本發(fā)明屬于核酸檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種可用于核酸擴(kuò)增的快速、特異性檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

核酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)是最為經(jīng)典的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，自khorana(1971)提出至今，該技術(shù)已經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域。近年來新興的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(lamp)，交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(cpa)，重組酶擴(kuò)增技術(shù)(rpa)，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rca)等同樣被廣泛應(yīng)用。隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，探究更為特異、靈敏、快速的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法成為重中之重。

對(duì)于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法，傳統(tǒng)的凝膠電泳法采用的染料對(duì)人體有毒有害，操作步驟繁瑣，開蓋易造成氣溶膠污染。實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法一般采用dna雙鏈熒光嵌入劑，如sybrgreen，gelred，syto9等，實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)，并且避免了開蓋操作造成的交叉污染，但該方法不具有檢測(cè)特異性。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸擴(kuò)增的特異性檢測(cè)，有學(xué)者提出了采用分子探針，如水解探針(如taqman探針)、雜交探針(如分子信標(biāo))、復(fù)合探針，在核酸擴(kuò)增過程探針序列與模板進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，從而對(duì)核酸擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)、特異性的檢測(cè)。但基于分子探針的檢測(cè)方法，通常用于在核酸擴(kuò)增過程中進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，而未見文獻(xiàn)報(bào)道利用分子探針對(duì)核酸擴(kuò)增終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。而對(duì)于核酸擴(kuò)增終點(diǎn)產(chǎn)物的特異性檢測(cè)，通常采用測(cè)序的手段，它成本高，周期長(zhǎng)，而且需要專門的生物公司才能完成，不利于推廣。

需要補(bǔ)充說明的是，對(duì)于采用熒光染料嵌入劑的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法，溶解曲線常作為補(bǔ)充手段對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性檢測(cè)。但該方法需要仔細(xì)比對(duì)溶解曲線峰值(tm)的位置，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)產(chǎn)物量較小的體系以及非特異性擴(kuò)增明顯的體系的檢測(cè)難度更大?，F(xiàn)有技術(shù)中采用分子信標(biāo)的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法，是在核酸擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)受限于單批次性，尤其對(duì)于pcr擴(kuò)增的檢測(cè)，還需要被動(dòng)集成精密的溫控裝置，不利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。由于傳統(tǒng)基于分子信標(biāo)的檢測(cè)方法不能對(duì)已經(jīng)擴(kuò)增完成的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，從而大大限制了其應(yīng)用范圍。因此，探究更為簡(jiǎn)便、快速、特異的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、特異性差，以及受限于單批次、需要配置高規(guī)格裝置、不利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問題，為此提供本發(fā)明的一種基于分子信標(biāo)溶解曲線的可用于核酸擴(kuò)增的快速、特異性檢測(cè)方法。該方法快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，且能大大降低分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)要求。

為解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案其步驟為：

(1).針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)合成引物和分子信標(biāo)；

(2).提取待測(cè)物dna；

(3).將所述引物和分子信標(biāo)加入核酸擴(kuò)增體系，對(duì)所述待測(cè)物dna作核酸擴(kuò)增；

其特殊之處在于—

(4).所述核酸擴(kuò)增完成后設(shè)置分子信標(biāo)溶解曲線，檢測(cè)判斷所述待測(cè)物。

本發(fā)明步驟(3)中正、反向引物濃度比宜為1:(2～100)或(2～100):1，分子信標(biāo)濃度不高于正、反向引物中高濃度引物濃度。

優(yōu)選是正、反向引物濃度比為1:(4～10)或(4～10):1，分子信標(biāo)的濃度不高于正、反向引物中高濃度引物濃度的1/2。

進(jìn)一步，步驟(3)中分子信標(biāo)濃度為正、反向引物中高濃度引物濃度的1/100至1/4。

再進(jìn)一步，步驟(3)中分子信標(biāo)濃度為正、反向引物中高濃度引物濃度的1/10至1/4。

也可以是步驟(3)中分子信標(biāo)濃度為0.01μm～1μm。

優(yōu)選是步驟(3)中分子信標(biāo)濃度為0.01μm～0.1μm。

本發(fā)明步驟(4)中所述溶解曲線的升溫速率為0.001℃/s～10℃/s，升溫范圍為10℃～95℃或分子信標(biāo)的(tm－40℃)～(tm+40℃)。

優(yōu)選是所述溶解曲線的升溫速率為0.01℃/s～5℃/s，升溫范圍為20℃～80℃或分子信標(biāo)的(tm－20℃)～(tm+20℃)。

更優(yōu)選是所述溶解曲線的升溫速率為0.02℃/s～2℃/s，升溫范圍為30℃～70℃或分子信標(biāo)的(tm－10℃)～(tm+10℃)。

具體地：

本發(fā)明步驟(1)中所述目的基因其堿基序列為seqidno:4所示，所述引物其堿序列為seqidno:2、3所示，所述分子信標(biāo)其堿基序列為seqidno:1所示。

步驟(1)中所述目的基因其堿基序列為seqidno:8所示，所述引物其堿序列為seqidno:6、7所示，所述分子信標(biāo)其堿基序列為seqidno:5所示。

步驟(1)中所述目的基因其堿基序列為seqidno:12所示，所述引物其堿序列為seqidno:10、11所示，所述分子信標(biāo)其堿基序列為seqidno:9所示。

步驟(1)中所述目的基因其堿基序列為seqidno:16所示，所述引物其堿序列為seqidno:14、15所示，所述分子信標(biāo)其堿基序列為seqidno:13所示。

步驟(1)中所述目的基因其堿基序列為seqidno:21所示，所述引物其堿序列為seqidno:18、19、20所示，所述分子信標(biāo)其堿基序列為seqidno:17所示。

本發(fā)明步驟(1)、(2)時(shí)序無關(guān)。

本發(fā)明所述正、反向引物中高濃度引物濃度是指非對(duì)稱擴(kuò)增時(shí)正、反向引物中相對(duì)高濃度的引物的濃度。

下面說明分子信標(biāo)溶解曲線的檢測(cè)原理。

如圖5所示，當(dāng)模板dna不存在時(shí)，在較低溫度下，分子信標(biāo)呈現(xiàn)穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此時(shí)分子信標(biāo)兩端標(biāo)記的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)距離很近，分子信標(biāo)呈猝滅狀態(tài)。隨著溫度的逐漸升高，分子信標(biāo)螺旋的莖部逐漸打開，分子信標(biāo)呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲狀態(tài)，此時(shí)由于分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，因此發(fā)出熒光。隨著溫度升高，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，直到分子信標(biāo)莖部全部打開，熒光積累達(dá)到平穩(wěn)期。

當(dāng)模板dna存在時(shí)，非對(duì)稱擴(kuò)增的單鏈dna產(chǎn)物和雙鏈dna產(chǎn)物同時(shí)存在(如圖1所示)。在較低溫度下，一部分分子信標(biāo)和單鏈dna產(chǎn)物結(jié)合，形成dna-分子信標(biāo)復(fù)合物，發(fā)出熒光(如圖2所示)，另一部分分子信標(biāo)由于未和dna結(jié)合，保持穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，沒有發(fā)出熒光。因此，對(duì)于相同的擴(kuò)增體系，模板dna存在時(shí)比模板dna不存在時(shí)的熒光基底要高(如圖6所示)。隨著溫度的升高，雙鏈dna產(chǎn)物解鏈，分子信標(biāo)與解鏈的dna結(jié)合形成dna-分子信標(biāo)復(fù)合物，結(jié)合的同時(shí)分子信標(biāo)莖部打開，發(fā)出熒光(如圖3所示)。因此，隨著溫度升高，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。當(dāng)熒光積累到最高值后，隨著溫度繼續(xù)升高，dna-分子信標(biāo)復(fù)合物變得不穩(wěn)定，分子信標(biāo)解離下來，恢復(fù)到原來的閉合構(gòu)象，熒光積累減少(如圖4所示)。當(dāng)溫度升高到分子信標(biāo)的tm值時(shí)，分子信標(biāo)從dna-分子信標(biāo)復(fù)合物上解離下來一半，此時(shí)熒光減小的速度達(dá)到最快(如圖7所示)。隨著溫度繼續(xù)升高，分子信標(biāo)又從閉合構(gòu)象打開為無規(guī)則卷曲狀態(tài)，熒光積累增多(如圖5所示)。直到分子信標(biāo)全部打開，熒光積累達(dá)到飽和。

以溫度為橫坐標(biāo)，熒光值、熒光值導(dǎo)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，陽性樣本在tm值處出現(xiàn)峰值，對(duì)應(yīng)的峰可稱為陽性樣本的特征峰，陰性樣本不存在此特征峰(如圖6、圖7所示)。因此，根據(jù)有無特征峰即可明顯區(qū)分陰性和陽性樣本，而不用比較峰值的位置，大大簡(jiǎn)化了操作。

本發(fā)明是在核酸擴(kuò)增過程完成后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物作檢測(cè)。與現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：

避免了傳統(tǒng)凝膠電泳法步驟繁瑣、對(duì)人體有毒害的缺陷；

避免了采用dna雙鏈熒光嵌入實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)不具有特異性的缺陷；

克服了包括分子信標(biāo)的分子探針對(duì)核酸擴(kuò)增過程實(shí)時(shí)檢測(cè)受限于單批次性，設(shè)備要求高，不利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，應(yīng)用范圍窄的弊端；

避免了采用測(cè)序手段所致成本高、周期長(zhǎng)、專業(yè)性要求高、不利于推廣的缺陷；

分子信標(biāo)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便——與核酸擴(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)分子信標(biāo)設(shè)計(jì)相比，本發(fā)明中分子信標(biāo)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)單，對(duì)分子信標(biāo)莖部的tm值的要求大大降低。譬如在pcr擴(kuò)增過程中，分子信標(biāo)的tm值無需以引物退火溫度為參考；在恒溫?cái)U(kuò)增過程中，分子信標(biāo)的tm值也無需以引物退火結(jié)合到模板的溫度以及恒溫?cái)U(kuò)增溫度為參考，僅需保證分子信標(biāo)的環(huán)部與模板互補(bǔ)配對(duì)，莖部tm值不高于環(huán)部tm值即可。其他設(shè)計(jì)條件仍遵照標(biāo)準(zhǔn)分子信標(biāo)設(shè)計(jì)原則進(jìn)行分子信標(biāo)設(shè)計(jì)。

本發(fā)明不僅適用于pcr擴(kuò)增，也適用于恒溫?cái)U(kuò)增體系檢測(cè)；操作過程無需開蓋，避免了交叉污染；將擴(kuò)增與檢測(cè)分開，大大降低了對(duì)儀器精密溫控與集成的要求；檢測(cè)過程中無需對(duì)溶解曲線峰值位置進(jìn)行比對(duì)即可完成終點(diǎn)產(chǎn)物是與否的判斷，大大簡(jiǎn)化了操作；檢測(cè)快速，特異性強(qiáng)，一般3分鐘內(nèi)可完成檢測(cè)。

附圖說明

圖1表示非對(duì)稱擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈dna模板(左)和單鏈dna模板(右)；

圖2表示dna模板和分子信標(biāo)結(jié)合形成的dna-分子信標(biāo)復(fù)合物；

圖3表示隨著溫度的升高，雙鏈dna產(chǎn)物解鏈，分子信標(biāo)與解鏈的dna結(jié)合形成dna-分子信標(biāo)復(fù)合物，結(jié)合的同時(shí)分子信標(biāo)莖部打開，分子信標(biāo)發(fā)出熒光；

圖4表示隨著溫度繼續(xù)升高，dna-分子信標(biāo)復(fù)合物變得不穩(wěn)定，分子信標(biāo)解離下來，恢復(fù)到原來的閉合構(gòu)象，分子信標(biāo)熒光猝滅；

圖5表示隨著溫度升高，分子信標(biāo)從閉合構(gòu)象打開為無規(guī)則卷曲狀態(tài)，發(fā)出熒光；

圖6為分子信標(biāo)溶解曲線檢測(cè)實(shí)際樣本的熒光值-溫度溶解曲線圖；

圖7為分子信標(biāo)溶解曲線檢測(cè)實(shí)際樣本的熒光值導(dǎo)數(shù)-溫度溶解曲線圖；

圖8表示實(shí)施例1對(duì)大豆葉片dna的檢測(cè)結(jié)果，陽性為轉(zhuǎn)基因大豆，陰性為非轉(zhuǎn)基因大豆；

圖9表示實(shí)施例1對(duì)大豆種子dna的檢測(cè)結(jié)果，陽性為轉(zhuǎn)基因大豆，陰性為非轉(zhuǎn)基因大豆；

圖10表示實(shí)施例2對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果，陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本；

圖11表示實(shí)施例3對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果，陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本；

圖12表示實(shí)施例4對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果，陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本；

圖13表示實(shí)施例5對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果，陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本；

圖14表示實(shí)施例6對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果，陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本；

圖15表示實(shí)施例7對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果，陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本；

圖16表示實(shí)施例8對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果，陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本；

圖17表示實(shí)施例9對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果，陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本；

圖18表示實(shí)施例10對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果，陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)。

首先，針對(duì)大豆的插入基因序列(genbank:ab209952.1)，采用primerprimer5.0軟件進(jìn)行pcr引物和分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)，并采用idt(http://sg.idtdna.com/calc/analyze)和blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)對(duì)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行評(píng)估。再采用植物基因組dna提取試劑盒(購買自天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)dp305-02)分別對(duì)大豆葉片、大豆種子作dna提取，操作完全按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行。然后，按照擴(kuò)增試劑盒說明，配制pcr擴(kuò)增反應(yīng)液(又稱為擴(kuò)增體系)并分裝到八連管中，蓋上管蓋。接著，將八連管放在pcr儀(appliedbiosystems^tmq3pcr儀)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。待擴(kuò)增反應(yīng)完成后，將樣本溫度逐漸升高并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光采集，獲得待測(cè)樣本的分子信標(biāo)溶解曲線，通過判斷溶解曲線有無特征峰，對(duì)樣本做出陽性/陰性判定。升溫、實(shí)時(shí)熒光采集與熒光值導(dǎo)數(shù)—溫度曲線記錄在同一pcr儀(appliedbiosystems^tmq3pcr儀)上進(jìn)行。具體pcr擴(kuò)增體系，pcr擴(kuò)增程序，分子信標(biāo)溶解曲線升溫速率和升溫范圍如下：

擴(kuò)增體系及程序：pcr反應(yīng)在50μl體積中進(jìn)行，該體積中含有taqhs聚合酶1.25u，tris-hcl10mm，kcl50mm，mgcl21.5mm，dntp各0.2mm，(購買自大連寶生物工程有限公司，貨號(hào)r007a)。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?0個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括98℃反應(yīng)10s，55℃反應(yīng)30s和72℃反應(yīng)1min。

溶解曲線：溶解曲線的溫度從15℃升高到95℃，升溫速率為0.02℃/s。

使用的分子信標(biāo)序列：5’texrd-cctgcggaagttcatttcatttgggcagg-dab3’

使用的引物序列：f：5'cgcacaatcccactatccttc3'

r：5'tcagcttgtcagcgtgtcctc3'

擴(kuò)增的模板序列：

cgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgacaagctga(genbank:ab209952.1)

使用的分子信標(biāo)及引物濃度：分子信標(biāo)工作濃度為0.03μm。引物工作濃度比例為1:5。具體而言，引物f(正向引物，下同)的工作濃度為0.08μm，引物r(反向引物，下同)的工作濃度為0.4μm。

圖8、9分別表示分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)大豆葉片、大豆種子dna的檢測(cè)結(jié)果。陽性為轉(zhuǎn)基因大豆，陰性為非轉(zhuǎn)基因大豆。圖中以及以下圖10—18橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光值導(dǎo)數(shù)。

實(shí)施例2分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

首先，針對(duì)柑橘黃龍病基因序列(genbank:genbank:ky323722.1)，采用primerprimer5.0軟件進(jìn)行pcr引物和探針設(shè)計(jì)，并采用idt(http://sg.idtdna.com/calc/analyzer)和blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)對(duì)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行評(píng)估。再采用植物基因組dna提取試劑盒(購買自天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)dp305-02)對(duì)柑橘葉片作dna提取，操作完全按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行。然后，按照擴(kuò)增試劑盒說明，配制pcr擴(kuò)增反應(yīng)液(又稱為擴(kuò)增體系)并分裝到八連管中，蓋上八連管蓋子。接著，將八連管放在pcr儀(appliedbiosystems^tmq3pcr儀)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。待擴(kuò)增反應(yīng)完成后，將樣本溫度逐漸升高并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光采集，獲得待測(cè)樣本的分子信標(biāo)溶解曲線，通過判斷溶解曲線有無特征峰，對(duì)樣本做出陽性/陰性判定。升溫、實(shí)時(shí)熒光采集與熒光值導(dǎo)數(shù)—溫度曲線記錄在同一pcr儀(appliedbiosystems^tmq3pcr儀)上進(jìn)行。具體pcr擴(kuò)增體系，pcr擴(kuò)增程序，分子信標(biāo)溶解曲線升溫速率和升溫范圍如下：

擴(kuò)增體系及程序：pcr反應(yīng)在50μl體積中進(jìn)行，該體積中含有taqhs聚合酶1.25u，tris-hcl10mm，kcl50mm，mgcl21.5mm，dntp各0.2mm，(購買自大連寶生物工程有限公司，貨號(hào)r007a)。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?0個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括98℃反應(yīng)10s，55℃反應(yīng)30s和72℃反應(yīng)1min。

溶解曲線：溶解曲線的溫度從15℃升高到95℃，升溫速率為0.02℃/s。

使用的分子信標(biāo)序列：5’texrd-ggatacgtgtctcagtcccagtgtatcc-dab3’

使用的引物序列：f：5’atggctggatcagggttgc3’

r：5’tgagcctgcgttggattagc3’

擴(kuò)增的模板序列：

tgagcctgcgttggattagctagttggtagggtaagagcctaccaaggctacgatctatagctggtctgagaggacgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccctgatccagccat(genbank:ky323722.1)

使用的分子信標(biāo)及引物濃度：分子信標(biāo)工作濃度為0.03μm。引物工作濃度比例為1:5。引物f的工作濃度為0.08μm，引物r的工作濃度為0.4μm。

圖10表示分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果。陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本。

實(shí)施例3分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.1μm。其他工作條件同實(shí)施例2。

圖11表示分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果。陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本。

實(shí)施例4分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

基本步驟同實(shí)施例2。具體pcr擴(kuò)增體系，pcr擴(kuò)增程序，分子信標(biāo)溶解曲線升溫速率和升溫范圍如下：

擴(kuò)增體系及程序：pcr反應(yīng)在50μl體積中進(jìn)行，該體積中含有speedstar^tmhs聚合酶1.25u，tris-hcl10mm，kcl50mm，mgcl21.5mm，dntp各0.2mm，(購買自大連寶生物工程有限公司，貨號(hào)rr070a)。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?0個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括98℃反應(yīng)10s，55℃反應(yīng)30s和72℃反應(yīng)1min。

溶解曲線：溶解曲線的溫度從15℃升高到95℃，升溫速率為0.02℃/s。

使用的分子信標(biāo)序列：5’texrd-ggatacgtgtctcagtcccagtgtatcc-dab3’

使用的引物序列：f：5’atggctggatcagggttgc3’

r：5’tgagcctgcgttggattagc3’

擴(kuò)增的模板序列：

tgagcctgcgttggattagctagttggtagggtaagagcctaccaaggctacgatctatagctggtctgagaggacgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccctgatccagccat(genbank:ky323722.1)

使用的分子信標(biāo)及引物濃度：分子信標(biāo)工作濃度為0.03μm。引物工作濃度比例為1:5。引物f的工作濃度為0.08μm，引物r的工作濃度為0.4μm。

圖12表示分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果。陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本。

實(shí)施例5分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

此實(shí)施例中，正向引物和反向引物的工作濃度均為0.4μm，其他條件均同實(shí)施例4。

圖13表示分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果。陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本。

實(shí)施例6分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

擴(kuò)增體系及程序：pcr反應(yīng)在50μl體積中進(jìn)行，該體積中含有taqhs聚合酶1.25u，tris-hcl10mm，kcl50mm，mgcl21.5mm，dntp各0.2mm，(購買自大連寶生物工程有限公司，貨號(hào)r007a)。引物和分子信標(biāo)的濃度隨具體實(shí)驗(yàn)變化。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?0個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括98℃反應(yīng)10s，55℃反應(yīng)30s和72℃反應(yīng)1min。

溶解曲線：溶解曲線的溫度從15℃升高到95℃，升溫速率為0.02℃/s。

使用的分子信標(biāo)序列：5’texrd-ggatacgtgtctcagtcccagtgtatcc-dab3’

使用的引物序列：f：5’atggctggatcagggttgc3’

r：5’tgagcctgcgttggattagc3’

擴(kuò)增的模板序列：

tgagcctgcgttggattagctagttggtagggtaagagcctaccaaggctacgatctatagctggtctgagaggacgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccctgatccagccat(genbank:ky323722.1)

使用的分子信標(biāo)及引物濃度：分子信標(biāo)工作濃度為0.1μm。引物工作濃度比例為1:5。引物f的工作濃度為0.08μm，引物r的工作濃度為0.4μm。

圖14表示分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果。陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本。

實(shí)施例7分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，溶解曲線的升溫速率為0.1℃/s，溫度從30℃上升到70℃。其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

圖15表示分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果。陽性為黃龍病柑橘

實(shí)施例8分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，溶解曲線的升溫速率為0.15℃/s，溫度從30℃上升到70℃。其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

圖16表示分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果。陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本。

實(shí)施例9分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，溶解曲線的升溫速率為0.2℃/s，溫度從30℃上升到80℃。其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

圖17表示分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果。陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本。

實(shí)施例10分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，溶解曲線的升溫速率為0.5℃/s，溫度從15℃上升到95℃。其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

圖18表示分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘樣本的檢測(cè)結(jié)果。陽性為黃龍病柑橘樣本，陰性為非黃龍病柑橘樣本。

實(shí)施例11分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為1μm，其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例12分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.5μm，其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例13分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.4μm，其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例14分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.05μm，其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例15分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.01μm，其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例16分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.005μm，其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例17分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.001μm，其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例18分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱near恒溫?cái)U(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

基本步驟同實(shí)施例2。其中擴(kuò)增反應(yīng)也可以在熱塊上進(jìn)行。

擴(kuò)增體系及程序：near恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在25μl體積中進(jìn)行，反應(yīng)體系中含有40mmtris-cl(ph8.8),2mmmgso4,150mmkcl,10mm(nh4)2so4,50mmnacl,0.75unt.bstnbi和4.8ubst3.0dna聚合酶,320μmdntp,0.1μm引物bf,2.5μldna模板，切口引物1f，切口引物1r和分子信標(biāo)的濃度隨具體實(shí)驗(yàn)變化。near恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為在56℃加熱條件下孵育10分鐘。

溶解曲線：溶解曲線的溫度從15℃升高到95℃，升溫速率為0.02℃/s。

使用的分子信標(biāo)序列：

5’texrd-ggatacgtgtctcagtcccagtgtatcc-dab3’

使用的引物序列：near-hlb-16s-bf(bf)：5’cctgcgttggatta3’

near-hlb-16s-1f(1f)：5’tatcatttcagagtcacataccaaggctacg3’

near-hlb-16s-1r(1r)：5’agtgtccgtcgagtcctatccgtgtctcagtc3’

擴(kuò)增的模板序列：

accaaggctacgatctatagctggtctgagaggacgatcagccacactgggactgagacacgg(genbank:ky323722.1)

使用的分子信標(biāo)及引物濃度：分子信標(biāo)工作濃度為0.1μm。引物工作濃度比例為1:4。切口引物1r的工作濃度為0.1μm，切口引物1f的工作濃度為0.4μm。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例19分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合對(duì)稱near恒溫?cái)U(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，切口引物1f和切口引物1r的工作濃度均為0.4μm，其他工作條件均與實(shí)施例18相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例20分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱near恒溫?cái)U(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.03μm，其他工作條件均與實(shí)施例18相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例21分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱near恒溫?cái)U(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.01μm，其他工作條件均與實(shí)施例18相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例22分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱near恒溫?cái)U(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.005μm，其他工作條件均與實(shí)施例18相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例23分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱near恒溫?cái)U(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為0.5μm，其他工作條件均與實(shí)施例18相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例24分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，分子信標(biāo)的工作濃度為1μm，引物工作濃度比例為1:100。引物f的工作濃度為0.01μm，引物r的工作濃度為1μm。其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例25分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，引物工作濃度比例為1:10。引物f的工作濃度為0.04μm，引物r的工作濃度為0.4μm。其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例26分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，溶解曲線的升溫速率為0.001℃/s。其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

實(shí)施例27分子信標(biāo)溶解曲線結(jié)合非對(duì)稱pcr擴(kuò)增用于柑橘黃龍病的檢測(cè)。

在此實(shí)施例中，溶解曲線的升溫速率為5℃/s。其他工作條件均與實(shí)施例6相同。

分子信標(biāo)溶解曲線對(duì)柑橘黃龍病樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病樣本呈現(xiàn)陽性結(jié)果，非黃龍病樣本呈現(xiàn)陰性結(jié)果。

sequencelisting

<110>浙江大學(xué)

<120>一種基于分子信標(biāo)溶解曲線的可用于核酸擴(kuò)增的快速、特異性檢測(cè)方法

<130>1

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gctggtctgagaggacgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacggg120

aggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccctgatccagccat170

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tgagcctgcgttggattagctagttggtagggtaagagcctaccaaggctacgatctata60

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accaaggctacgatctatagctggtctgagaggacgatcagccacactgggactgagaca60

cgg63