(jī)械執(zhí)行器，該機(jī)械執(zhí)行器用以提升至打開位置和降低到密封位置(參見下文對用于阱的不同類型密封帽的進(jìn)一步描述)。

優(yōu)選地，從isfet信號與參考信號之間的差異每個isfet產(chǎn)生一個標(biāo)準(zhǔn)化的輸出信號。更優(yōu)選地，所述參考信號源自于位于不同阱中的芯片上的isfet或fet，其中在混合物中缺少dntp、酶或引物中的至少一個，這樣將沒有反應(yīng)進(jìn)行。因此，在芯片上的任何常見的漂移(drift)或噪音將通過接收(taking)這些信號間的差異而被消除。

圖7示出了與反應(yīng)混合物相接觸的isfet，其帶有浮柵和由氮化硅制備的傳感層(sensinglayer)。

優(yōu)選該裝置包括微流體結(jié)構(gòu)，其可以與芯片集成或連接到芯片。微流體處理流體的精確控制和操縱，該流體被幾何上約束到較小的規(guī)模，通常為μl或pl體積且本領(lǐng)域熟知用于此用途的設(shè)備。該微流體結(jié)構(gòu)可以提供輸送和容納(contain)液體的阱、通道(channels)和歧管。簡單結(jié)構(gòu)的實(shí)施例可以是帶有被提供用于定義通道和阱的洞穴(cavities)的成型塑料件?？蛇x擇地，該結(jié)構(gòu)可以為帶有部分穿孔的平面襯底以定義通道和阱的面，由此形成襯底。該襯底與定義阱或通道的底部的芯片表面連接。pct/gb2013/050832公開了這樣的結(jié)構(gòu)，涉及傳感器盒的部分在此納入?yún)⒖肌＿€可以以半導(dǎo)體鑄件組合該結(jié)構(gòu)，作為在半導(dǎo)體層和金屬接線層的上方的附加層，借此通過刻蝕穿過微流體層定義阱和通道。gb1218356.2公開了這樣的結(jié)構(gòu)，此處納入?yún)⒖?。還可以考慮該襯底或結(jié)構(gòu)為微流體設(shè)備的部分，或形成全部微流體設(shè)備。像這樣，在一些實(shí)施方式中，可以考慮本發(fā)明的裝置包括微流體設(shè)備。

所述阱的作用是容納溶劑且將反應(yīng)副產(chǎn)物接觸到isfet的感測層103。用于全面基因組測序的所述阱的數(shù)量可以約為10^8以上，或者用于一般細(xì)菌鑒定的所述阱的數(shù)量可以約為至少100。優(yōu)選至少100個阱，更優(yōu)選至少1000個阱，最優(yōu)選的至少100,000個阱。

可以借助于泵/壓力源和一個或多個控制試劑流入的可控閥將液體可拆卸密封(密封帽)引入裝置(例如微流體設(shè)備)。在us7948015b2和us2010/0301398a1中描述了這種裝置的一個實(shí)施例(泵/壓力源和控制閥)，特此納入?yún)⒖肌?/p>

在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用油(優(yōu)選礦物油)作為可拆卸密封，此處還涉及作為密封帽，該油可以通過有機(jī)溶劑和預(yù)置的測序緩沖液的多輪交替清洗被去除。醇如甲醇、異丙醇、乙醇、異丁醇為合適的有機(jī)溶劑。其他例如乙醚可以使用?？梢栽趗s7842457b2中找到用于去除礦物油的有機(jī)溶劑的實(shí)施例，特此納入?yún)⒖肌?/p>

在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用了微珠(bead)101。它們可以起到用于捕獲測序用的模板的表面的作用，在測序案例中我們可以稱它們?yōu)椴东@微珠，他們還可以在擴(kuò)增模板的定位(location)上，例如進(jìn)入阱有幫助。此處所使用的微珠可以由許多公知材料制造。這些材料的實(shí)施例包括：無機(jī)物、天然聚合物、和合成聚合物。這些可以包括但不限于纖維素、纖維素衍生物、玻璃石英(glasssilica)、交聯(lián)葡聚糖(例如sephadextm)以及瓊脂糖凝膠。在us7842457b2中進(jìn)一步描述的另外的實(shí)施例，特此納入?yún)⒖?，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。適于共價附著的微珠可以為自然帶磁或不帶磁。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，該微珠為涂覆有鏈霉親和素的聚苯乙烯微珠。該微珠還優(yōu)選為聚苯乙烯。

一般而言，術(shù)語捕獲和固定可以互換使用。作為本發(fā)明申請的目的，我們已使用捕獲位點(diǎn)以覆蓋固定的寡核苷酸，捕獲位點(diǎn)依次遮蓋附著到表面上的引物(或探針)。

優(yōu)選地，所述捕獲微珠和阱尺寸為相對尺寸這樣僅一個微珠可以適合所述阱，盡管所述阱可以容納其他組分，例如試劑、填充微珠和連續(xù)固定給定模板的副本的微珠。

可以憑借化學(xué)基團(tuán)或者通過附著在所述載體表面上的深一層的寡核苷酸將寡核苷酸附著到所述固體載體上(例如微珠或阱的壁)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域所公知的手段實(shí)現(xiàn)寡-核酸或多-核酸附著到所述微珠。例如，核酸的共價化學(xué)附著到微珠可以使用標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)劑例如水溶性碳化二亞胺實(shí)現(xiàn)，可以通過磷酰胺酶結(jié)合(phosphoamidatebond)，將標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)劑用于鏈接dna序列的5’-磷酸鹽與涂覆胺的微珠。同時在現(xiàn)有技術(shù)中有用于術(shù)語寡核苷酸的各種各樣定義，在本申請的上下文中，應(yīng)被采用指核酸的短的延伸(shortstretch)，該核酸可以附著到固體載體上以擔(dān)當(dāng)用于結(jié)合(固定)在阱中的核酸模板的鏈接。該術(shù)語寡核苷酸和引物可交換使用。寡核苷酸與模板核酸雜交。

理想上被擴(kuò)增和測序的模板將為ssdna或rna。當(dāng)與固定的寡核苷酸雜交時這是優(yōu)選的，然而，可以設(shè)想雙鏈dna，其中雙鏈dna含有產(chǎn)生自例如限制性酶消化的“粘性端(stickyends)”。特定方向的粘性端將與固定在微珠或固體載體上的寡核苷酸雜交且可以添加連接酶以在模板和寡核苷酸之間形成共價鍵。

所述核酸模板可以為任意適合尺寸以進(jìn)行體外擴(kuò)增。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述模板的長度約為20-500個堿基對。

可以在擴(kuò)增之前、期間或之后將所述模板附著(例如通過結(jié)扎(ligation)或共價連接)到在阱內(nèi)的固體載體上。該模板或擴(kuò)增模板是在一些步驟中流到阱且創(chuàng)建核酸的無性系種群是在阱中，每個阱一個群體(colony)。如以下將要更多描述的，可以通過在阱中固定單一模板且擴(kuò)增模板或者在阱中固定同樣的模板的種群創(chuàng)建這個種群。這與在阱外建立結(jié)合到微球的無性系種群并將該微珠輸送至阱中的現(xiàn)有技術(shù)形成對照。

還特別優(yōu)選的是，所述裝置，例如所述芯片或微流體結(jié)構(gòu)，包括一個或多個阱以及在“同一個阱中”發(fā)生的擴(kuò)增和測序反應(yīng)(為每個模板)。

所述加熱方法包括加熱器。優(yōu)選有溫度傳感器。還優(yōu)選地，其還可能包括控制器，該控制器提供了在溫度傳感器和加熱器之間的控制回路。例如在使用用于擴(kuò)增的bst聚合酶時，該加熱方法升高溫度至50℃左右，優(yōu)選升高至60℃或甚至65℃，對于使用bst聚合酶的等溫擴(kuò)增60-65攝氏度是最優(yōu)選。設(shè)想更高的溫度，例如升高至70、80或甚至90℃，在需要熱循環(huán)的一些例子中84-98℃為特別優(yōu)選。重要的是，為相關(guān)聚合酶優(yōu)化溫度，或者至少不高于相關(guān)聚合酶變形的臨界值。

所述芯片可以與外部熱環(huán)境接觸，在外部熱環(huán)境中發(fā)生主動加熱和冷卻并傳遞通量循環(huán)(fluxcycle)到所述芯片。

在芯片上加熱

最優(yōu)選地，所述加熱方法包括芯片上加熱元件以及，任選地，還包括芯片上溫度傳感器和/或芯片上溫度控制電路。此外，還優(yōu)選所述加熱器為集成在所述芯片中的電阻加熱元件。

在一種實(shí)施方式中，每個阱可以有分配的一個加熱器和一個傳感器。作為選擇，一個加熱器可以足夠加熱包含10-100個阱的區(qū)域。將加熱器/傳感器安排到阱依賴于陣列中阱的密度。在另一個實(shí)施方式中，該加熱器可以為平行的金屬線，這些金屬線沿著阱的縱列排布且位于阱的下方或在阱之間。在另一個實(shí)施方式中，該加熱器可以為晶體管并且可以同時具有加熱和溫度傳感功能(加熱器-傳感器混合體)。仍在另一個實(shí)施方式中，可以通過熱電效應(yīng)(珀耳帖效應(yīng)(peltiereffect))提供加熱，例如與半導(dǎo)體芯片的表面相連接的熱電加熱泵。在本發(fā)明中所描述的加熱元件在帶有模擬和數(shù)學(xué)控制電路(圖3)的傳感系統(tǒng)中實(shí)施。可以在us7888015b2中找到芯片上加熱器、溫度傳感器和溫度控制電路的進(jìn)一步描述。

在一些實(shí)施方式中，所述芯片為cmos(互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體)芯片。在一種實(shí)施方式中，所述cmos芯片的金屬層的頂部金屬可起加熱器的作用。優(yōu)選地，頂部金屬起電阻式加熱器的作用，其中電阻式加熱器可以包括均勻分布跨越整個芯片的平行線性加熱元件如圖6和圖8中示例說明的，或者跨越部分芯片的平行線性加熱元件。加熱元件的平均分布能夠使跨越芯片表面的均勻加熱成為可能。電阻式加熱元件可以為蛇形、u形、環(huán)形、螺旋形、多邊形或直線(如圖8中實(shí)施例所示)。在一些實(shí)施方式中，該芯片包括像素化的電阻式加熱元件的陣列，其中像素化的電阻式加熱元件可以采用環(huán)形形狀、螺旋形形狀或多邊形形狀。

在一些實(shí)施方式中，所述芯片包括護(hù)圈(guardring)。所述芯片的所述護(hù)圈(即靜電屏蔽)可以起到加熱器的作用。一般地，通過電路整個屏蔽路徑與電源供應(yīng)相連以提供屏蔽，但是在加熱期間重新配置該路徑以連接驅(qū)動電路使電流通過所述路徑。

相對于isfet傳感器、傳感陣列的尺寸和芯片表面設(shè)計一個或多個加熱元件的定位，這樣產(chǎn)生的熱量可以提供跨越模具表面(diesurface)的均勻的加熱并到達(dá)每個單獨(dú)的isfet傳感器。在這樣的實(shí)施方式中，所述加熱元件在cmos芯片的金屬層的頂層金屬層的平面中。作為選擇，如果跨越模具表面的溫度梯度為所需的，可以打開和關(guān)閉每個單獨(dú)的加熱元件以獲得效果。這樣的屬性可以使，例如，需要不同的退火溫度的反應(yīng)混合物的pcr擴(kuò)增在芯片上同時進(jìn)行。

跨越所述芯片的加熱元件的布置取決于每個芯片上isfet的數(shù)量和密度，以及最靠近每個阱的isfet傳感器的數(shù)量。在一個實(shí)施方式中，一行(或列)isfet傳感器和阱夾在(sandwichedbetween)兩個平行的加熱元件之間。在另一個實(shí)施方式中，多行(或列)isfet傳感器和阱夾在(sandwichedbetween)兩個平行的加熱元件之間。類似地，加熱元件可以圍繞一個或多個isfet傳感器和/或阱。

跨越所述芯片的平行的加熱元件的數(shù)量和長度取決于所述芯片的尺寸，例如，對于5mm×5mm的芯片，所述加熱區(qū)域可以由每個加熱元件的平均熱電阻(meanheaterresistance)為50歐姆的8個平行的加熱元件組成，僅通過加熱器產(chǎn)生4w/cm2加熱功率。

可以提供用于加熱器的加熱驅(qū)動器。這個加熱驅(qū)動器可以采用8位的pow寄存器的值(8-bitpowregistervalue)作為其輸入并轉(zhuǎn)化其為跨越加熱器的恒定輸出電壓。在一種實(shí)施方式中，所述加熱器通過連續(xù)控制pow值在0和255之間可以按a類模式(classamode)驅(qū)動。在另一種實(shí)施方式中，所述加熱器通過控制占空度(dutycycle)(pwm模式)或通過控制將加熱器打開(位流模式(bitstreammode))的脈沖流的密度可以按d類模式(classdmode)驅(qū)動。這種設(shè)計的主要優(yōu)勢是為加熱器被控制提供靈活性以便在不同熱環(huán)境中獲得目標(biāo)溫度曲線。

加熱器材料

加熱器金屬的材料為鋁、銅、鎢或其他常規(guī)金屬組合物或合金中的一種或多種。材料的選擇高度依賴于芯片的制備工藝。

加熱器驅(qū)動電路

在一個實(shí)施方式中，加熱器驅(qū)動器包括至少一個獨(dú)立的驅(qū)動階段(driverstage)，其可以通過設(shè)置加熱器驅(qū)動器選擇寄存器(heaterdriverselectionregister)(hdrv)選擇性地打開/關(guān)閉。加熱器路徑(在上面以r表示)分布跨越芯片。在這種配置中，只有一個驅(qū)動階段在真正的閉環(huán)中通過關(guān)閉與加熱器驅(qū)動器的運(yùn)算放大器的負(fù)反饋相連的“sense”運(yùn)行。因此跨越每個加熱器路徑運(yùn)行的電壓由于不匹配將會略有不同，當(dāng)加熱器路徑的剩余部分將以開環(huán)的方式運(yùn)行時(參見圖11)。

在另一個實(shí)施方式中，所有的加熱器路徑為閉環(huán)。這樣做的好處是讓所有n型金屬-氧化物-半導(dǎo)體(nmos)晶體管驅(qū)動器通過由數(shù)字模擬轉(zhuǎn)換器(dac)產(chǎn)生的相同的電源電壓驅(qū)動。通過仔細(xì)分選(sizing)驅(qū)動器晶體管，vds可以設(shè)置的非常小，因此在加熱器驅(qū)動器上的功率損耗可以被最小化。

溫度傳感電路和溫度控制

優(yōu)選地，所述芯片包括一個或多個溫度傳感器；更優(yōu)選地，所述芯片包括均勻分布在芯片上的溫度傳感器陣列。溫度傳感器可以是在襯底上的pn結(jié)或使用更復(fù)雜的電路以實(shí)施正比于絕對溫度傳感器(proportionaltoabsolutetemperaturesensor)(任意一種為電氣工程領(lǐng)域所知曉)。每個芯片的溫度傳感器的數(shù)量依賴于加熱器和isfet傳感器的數(shù)量。在一個實(shí)施方式中，溫度傳感器、加熱器和isfet傳感器之間的比率可以分別為1:1:1。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，溫度傳感器的數(shù)量少于isfet傳感器的數(shù)量，其少于加熱器的數(shù)量。

相對于加熱器和isfet傳感器的位置安置溫度傳感器。優(yōu)選地，該溫度傳感器位于遠(yuǎn)離加熱器的位置。更優(yōu)選地，該溫度傳感器位于不靠近所述加熱器的位置，例如直接在加熱器的下面。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，通過芯片上的溫度傳感器報告的溫度被發(fā)送至外部的微控制器，為了獲得目標(biāo)溫度，在外部微控制器中以閉環(huán)方式執(zhí)行pid(比例微分積分，proportional-integral-derivative)控制運(yùn)算法以控制在芯片上的加熱器。

集成測序芯片的封裝

傳感器芯片可以在引線框架或?qū)訅阂r底上按傳統(tǒng)ic封裝格式封裝，引線框架或?qū)訅阂r底具有設(shè)定的開口(例如阱、室)以與用于dna傳感的芯片表面接觸。包裝物的類型可以為任意的主流或定制的格式，例如clcc、plcc、tssop、qfn、bga、soic等。包裝物的尺寸、材料、設(shè)計的選擇取決于傳感設(shè)備的應(yīng)用和最終的裝配(finalassemble)。

可以理解的是，裝置可以包括熱循環(huán)儀(thermocycler)。在擴(kuò)增期間，該熱循環(huán)儀的溫度在變性、雜交和退火溫度(分別為t1、t2和t3)之間交替。在通過提供充足的冷卻液流量和/或風(fēng)扇轉(zhuǎn)速以獲得一系列的冷卻斜率(coolingramprate)的同時，通過提供所需的充足功率以獲得一系列的加熱斜率(heatingramprate)，優(yōu)選的實(shí)施方式提供這樣的裝置。一些因素影響加熱和冷卻速度的設(shè)計。其中之一為加熱器的電阻，其決定了芯片上加熱器的軌跡的路線和布局。芯片的封裝設(shè)計還可以在加熱和冷卻的斜率中起作用。

優(yōu)選地，用于擴(kuò)增的聚合酶為taq聚合酶。其還優(yōu)選對擴(kuò)增和測序兩者都有用的聚合酶為bst聚合酶。

可拆卸密封

該可拆卸密封，此處被稱為密封帽或密封裝置，適合于密封(容納)反應(yīng)。因此提供了一種密封(容納)反應(yīng)和來自環(huán)境及相鄰阱的反應(yīng)的試劑的裝置。為擴(kuò)增反應(yīng)最優(yōu)選提供可拆卸密封。其還可以用于測序反應(yīng)(并因此單獨(dú)或同時用于擴(kuò)增和測序反應(yīng))，但最優(yōu)選在密封擴(kuò)增反應(yīng)中使用。

所述可拆卸密封可以為液體，例如油、或蠟。如此處所描述的，這可以通過泵應(yīng)用。其可以通過清洗去除，例如用適合的溶液，如文中別處所描述的?？蛇x擇地，該可拆卸密封可以為固體，例如蓋子。這可能由玻璃或其他惰性材料制備，例如上述提及的，或耐熱硅墊，或熱塑性彈性材料(tpe)?？梢酝ㄟ^位于芯片上方應(yīng)用，優(yōu)選通過以合適的控制器操作的電機(jī)驅(qū)動(driven)來降低密封到微流體結(jié)構(gòu)和任選的檢測正確位置的傳感裝置的上表面上。優(yōu)選地該密封包括用于可變形的銜接微流體結(jié)構(gòu)的兼容表面(compliantsurface)。固體可拆卸密封可以通過如上述舉例說明的使用者或電機(jī)去除。

關(guān)于在測序階段使用可拆卸密封，其為優(yōu)先選擇。在不需要之處，可以有核苷酸和清洗的連續(xù)交替流動。這些優(yōu)先在室溫下進(jìn)行，在一些實(shí)施方式中，升高合并的速率，并因此提高測序的速率是期望的，這樣可以使用升高的溫度(高于室溫，即24℃)。在那些例子中，對于測序步驟，可拆卸密封可以是有用的。在測序的升高的溫度下，可以理解的是優(yōu)選固體的可拆卸密封。然而，不包括可拆卸密封的一個原因?yàn)槠淇赡芙档驼w工作流程的速率。用于測序階段的固體可拆卸密封還可能最小化離子擴(kuò)散。

如果擴(kuò)增和測序兩者都需要可拆卸密封，則設(shè)想液體和固體的可拆卸密封的組合。例如，液體密封裝置(可拆卸密封)可用來密封擴(kuò)增反應(yīng)，同時液體或固體的密封裝置(可拆卸密封)可以用于密封測序階段。

在一些實(shí)施方式中，測序反應(yīng)在環(huán)境溫度(例如室溫)下進(jìn)行，液體試劑優(yōu)選在投遞至所述芯片前被外部加熱。這種方法是有效的且還有利于測序，因?yàn)樗鼮榫酆厦?反應(yīng)提供了更優(yōu)化的條件并且還增加了測序期間的結(jié)合比率。

還優(yōu)選地的是，加熱裝置適合于熱循環(huán)。實(shí)際上，熱循環(huán)為優(yōu)選的方法，其中可以設(shè)想用于變性、退火和延伸的步驟。

模板多核苷酸的擴(kuò)增發(fā)生在所述芯片的表面上。可以理解的是，這可以包括許多分離的表面。還可以理解的是，這可以被認(rèn)為是在一個或多個表面的內(nèi)部(in)、上方(on)或表面(at)發(fā)生的。在一種實(shí)施方式中優(yōu)選的是，擴(kuò)增發(fā)生在與芯片相鄰的設(shè)備中，然而在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，這可以在一個或多個(如別處所描述的，但是優(yōu)選數(shù)千個以上)適宜的阱(discreetwell)，例如微阱中發(fā)生。

在前述實(shí)施方式中，核酸的不同片段的擴(kuò)增可以全部發(fā)生在一個室中并隨后流向芯片上的阱中。

在后續(xù)的實(shí)施例中，優(yōu)選在每個適宜的阱(discreetwell)(這樣，優(yōu)選地，每個阱中有平均一個模板)中擴(kuò)增個別的片段。因此優(yōu)選地，模板的擴(kuò)增和隨后的擴(kuò)增的模板的測序發(fā)生在相同的阱中。

可以理解的是，在樣品中含有模板。該樣品為液體且可以包括適宜的緩沖液。如前述提及的，樣品中的核酸模板可以被分離為適合于體外擴(kuò)增的核酸模板的更小片段。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該模板的尺寸約為100-500bp。盡管通過擴(kuò)增生產(chǎn)的模板的精確副本被稱為擴(kuò)增模板，應(yīng)該理解的是，在模板和擴(kuò)增模板之間沒有結(jié)構(gòu)上的差別，一個僅是另一個的副本。術(shù)語擴(kuò)增模板和擴(kuò)增子(amplicon)可互換使用。術(shù)語擴(kuò)增和無性系擴(kuò)增也可互換使用。無性系(clonal)和無性系地(clonally)涉及與給定模板本質(zhì)上相同的副本的核酸種群，從而給定的模板典型地唯一的源自其他模板或核苷酸片段。

術(shù)語模板、核酸模板、模板核酸和模板多核苷酸可互換使用。同時在現(xiàn)有技術(shù)中可能有術(shù)語模板的各種各樣的定義，為了本申請的目的，其應(yīng)該是指可能是在擴(kuò)增期間可能被復(fù)制或在測序期間可能被測序的一段核酸(alengthofnucleicacid)。也就是說，模板為在擴(kuò)增和測序的過程中可能受聚合酶作用的一段核酸。優(yōu)選該模板核酸為dna或rna且可以為單鏈或雙鏈。如果為雙鏈，可以理解的是，必須存在鏈的至少部分分離以允許相關(guān)酶作用?？蛇x擇地，可以使用帶有鏈替換活性的聚合酶。優(yōu)選該模板為單鏈。術(shù)語靶向(target)和模板單鏈可以可互換使用，但本質(zhì)上與用于擴(kuò)增和隨后測序的核酸有關(guān)。該核酸在長度上可以僅是一些堿基且上限可以為許多更高的數(shù)量級，唯一的限定為關(guān)于空間的考慮，例如，阱的尺寸(如果使用)及動力學(xué)限制。在模板被稱為物種的地方，其是指不同于許多不同模板的種群的特定的或唯一的模板。例如經(jīng)受過分離的核酸樣品將包含許多更小的核酸模板片段或換句話說，核酸模板的許多物種。如進(jìn)一步的實(shí)施例，阱可能含有許多單一物種的核酸模板，在其中的案例存在一個具體核酸的多個副本。

測序步驟確定模板多核酸(或它們的至少一部分)的堿基的序列同源性(sequenceidentity)。這些可以包括從頭測序(denovosequencing)，此處缺乏測序的模板的先前驗(yàn)知識(priorknowledge)?？蛇x擇地，可以進(jìn)行靶向測序和重測序，其中例如，確定具體snp的同源性。

可以認(rèn)為該芯片被“集成”。這是因?yàn)槠湓试S在相同的芯片上擴(kuò)增和隨后的測序。該加熱裝置還可以被提供作為該芯片的基礎(chǔ)部分。

參見附圖4，現(xiàn)在將更詳細(xì)地描述一種傳感裝置的阱結(jié)構(gòu)的實(shí)施例。設(shè)置在cmos芯片上的傳感層15被暴露在阱的底表面。二氧化硅阱側(cè)壁4可以由tin或al層14a覆蓋。tin或al層涂覆有agcl，在與阱接觸的表面上，以形成參比電極14。參比電極偏向傳感層之上流體的電位電壓設(shè)置isfet的操作點(diǎn)，這樣可以測量因流體中質(zhì)子的釋放造成的流體電位的變化。優(yōu)選設(shè)置tin或al的層在阱中足夠低這樣當(dāng)阱包含反應(yīng)混合物時可掩蓋參比電極。優(yōu)選地，如在實(shí)施方式中所示，用疏水性材料層13覆蓋阱壁的頂部表面。合適的疏水性材料包括但不限于有機(jī)聚合物或無機(jī)物或納米材料，例如pmma、pe、pp、su-8、或光阻材料、聚對二甲苯(parylene)或其可以為超疏水tio2納米顆粒涂層。在密封過程中該疏水材料幫助破壞阱間液體表面張力因此去除微小空隙，該空隙可能形成和導(dǎo)致交叉污染或液體從阱中蒸發(fā)。阱的密封將在下面詳細(xì)地論述。

如圖5中所示，現(xiàn)將進(jìn)一步詳細(xì)地描述可拆卸密封的實(shí)施方式。在圖5所示的每個實(shí)施方式中都包括一個流通池(flowcell)。該流通池可以與傳感裝置集成作為單一單元(例如實(shí)施方式a、b和d)或者其可以形成單獨(dú)的分離組件(例如實(shí)施方式c)。

圖5的實(shí)施方式a顯示了具有集成的流通池1的傳感裝置。該流通池包括射流閥(fluidicvalves)5，提供進(jìn)口和出口，液體可以通過它們流入和流出阱。每個阱包括傳感層3。阱壁4可以由sio2制得。實(shí)施方式a的阱2沒有密封。

實(shí)施方式b示出了實(shí)施方式a的傳感裝置，其中阱包括用可拆卸液體密封7密封的擴(kuò)增反應(yīng)6。該液體密封優(yōu)選為油，例如礦物油和更優(yōu)選石蠟油或硅油。該可拆卸液體密封可以通過泵或壓力源和一個或多個控制試劑流入的控制閥經(jīng)流通池引入到傳感裝置中。在us7948015b2和us2010/0301398a1描述了這種泵/壓力源和控制閥的實(shí)施例，特此納入?yún)⒖肌?/p>

將油用作可拆卸密封，該油可以通過有機(jī)溶劑和包含合適的清洗劑的預(yù)置的測序緩沖液的幾輪交替清洗去除，這些清洗劑可以為任意的非離子或非離子與陰離子型的混合物或陽離子型或其可以為硅樹脂清洗劑。醇如甲醇、異丙醇、乙醇、異丁醇為合適的有機(jī)溶劑。其他例如乙醚也可以使用。可以在us7842457b2中找到用于去除礦物油的有機(jī)溶劑的實(shí)施例，特此納入?yún)⒖肌?/p>

實(shí)施方式c顯示了傳感裝置和被舉起至打開位置的分離的流通池。使用壓敏膠(psa)8密封實(shí)施方式c的阱。在輕微壓力的作用下psa在粘結(jié)劑和被粘結(jié)物(在這個案例中為阱壁壘的頂面)之間形成結(jié)合。在本領(lǐng)域psa的特性適公知。在阱的頂部應(yīng)用psa層，這樣在psa和阱壁頂面之間建立接觸。向psa施加壓力，這樣在psa和阱壁的頂面之間形成粘結(jié)結(jié)合。可以通過任何形式的外部壓力施加壓力，例如通過使用滾筒或降低與機(jī)械制動器相連的夾具。還可以通過降低在傳感裝置上的流通池9至關(guān)閉位置應(yīng)用壓力。這可以使用機(jī)械制動器實(shí)現(xiàn)。

優(yōu)選地，所述psa的粘結(jié)強(qiáng)度足夠低，這樣當(dāng)需要時可以輕而易舉地去除該psa。優(yōu)選地，所述psa的粘結(jié)強(qiáng)度在0.1-10n/cm2之間。更優(yōu)選地，粘結(jié)強(qiáng)度在0.1-5n/cm2之間。

實(shí)施方式d顯示了具有集成的流通池12的傳感裝置，該流通池12包括在流通池12的流體入口和出口閥之間的柔性非粘性薄膜(flexiblenon-stickymembrane)10。該薄膜優(yōu)選為耐熱硅橡膠墊或熱塑性彈性體。連接到機(jī)械執(zhí)行器的塊狀材料11可以被降低至在薄膜上應(yīng)用均勻的壓力。這將使得薄膜推靠到微流體阱的頂部表面推動以便于密封所述阱。為了拆卸該密封，從薄膜上提起該塊狀材料，使得該薄膜回到其原始位置，提升上述阱(raisedabovethewells)。

生物和化學(xué)反應(yīng)

可以理解的是，在一些實(shí)施方式中，在擴(kuò)增和測序過程中所使用的試劑并不形成裝置的物理部分，例外是擴(kuò)增前固定在阱或微珠(bead)中的任意寡核苷酸。

在一些實(shí)施方式中，這些試劑可以形成裝置(作為可能，例如在外殼中提供)的部分或，與裝置一起，形成成套工具(kit)。像這樣，本發(fā)明還提供了成套工具，該配套元件包括用于模板的擴(kuò)增和測序以及，任選地，文中描述的微珠的試劑和裝置。

微流體設(shè)備的體積(volume)可以為1pl-10μl范圍或大于10μl。在一個實(shí)施方式中，加熱裝置可以允許擴(kuò)增反應(yīng)在微流體設(shè)備中進(jìn)行，在微流體器件中可以獲得用于熱循環(huán)和等溫擴(kuò)增反應(yīng)的最佳溫度和條件，及引物或寡核苷酸的雜交。

可以理解的是，樣品中的核酸模板需要在它們與用于擴(kuò)增和測序的傳感裝置接觸前制備。制備樣品的步驟可以包括，但不限于，細(xì)胞溶解、核酸物質(zhì)(例如dna)的純化、所需區(qū)域(desiredregion)的預(yù)擴(kuò)增、擴(kuò)增子凈化、擴(kuò)增子的斷裂(例如通過超聲、霧化或者通過使用限制酶)、斷裂的最后修復(fù)以及通過連接的通用銜接附著(universaladaptorattachmentvialigation)。當(dāng)是用于制備用于擴(kuò)增或測序的核酸樣品的過程的單獨(dú)步驟的組合時，所有單個步驟均為本領(lǐng)域所熟知。

在一些實(shí)施方式中，離子敏感裝置的阱包括固定的寡核苷酸或結(jié)合到核酸模板的化學(xué)基團(tuán)。該寡核苷酸或化學(xué)基團(tuán)可以被固定在例如微珠的固體載體上和/或固定在阱的壁上。該固定寡核苷酸或化學(xué)基團(tuán)充當(dāng)用于核酸模板的“捕獲位點(diǎn)”。捕獲位點(diǎn)代表固定在能夠結(jié)合到(即“雜交”)或“捕獲”核酸模板的固體載體上的寡核苷酸。

寡核苷酸可以通過結(jié)合到載體表面上的化學(xué)基團(tuán)附著到固體載體(例如微珠或阱的壁)上?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域所知曉的裝置將核酸附著到微珠。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)劑例如水溶性碳化二亞胺完成核酸與微珠的共價化學(xué)附著，該偶聯(lián)劑可以通過亞磷酰胺鍵(phosphoamidatebond)用于將dna序列的5’-磷酸鹽與涂覆胺的微珠連接?？蛇x地，使用類似的化學(xué)過程可以將特定的寡核苷酸與微珠連接。

通過硅烷化、活化和耦合過程可以將寡核苷酸固定在阱壁上?？梢酝ㄟ^誘導(dǎo)sio2的水解進(jìn)行阱壁(sio2)的硅烷化處理(silanisation)?？梢酝ㄟ^使用硅烷例如(3-縮水甘油)醚氧丙基三甲氧基甲硅烷(3-gps)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷((3-aminopropyl)triethoxysilane)、氨基苯基三甲氧基甲硅烷(aminophenyltrimethoxysilane)、(3-疏基丙基)三甲氧基甲硅烷(3-mpts)或鹵化乙酰氨基硅烷(haloacetamidosilanes)實(shí)現(xiàn)硅烷化處理。優(yōu)選地，所述硅烷化處理僅限定到sio2表面且不在傳感層上以避免關(guān)于isfet性能的任何復(fù)雜性(complexities).

可以通過與但不限于二硫二吡啶(dithiobispyridine)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、edc或其他碳化二亞胺(carbodimides)中的一種反應(yīng)活化阱的硅烷化(silanised)表面。優(yōu)選地，活化是通過具有低緩沖能力的化合物以便不在反應(yīng)期間吸收釋放的質(zhì)子。

然后可以將寡核苷酸連接到表面。寡核苷酸容易與活化的硅烷化表面反應(yīng)以在阱表面上變?yōu)楣潭?。在固定之前，寡核苷酸可以是以官能團(tuán)修飾的5’，官能團(tuán)例如胺、-疏基、丙烯酰胺基、羧基、羥基、疊氮化物(azide)或甚至生物素化物。

對固體表面的硅烷化過程的更多細(xì)節(jié)，可以在下面的參考文獻(xiàn)中找到：

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附著在阱壁上的寡核苷酸的密度可以大約為每平方厘米上1微摩(micromolar)至1皮摩(picomolar)的范圍。獲得該密度極大地依賴于硅烷化過程?？梢酝ㄟ^將硅烷化的阱壁與樹枝狀大分子(dendrimericmolecules)或超支化聚合物進(jìn)一步地反應(yīng)提高該寡核苷酸的密度，樹枝狀大分子或超支化聚合物可以提供進(jìn)一步的功能化的硅烷化表面。

優(yōu)選地，在上面所描述的寡核苷酸固定期間，保護(hù)參比電極的敏感的ag/agcl層。這可以是通過用保護(hù)層覆蓋電極的ag/agcl，保護(hù)層例如蠟，其可以在測序期間使用裝置前被去除。

理想擴(kuò)增和測序的模板為ssdna或rna，然而，可以設(shè)想雙鏈dna，其中雙鏈dna含有來自于例如消化的限制性酶的“粘性末端(stickyends)”。特別定向的粘性末端將雜交到固定在微珠或固體載體上的寡核苷酸，并且可以添加連接酶以在模板和寡核苷酸之間形成共價鍵。

可以將該模板在擴(kuò)增前附著到固體載體上，或者可以在擴(kuò)增期間附著。

核酸模板102可以為dna或rna，例如但不限于純化的基因組dna(一般包括cdna)或mrna。核酸模板可以為天然或非天然產(chǎn)生且可以從各種各樣的來源獲得，例如但不限于，體液或組織、細(xì)菌、病毒、或cdna庫。對于rna，優(yōu)選在擴(kuò)增之前將rna逆轉(zhuǎn)錄為dna的初始步驟。

對于從頭測序(denovosequencing)，核酸模板可以使用本領(lǐng)域所公知的標(biāo)準(zhǔn)樣品制備/dna庫構(gòu)建方法制備107(例如來自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(newenglandbiolabs)的nebnext快速dna庫準(zhǔn)備集合4(nebnextfastdnalibraryprepset4))。簡單地，核酸被斷裂、末端修復(fù)、連接通用銜接及用可選的4-8周期的預(yù)擴(kuò)增清理。對于基因特定的擴(kuò)增和測序，其可以包括特定別的突變或snp，可以斷裂核酸接著被清理。對于從頭測序或基因特定測序兩者，特定的斷裂尺寸會被強(qiáng)化。

斷裂的核酸模板105與擴(kuò)增試劑混合，該擴(kuò)增試劑包括dntp、聚合酶以及第一104和第二106引物，該第一和第二引物具有對相關(guān)模板(thetemplateofinterest)的5’和3’區(qū)域的互補(bǔ)序列且每個可能含有唯一的通用銜接序列。將混合物加入到有限稀釋的阱108(為了說明目的)，這樣每個阱平均含有單份的模板。可以將斷裂的核酸模板通過例如液體流的方法投遞到阱中，這樣每個阱平均含有單份的模板。在每個阱中獲得單份的模板的方法將在后續(xù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述。

可以使用熱循環(huán)(例如各種使用熱循環(huán)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcrs))或等溫擴(kuò)增方法(例如滾環(huán)、鏈置換擴(kuò)增(sda))無性系擴(kuò)增109模板。

對于pcr，根據(jù)所需的分析(analysisdesired)的應(yīng)用和水平使用最佳緩沖條件進(jìn)行大于10周期(cycle)、20周期、30周期或40周期的擴(kuò)增。例如，靶向序列分析如用于基因型分型、識別snps、或更簡單測序應(yīng)用的可能需要更少的周期。

對于在阱中進(jìn)行的擴(kuò)增，將在阱中提供固定的寡核苷酸以結(jié)合擴(kuò)增子。在pcr的變性階段期間，分離雙鏈擴(kuò)增子以形成單鏈dna；因此在復(fù)性階段(annealingstage)，部分單鏈dna將以鏈特殊方式雜交到固定的寡核苷酸。在一種實(shí)施方式中，可以改變第一和第二引物的比率以偏向鏈特殊單鏈dna(ssdna)的產(chǎn)品，因此增加了ssdna雜交到固定寡核苷酸110的可能性(例如，如果優(yōu)選第二引物特殊ssdna，第一引物和第二引物的比率可以設(shè)置為大于1:1、1:4、1:8或者大于1:50)。

然后，使用雜交的ssdna作為模板，固定寡核苷酸可以作為引物以延伸核酸。變性、復(fù)性和延伸的重復(fù)循環(huán)被用于(無性系)增加阱中模板的復(fù)制數(shù)量，且這些副本被固定在固體載體上，即位于阱中的表面。

在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增模板的量可以通過isfet傳感器監(jiān)控，isfet傳感器檢測阱中質(zhì)子的積累量。

優(yōu)選地，一旦獲得理想的無性系擴(kuò)增模板的量，則去除112密封帽。然后優(yōu)選清洗阱以去除阱中試劑，該試劑例如緩沖化合物、引物、dntps、聚合酶、質(zhì)子和未固定到固體載體的核酸模板。

使用固定的單鏈dna作為用于隨后測序反應(yīng)的優(yōu)選(擴(kuò)增)的模板。因此，用例如使模板變質(zhì)(denature)(鏈分離)的堿性溶液清洗所述阱以確保僅ssdna保持固定在載體上。

在一種優(yōu)選方法中，通過將測序引物雜交到固定的單鏈核酸(在這個實(shí)施例中，ssdna)的3’區(qū)域模擬測序，且然后測序聚合酶(例如bst聚合酶或其他熱穩(wěn)定聚合酶)結(jié)合到測序引物/-單鏈核酸(ssdna)模板復(fù)合體。

緊接著加入核苷酸，大部分脫氧核苷酸，其中每個核苷酸(例如datp、dgtp、dctp和dttp)被引入到分離的阱中。如果在特別的阱中互補(bǔ)堿基111存在于模板中，那么將通過聚合酶(在這個實(shí)施例中，bst)雜交該核苷酸并被摻入114從測序引物的3’端延伸。

核苷酸的摻入將導(dǎo)致作為副產(chǎn)品的質(zhì)子113的產(chǎn)生，其通過isfet傳感器檢測并發(fā)送積極的響應(yīng)。在另一方面，缺乏核苷酸的摻入將無法形成質(zhì)子且因此將無信號產(chǎn)生。通過重復(fù)每次添加一個核苷酸的過程，其中每個核苷酸的添加跟著不含有核苷酸的洗滌緩沖液的流動，描繪了完整的序列。

像這樣，單一核苷酸的進(jìn)化波(progressivewaves)，優(yōu)選每個波緊接著步驟以去除所有未結(jié)合的核苷酸(“清除步驟”)，例如清洗。檢查每個isfet的信號形式并，最后，確定每個阱中的擴(kuò)增模板的序列。依次地，可以分析來自每個阱的結(jié)果且如果相關(guān)，匹配重疊部分以提供完整的基因組。

在本領(lǐng)域中描述的以用于dna測序的離子敏感裝置檢測ph變化的方法且此處作為參考引入(參見，例如，專利申請?zhí)杣s811459；us7686929；us7888015；ep2129792；wo06/005967；us2010/0255595；andgb1112140.7；rothbergjm等，自然475:348-52(2011))。rothberg的另一個公開為us2010/137143。我們擁有的公開包括wo2008/07014andwo2003/073088。

在各種實(shí)施方式中，固定在固體載體上的寡核苷酸的序列具有與核酸模板的5’或3’的序列互補(bǔ)。優(yōu)選地，該寡核苷酸具有與用于無性系擴(kuò)增的第一或第二引物的全部或部分相同的序列，優(yōu)選與第一和第二引物中任一通用銜接序列相同。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在5’末端將該寡核苷酸結(jié)合到生物素并且每個阱含有一個以上的結(jié)合到生物素鏈接的寡核苷酸的鏈霉親和素珠(streptavidinbead(s))，生物素鏈接的寡核苷酸包含有通用銜接序列?？蛇x擇地，通用銜接寡核苷酸可以連接到阱內(nèi)部的表面?？梢栽诟男员砻嫔鲜褂霉押塑账岬钠渌矁r附著(covalentattachment)(例如對未改性玻璃sio2上紫外光交聯(lián))。

第一和第二引物可能僅含有對通用銜接的互補(bǔ)序列，但還可以含有對相關(guān)的靶向基因的互補(bǔ)序列。

在具體的實(shí)施例中使用油(優(yōu)選礦物油)作為可拆卸密封，此處還被稱為密封帽，可以通過有機(jī)溶劑和預(yù)置的測序緩沖液的幾輪交替清洗去除該油。醇如甲醇、異丙醇、乙醇為適合的有機(jī)溶劑。優(yōu)選使用異丁醇。

在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，單鏈核酸模板的單一副本首先被雜交到含有寡核苷酸的微珠，然后隨著擴(kuò)增試劑和引物被引入阱中。優(yōu)選地，然后在阱中無性系擴(kuò)增初始模板。最終結(jié)果為在微珠上捕獲互補(bǔ)鏈的無性系擴(kuò)增種群。

可以在裝置內(nèi)提供參比isfet(referenceisfet)。為此，可以有對照阱(controlwell)或否則空白阱?？梢杂泻芏嘣騺懋a(chǎn)生空白阱，可以有目的地被空白或被涉及以避免固定。此外，如果平均每個阱僅使用1個模板，并且在芯片上提供大量的阱，那么還應(yīng)該有一些其內(nèi)不具有固定的模板以測序的阱(并在測序前任選地擴(kuò)增)。

優(yōu)選地，測序聚合酶優(yōu)選bst，且在阱中培育核酸。

優(yōu)選通過流動(flowing)或測定點(diǎn)位(spotting)樣品到每個阱內(nèi)以分布核酸模板。為確保每個阱中平均獲取僅單一的核酸模板，可以稀釋樣品?？梢允褂胾v降解不靠近傳感器的核酸模板，即在阱的頂部上方明顯可見的核酸模板(當(dāng)沿著包含阱的平面芯片的平面看時)。這將對降解dsdna特別有用，dsdna直到變性以提供ssdna才在阱中復(fù)性(與用于固定的寡核苷酸)。因此，該uv或等效物作為去除不在阱中的dna或任何不在阱中的dsdna的清洗步驟的替代選擇。

擴(kuò)增的模板最優(yōu)選的為dsdna。對于測序測序步驟，模板將優(yōu)選為ssdna形式。如果提供雙鏈dna或rna，視用于擴(kuò)增或測序的情況設(shè)想適合鏈分離、溶解和/或變性。

此處涉及的寡核苷酸為用于在阱中或在芯片表面上固定的寡核苷酸。這是將其區(qū)別于引物或探針的接頭(linker)(需要在一端被固定的中的至少一個以防止擴(kuò)增或測序的復(fù)合體被清洗掉)。

如果沒有密封帽存在(包括如果一個被去除)，那么會有液體恒定流入或流出所述阱。

當(dāng)允許固定模板使用相鄰的引物(adjacentprimers)擴(kuò)增以形成無性系擴(kuò)增模板的固定化聚簇(cluster)時，優(yōu)選固相擴(kuò)增例如橋式擴(kuò)增。橋式擴(kuò)增通常包括在阱中至少兩個固定的寡核苷酸的種群(populations)(例如在阱的壁上或者在位于的微珠的表面上)。例如可以設(shè)計第一和第二寡核苷酸分別雜交到模板的5’和3’。該方法包括在每個阱中平均引入一個模板，其中例如將模板的5’雜交到第一寡核苷酸并將模板的3’雜交到第二寡核苷酸，形成橋。在核苷酸和聚合酶存在下，核酸由第二寡核苷酸的3’開始延伸。變性、雜交和延伸的反復(fù)循環(huán)將導(dǎo)致一群擴(kuò)增模板。

但是一般而言，由于所有無性系擴(kuò)增模板是固定的對于固相擴(kuò)增不需要密封帽(可拆卸密封)，且在阱的上面將有試劑的恒定流動。

核酸模板的擴(kuò)增和測序反應(yīng)優(yōu)選在相同的阱中進(jìn)行。

在優(yōu)選實(shí)施方式中，該半導(dǎo)體芯片和微流體結(jié)構(gòu)均為一次性的。具有一次性傳感裝置的優(yōu)勢為通過消除在使用間的交叉污染的任何可能性以最大化測序的精確性。進(jìn)一步的優(yōu)勢是提供用于臨時性隱藏或隔離在阱中的表面上固定的寡核苷酸的裝置的能力。如果傳感裝置不是一次性的則其是不可能的。以下將進(jìn)一步詳細(xì)描述這樣的用于臨時性隱藏在阱中的表面上固定的寡核苷酸的裝置，但可能包括在阱的表面上的蠟層(waxlayer)。

使用傳感裝置的實(shí)施方式

對于有效測序，可取的是在每個阱中的測序反應(yīng)包括核酸模板的唯一物種。當(dāng)擴(kuò)增模板(擴(kuò)增子)被用于測序時，可取得是每個無性系擴(kuò)增反應(yīng)開始于單一的核酸模板。

有限稀釋方法

在這種具體實(shí)施方式中，傳感裝置的每個阱用多個通用引物改性且限制所提供的模板的數(shù)量。也就是說，通用引物已經(jīng)被固定到阱壁的表面和/或包含在阱中的微珠的表面。如前面所描述的，已制備用于擴(kuò)增和測序的模板，包括銜接通用接頭到模板的末端的步驟.

當(dāng)將樣品流入阱中時，通過在通用接頭和通用引物之間的雜交將核酸模板結(jié)合到阱。

作為結(jié)果的阱的種群可以被分為三種類：不包含核酸模板的阱；包含一個核酸模板的阱；以及含有2以上核酸模板的阱。這些類別的分布可以通過泊松分布(poissondistribution)模擬。不同類別的阱的預(yù)期分布取決于模板數(shù)量與阱數(shù)量之間的比率。在模板多于阱的地方，分布將偏向于阱有2個以上的核酸模板。在阱多于模板的地方，分布將偏向于阱不含有模板。

基于泊松分布模型，已計算出提供給阱的模板的數(shù)量(計數(shù)模板副本)與阱的數(shù)量之間的最佳比率為1:1。在這個最佳比率下，僅具有一個單個模板的阱的數(shù)量為阱的總數(shù)的37％。該比率可以在2:5和2:1之間，這樣具有單個副本的阱的百分?jǐn)?shù)仍為約25％。通過經(jīng)濃縮或稀釋調(diào)整樣品中的模板的數(shù)量可以調(diào)整該比率。

應(yīng)當(dāng)指出的是，比率的變化沒有成正比于分布偏差(distributionbias)的變化。像這樣，比率上的顯著變化對于看到分布上的微小變化偏差是必要的。因此，僅對確定樣品中模板副本計數(shù)的粗略估計(roughestimate)以獲得最佳分布偏差(distributionbias)是必要的。

在一種給定樣品中，模板副本計數(shù)將落入預(yù)期的范圍內(nèi)。該范圍被稱為自然樣本變化(naturalsamplevariability)。在模板副本計數(shù)被認(rèn)為超出可接受的變化的情況下，存在確定、或“控制”模板副本計數(shù)的方法。一個這樣的方法為在擴(kuò)增和測序之前進(jìn)行附加的擴(kuò)增步驟，其中試劑(例如引物)的濃度為限制因素。因此，在這個附加擴(kuò)增步驟之后，可以設(shè)置該核酸模板副本計數(shù)為基于限量溶劑的濃度的預(yù)定量。

用于控制模板副本計數(shù)的另一種方法為向樣品添加已知數(shù)量的捕獲位點(diǎn)，例如在微珠上，并隨后清洗去除過量的核酸模板。然后可以在溶液中釋放結(jié)合到微珠的模板以獲得預(yù)定量。

一旦核酸模板在阱中雜交，則可以通過清洗步驟去除任何未雜交的模板。然后用擴(kuò)增反應(yīng)混合物填滿阱。用于pcr或其他擴(kuò)增技術(shù)所需要的試劑為本領(lǐng)域所熟知且在前面已提及。一旦反應(yīng)混合物在阱中，則以可拆卸密封密封該阱。然后在密封阱中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，密封防止阱之間模板的任何交叉感染。在擴(kuò)增期間，該擴(kuò)增模板雜交到固定的通用引物并因此固定在阱中。一旦擴(kuò)增反應(yīng)完成，密封被去除并且清洗阱以去除任何未結(jié)合的模板。該模板可以任選地經(jīng)歷變性步驟以確保用于測序反應(yīng)的所有模板為單鏈。在應(yīng)用變性步驟的地方，還需要額外的清洗步驟以去除參與變性步驟的任何試劑。

隨著用于測序的擴(kuò)增模板已準(zhǔn)備好，將dna聚合酶流入池中且允許結(jié)合到模板。然后將多輪單個核苷酸從阱上流過，并在每輪核苷酸之間有清洗步驟。iseet檢測隨著每輪流入阱中的核苷酸是否存在ph的變化，ph的變化示意核苷酸插入新生鏈中。然后編譯從每個阱獲得的模板的序列以形成樣品中的原始核酸(nuleic)模板的序列。

區(qū)分從沒有模板的阱或有兩個以上模板的阱得到的測序是可能的，因此，必要時放棄這些，在實(shí)時數(shù)據(jù)處理期間或者后處理期間。沒有模板結(jié)合到阱的阱將沒有模板擴(kuò)增因此將沒有擴(kuò)增模板。像這樣，從這些阱中將沒有獲得測序結(jié)果。有2個以上模板的阱將在擴(kuò)增步驟后具有擴(kuò)增模板的2以上物種的副本。像這樣，在測序期間，這些阱可能為超出預(yù)期的多輪核苷酸提供插入反應(yīng)的指示。此外，相比于帶有擴(kuò)增模板的一個物種的阱，在這些阱中，對每個插入反應(yīng)的ph變化將更弱。

單一捕獲位點(diǎn)

在另一個實(shí)施方式中，唯一模板(uniquetempales)的分布可以通過控制阱中的捕獲位點(diǎn)(即固定的寡核苷酸)的數(shù)量改善。在該情況中，以超過阱/結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量充分地提供模板。通過限制捕獲位點(diǎn)的數(shù)量為每阱一個將可能確保每個阱將僅具有與其結(jié)合的單個模板。該捕獲位點(diǎn)為固定的寡核苷酸，優(yōu)選為通用引物。

在一種實(shí)施方式中，在每個阱中，存在包含單個固定的寡核苷酸的單個微珠。這可以通過使用相對于阱足夠大的捕獲微珠獲得，這樣每個阱可以僅持有單個的捕獲微珠。

可選擇地，可以設(shè)置阱的表面僅持有單個微珠。例如，在表面上具有特定于微珠材料的絡(luò)合劑的區(qū)域的尺寸可以僅容納單個捕獲位點(diǎn)。該微珠可以包括茜素(alizarin)且在阱表面上的區(qū)域可能為鋁，通過沉積鋁或刻蝕阱表面直至鋁層而形成。作為第二個實(shí)施例，可以對電極(優(yōu)選參比電極)充電以吸附微珠(可以反向充電)，電極的面積僅足夠容納單個捕獲微珠。

在已提供有已固定在阱表面的寡核苷酸的阱的地方(優(yōu)選通用引物)，該寡核苷酸將需要從樣品中的模板隔離開，這樣模板從阱上流過時它們無法雜交。替代地，在阱中可獲得的唯一捕獲位點(diǎn)將會在微珠上?？梢酝ㄟ^用容易去除的的材料(例如蠟)覆蓋阱的內(nèi)表面以隔離該寡核苷酸。

一般而言，蠟可以用滅活蛋白質(zhì)代替。

在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，可以以在阱的內(nèi)表面上有蠟涂層或?qū)犹峁﹤鞲醒b置的阱，該蠟可以為石蠟。然后通過本領(lǐng)域所熟知以及前述描述的方法向每個阱添加單個微珠。當(dāng)寡核苷酸或捕獲位點(diǎn)需要在擴(kuò)增期間獲得與產(chǎn)生的擴(kuò)增模板雜交時，僅暫時性分離寡核苷酸或捕獲位點(diǎn)。該蠟涂層(其還可以被稱為層)將足夠深以遮蓋寡核苷酸。同時，該阱不應(yīng)該充滿蠟涂層或?qū)右驗(yàn)檫@將消除阱。蠟涂層或?qū)拥倪m宜厚度可以在10nm-100nm范圍內(nèi)。該蠟涂層可以通過蒸發(fā)或、噴墨分配器(inkjetdispenser)或者通過蠟溶液從微流體裝置上流過以應(yīng)用。

可選擇地，通過可逆性末端終結(jié)(reversibleterminator)或其他用于阻斷雜交或擴(kuò)增的公知技術(shù)可以創(chuàng)造出最初不可獲得的多重捕獲位點(diǎn)，然后當(dāng)去除未結(jié)合模板時被去除。或者可以是單個結(jié)合位點(diǎn)比額外結(jié)合位點(diǎn)具有不同的結(jié)合化學(xué)過程(公知)，這意味著僅單個位點(diǎn)適合于捕獲最初的副本，反之其他位點(diǎn)適合于捕獲擴(kuò)增子。

在提供傳感裝置的阱的地方，在阱壁的表面上沒有固定的寡核苷酸，沒有必要在阱壁內(nèi)部涂覆蠟?？梢栽跀U(kuò)增微珠上供應(yīng)用于擴(kuò)增模板的替代的額外位點(diǎn)，優(yōu)選地該位點(diǎn)足夠小以適于在阱中的捕獲位點(diǎn)的周圍并且提供高表面積與體積比。該捕獲位點(diǎn)涉及已結(jié)合到單個模板的微珠，限制到每個阱一個。該“擴(kuò)增”微珠可以在模板雜交到捕獲微珠后和在經(jīng)清洗步驟去除任何未結(jié)合的模板后向每個阱供應(yīng)。該“擴(kuò)增”微珠可以為10nm-100nm。

與前述描述的一樣，樣品中的核酸模板已經(jīng)被制備用于擴(kuò)增和測序，優(yōu)選包括末端銜接模板和通用接頭的步驟。

模板從阱上流過，這樣將單個模板結(jié)合到每個阱中的單個微珠。通過清洗步驟去除任何未結(jié)合、過量的模板。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，然后通過應(yīng)用加熱熔融蠟涂層，優(yōu)選通過傳感裝置的加熱裝置制作，且任選地通過清洗步驟從阱中去除蠟。在擴(kuò)增過程期間，作為阱加熱的結(jié)果，可以留下該蠟涂層以熔融。

用含有用于擴(kuò)增反應(yīng)所必要的試劑的擴(kuò)增反應(yīng)混合物填充滿阱。一旦反應(yīng)混合物在阱中，用可拆卸密封密封該阱。

然后在密封阱中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，該可拆卸密封防止阱之間模板的任何交叉污染。在擴(kuò)增期間，該擴(kuò)增模板雜交到固定的寡核苷酸(優(yōu)選通用引物)且因此固定在阱中。一旦完成擴(kuò)增反應(yīng)，去除密封且清洗阱以去除試劑或任何未結(jié)合模板。該模板可以任選地經(jīng)歷變性步驟以確保所有用于測序反應(yīng)的模板為單鏈。在應(yīng)用變性步驟的地方，還需要額外的清洗步驟以去除任何涉及變性步驟的試劑。

隨著擴(kuò)增模板已為測序準(zhǔn)備好，將dna聚合酶流入阱中并允許結(jié)合到模板。然后從阱上流過多輪單個核苷酸，在每輪核苷酸之間有清洗步驟。iseet檢測隨著每輪流入阱中的核苷酸的任何ph變化，ph的變化示意核苷酸插入新生鏈中。然后編譯從每個阱獲得的模板的序列以形成樣品中的原始核酸(nuleic)模板的序列。

在另一個實(shí)施方式中，在每個阱中提供帶有單個捕獲微珠的芯片?？梢蕴峁┡c該芯片分離的“擴(kuò)增”微珠，作為配套元件的部分。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，除了isfet外，還可以確定通過在每個阱中添加fet將單個模板結(jié)合到阱中。該fet將起測量結(jié)合電荷的作用。在每個阱中使用參比電極以在阱中局部(locally)應(yīng)用(applied)正電荷。可以單獨(dú)控制電極。正電荷可以從在阱上方的溶液中吸引負(fù)電荷模板進(jìn)入阱中。在第一個模板結(jié)合到固定的寡核苷酸(通用引物)時，通過fet檢測結(jié)合電荷。監(jiān)控fet的輸出信號的控制器可以由參比電極切斷電極電位以預(yù)防下一個模板(furthertemplates)被吸引進(jìn)入阱中，該fet可以為isfet或可以在阱中還有另一個晶體管，優(yōu)選地測量結(jié)合到fet表面的dna的電荷。該fet表面可以含有固定的通用引物，但數(shù)量有限且當(dāng)模板雜交到這些引物時，fet檢測單個分子的電荷且fet可以引發(fā)isfet參比電壓以在特定的阱中關(guān)閉。這樣可以為無性系擴(kuò)增步驟的制備創(chuàng)造出模板的單個副本。

一旦所有單個阱具有結(jié)合到阱的單個模板，通過清洗的步驟可以去除任何未結(jié)合、過量的模板。然后用包含所必要的試劑的擴(kuò)增反應(yīng)混合物填充滿該阱。然后用可拆卸密封密封該阱。

然后在密封阱中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，該可拆卸密封防止阱之間的模板的任何交叉污染。在擴(kuò)增期間，擴(kuò)增模板雜交到固定的寡核苷酸(優(yōu)選通用引物)且因此固定在阱中。一旦完成擴(kuò)增反應(yīng)，去除密封并清洗阱以去除任何未結(jié)合的模板以及用于擴(kuò)增的試劑。該模板可以任選地經(jīng)歷變性步驟以確保所有用于測序反應(yīng)的模板為單鏈。在應(yīng)用變性步驟的地方，還需要額外的清洗步驟以去除任何涉及變性步驟的試劑。

隨著擴(kuò)增模板已為測序準(zhǔn)備好，與dna聚合酶的結(jié)合一起測序引物在模板上雜交。然后從阱上流過多輪單個核苷酸，在每輪核苷酸之間有清洗步驟。iseet檢測隨著每輪流入阱中的核苷酸的任何ph變化，ph的變化示意核苷酸插入新生鏈中。然后編譯從每個阱獲得的模板的序列以形成樣品中的原始核酸模板的序列

序列特定捕獲

在另一個實(shí)施方式中，模板的分布可以通過使用針對于確定的序列的捕獲位點(diǎn)(即固定的寡核苷酸)改進(jìn)，這是預(yù)料的，但可能不僅存在于模板的子群(sub-group)(即確定比例)中。當(dāng)在上面描述的先前的實(shí)施方式中使用時，這樣特定的捕獲位點(diǎn)與任意地結(jié)合到給定樣品中的模板的所有物種(通過通用引物和通用接頭之間的雜交)的通用引物形成對比。實(shí)施例包括特定于細(xì)菌的16srrnaor23srrna指紋區(qū)的引物。盡管并非所有結(jié)合的模板必須是相同的或副本，但阱中的引物與這些指紋區(qū)域內(nèi)的保守區(qū)域互補(bǔ)將選擇性地與源自細(xì)菌的模板結(jié)合。

可選擇地，該引物可以是針對被添加到單個起始模板的標(biāo)簽，在此情況下通過僅捕獲源子單個起始片段的擴(kuò)增子在阱中創(chuàng)建單克隆種群(monoclonalpopulation)。在這個實(shí)施方式中使用的樣品的準(zhǔn)備可以不需要將模板與通用引物末端銜接。該模板可以與特定的接頭銜接，稱為“條形碼”。條形碼可以通過各種已知手段包括在樣品制備中，包括銜接或通過在擴(kuò)增引物中簡單地包含條形碼序列。通過標(biāo)記擴(kuò)增子的初始物種(initialstartingspecies)，條形碼確保擴(kuò)增子自排序進(jìn)入在isfet上的單克隆簇中。

通過限制每個阱以包含用于特定序列的寡核苷酸，可能會確保僅包含定義的序列的模板將結(jié)合到每個阱，由此去除在阱之間的模板的交叉污染的風(fēng)險。因此，在擴(kuò)增期間可能就不需要可拆卸密封了。

盡管每個阱將具有特定的引物，但聚集多個阱成為區(qū)域，阱的每個區(qū)域具有特別類型的引物(例如細(xì)菌引物或病毒引物)，這樣單個芯片可以包含多個不同序列的特定引物。在給定區(qū)域中的引物因此可以全部是與條形碼或保守區(qū)域互補(bǔ)，而且此外，區(qū)域中的每個阱將與不同靶向堿基或靶向序列是互補(bǔ)的以檢測變異(variant)。因此在芯片的給定區(qū)域中的反應(yīng)活性可以表明菌屬的普遍存在而且隨后的測序可以確定細(xì)菌的種類或物種的等位基因變異(allelevariant)。

在上述任一實(shí)施方式中，可以在阱外擴(kuò)增模板以創(chuàng)建擴(kuò)增模板的數(shù)個混合種群。

將擴(kuò)增模板流入阱中以允許模板在阱中雜交。只有包含了與序列特定的引物互補(bǔ)的定義的序列的模板將結(jié)合到阱。在模板在阱中雜交后，通過清洗步驟去除任何未雜交的模板。然后可選擇地用包括必須試劑的擴(kuò)增反應(yīng)混合物填充滿該阱以提升信號強(qiáng)度。用于擴(kuò)增的所需試劑為本領(lǐng)域所熟知且在前述已經(jīng)提及。

在任選的擴(kuò)增步驟期間，擴(kuò)增模板雜交到固定的寡核苷酸(‘引物)并固定到阱。清洗該阱以去除擴(kuò)增反應(yīng)的試劑和任何未結(jié)合的模板。該模板可以任選地經(jīng)歷變性步驟以確保用于測序反應(yīng)的所有模板為單鏈。在應(yīng)用該變性步驟的地方，同時還需要額外的清洗步驟以去除任何涉及變性步驟的試劑。

隨著模板已為測序準(zhǔn)備好，將dna聚合酶流入阱中并允許結(jié)合到模板。然后從阱上流過多輪單個核苷酸，在每輪核苷酸之間有清洗步驟。iseet檢測隨著每輪流入阱中的核苷酸的任何ph變化，ph的變化示意核苷酸插入新生鏈中。然后編譯從每個阱獲得的模板的序列以形成樣品中的原始核酸模板的序列

下面給出了本發(fā)明的一種非常具體的實(shí)施方式且，盡管優(yōu)選，主要提供用作范例的目的。其涉及一種擴(kuò)增在阱中發(fā)生的實(shí)施方式，但是其可以等同地應(yīng)用到擴(kuò)增發(fā)生的其他地方。

1)取包括相關(guān)核酸(模板)的樣品和制備樣品，優(yōu)選斷裂的；

2)將制備的樣品添加到多個(至少2個，但或許1000個或數(shù)百萬個)阱，該井包含適用于模板擴(kuò)增的引物；

3)該阱還包含聚合酶及核苷酸的源(例如dntps)-這些可以隨模板添加或可以早已存在；

4)該阱可以任選地包含一個以上的微珠，但引物中的至少一個必需通過位于阱內(nèi)表面上(或者阱或室的內(nèi)表面，或者如果存在微珠則在微珠上)的寡核苷酸被固定(直接或間接)；

5)對于等溫擴(kuò)增模板的擴(kuò)增發(fā)生在60-65℃或者對于pcr在合適的溫度；

6)一旦獲得擴(kuò)增的充足水平(可以由裝置的數(shù)量而定，包括單循環(huán)的次數(shù)或時間，優(yōu)選通過如在我們早期qpcr出版物中的isfet)，取決于所需的信號強(qiáng)度，通過清洗清除擴(kuò)增試劑和任何未結(jié)合(即沒有固定)的模板，保留(leaving)固定的模板；

7)單個dntp的波被通過或通入阱中并且每個isfet檢測對應(yīng)每個波是否在該阱有質(zhì)子釋放，以致質(zhì)子釋放(因?yàn)楹塑账岵迦?與基于固定的鏈的增長(新生)鏈的序列相符，因此提供固定的鏈的序列(通過它的編譯(compliment)，通過聚合酶將dntp添加到新生鏈)；

8)發(fā)生isfet數(shù)據(jù)的核對并確認(rèn)序列。

還提供了一種擴(kuò)增核酸模板的方法，接著對擴(kuò)增模板測序，該方法包括以下步驟：

a)將核酸模板與擴(kuò)增試劑結(jié)合以形成混合物，所述試劑包括聚合酶、多個dntp和用于核酸擴(kuò)增的引物；

b)在離子敏感裝置中向多個阱提供a)中的混合物，其中離子敏感裝置包括isfet傳感器、加熱器和溫度控制，而且其中每個阱中與至少一個isfet傳感器相接觸；

c)在阱中進(jìn)行核酸擴(kuò)增；

d)確認(rèn)阱中的擴(kuò)增模板的序列。

本發(fā)明還提供了擴(kuò)增核酸模板的方法，接著對擴(kuò)增模板測序，其中擴(kuò)增和測序兩者在芯片上的同一個阱中進(jìn)行，該方法包括以下步驟：

a)將核酸模板和擴(kuò)增試劑混合，擴(kuò)增試劑包括聚合酶、多個dntp以及第一和第二引物，其中第一引物能夠結(jié)合到第一單鏈核酸模板物種，并且第二引物能夠結(jié)合到第二單鏈核酸模板，其中第二單鏈核酸模板物種與第一單鏈核酸模板物種為互補(bǔ)；

b)在離子敏感裝置上將a)中的混合物與多個阱接觸，這樣每個阱平均包括核酸模板的一個單個副本，其中每個阱包括固定在固體載體表面的寡核苷酸而且其中寡核苷酸的序列與第一引物的至少部分相同，其中寡核苷酸能夠結(jié)合到第一單鏈核酸模板物種；

c)用密封帽覆蓋阱；

d)通過用第一和第二引物擴(kuò)增核酸模板進(jìn)行核酸的擴(kuò)增反應(yīng)，且其中優(yōu)選產(chǎn)生第一單鏈核酸模板物種以及第一單鏈核酸模板物種能夠結(jié)合到第一引物和固定在固體載體上的寡核苷酸；

e)延伸寡核苷酸以形成第二單鏈核酸模板物種，其中第二單鏈核酸模板物種的序列與雜交到寡核苷酸的第一單鏈核酸模板物種為互補(bǔ)；

f)去除來自c)的密封帽；

g)將固定的核酸模板變性，其中僅第二單鏈核酸模板物種結(jié)合到固體載體；

h)向阱中添加測序引物和聚合酶，其中測序引物雜交到第二單鏈核酸模板物種的3’區(qū)域；

i)向阱中添加一個核苷酸；

j)如果核苷酸被水解和結(jié)合(incorporated)則檢測由質(zhì)子釋放引起的ph變化；

k)清洗阱以去除未結(jié)合的核苷酸；

l)重復(fù)i-k以構(gòu)建(delineate)核酸模板的序列。

優(yōu)選地，裝置包括isfet傳感器、加熱器和溫度控制，且其中每個阱與至少一個isfet傳感器相接觸。

應(yīng)該理解的是，在上述論述中已公開了一些步驟且技術(shù)人員將理解這些步驟可以被結(jié)合和一些步驟被省略，作為適當(dāng)?shù)靥峁﹦?chuàng)建或集合模板的種群方法或裝置(在相關(guān)區(qū)域至少是相同的)，在阱中固定模板。這些步驟的順序可以改變并且每個步驟的程度可以再合理范圍內(nèi)變化以便在給定時間和費(fèi)用及條件下獲得所需序列結(jié)果。根據(jù)結(jié)構(gòu)和所需條件已描述裝置和方法以在大量阱中獲得相關(guān)結(jié)果，但技術(shù)人員應(yīng)該理解該由于在元素和統(tǒng)計變化中的誤差、質(zhì)量變化將不會在每個阱中獲得這個結(jié)果。