本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，更特別地，涉及一種脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)染是將外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入到真核細(xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)，隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中經(jīng)常涉及的基本方法，它解決了外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的難題，為在細(xì)胞水平上進(jìn)行基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。隨著近年來基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了多種多樣的轉(zhuǎn)染技術(shù)，按外源遺傳物質(zhì)是否與基因組整合來分，轉(zhuǎn)染技術(shù)分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩大類；按轉(zhuǎn)染實(shí)施手段來分，轉(zhuǎn)染技術(shù)分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三大類。常見的轉(zhuǎn)染方法有顯微注射、電穿孔、基因槍、光學(xué)轉(zhuǎn)染、deae-葡聚糖法、磷酸鈣法、人工脂質(zhì)體法等。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇會(huì)影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而影響到整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，需對(duì)轉(zhuǎn)染過程中涉及的因素進(jìn)行綜合分析，以便篩選出針對(duì)特定細(xì)胞轉(zhuǎn)染的最適方法和條件。

陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法具有操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)染成功率高，對(duì)細(xì)胞類型的應(yīng)用面廣，可以轉(zhuǎn)染dna、rna、寡核苷酸以及蛋白質(zhì)、病毒等多種類型，可以負(fù)載大片段dna等優(yōu)點(diǎn)，既可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，也可用于永久表達(dá)系的建立；既可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，也可用于體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染，現(xiàn)廣泛用于人、大鼠、小鼠、兔、豬、馬、牛、羊、雞、鴨等動(dòng)物細(xì)胞系或體內(nèi)細(xì)胞的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體也稱人工細(xì)胞膜，是由脂質(zhì)雙分子層組成，磷脂分子在水中可自動(dòng)生成閉合的雙層膜，從而形成一種囊狀物被稱為脂質(zhì)小體。最初人們只是運(yùn)用脂質(zhì)體模擬膜的構(gòu)造及其功能，從而發(fā)現(xiàn)了膜的融合及內(nèi)吞作用。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的基本原理是細(xì)胞通過胞飲將脂質(zhì)體/dna復(fù)合物攝入胞漿中，陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根(po4-3)通過靜電作用將dna分子包裹入內(nèi)，形成dna—脂質(zhì)體復(fù)合體，也能被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞作用偶爾也通過滲透作用，將dna傳遞進(jìn)入細(xì)胞形成包涵體或進(jìn)入溶酶體。內(nèi)吞后的dna—脂質(zhì)體復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)形成的包涵體，在輔助脂質(zhì)體dope作用下，細(xì)胞膜上的陰離子脂質(zhì)因膜的去穩(wěn)定而失去原有的平衡，擴(kuò)散進(jìn)入復(fù)合體，與陽離子脂質(zhì)中的陽離子形成中性離子對(duì)，使原來與脂質(zhì)體結(jié)合的游離出來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，最終進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并表達(dá)。

目前常用的脂質(zhì)體或脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染試劑有l(wèi)ipofectamine2000(invitrogen)、fugene6(roche)、effectenetransfectionreagent(qiagen)及國產(chǎn)的lipofiter轉(zhuǎn)染試劑(漢恒生物)、translipidtransfectionreagent(全式金)、lipo6000transfectionreagent(碧云天)等。這些試劑說明書中均說明在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到70％-90％或50％-80％、40％-80％、50％-70％等時(shí)，按照推薦的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，即可達(dá)到理想的效果。但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞傳代至6孔板或12孔板，18-24h后，有個(gè)別或多個(gè)孔的細(xì)胞匯合度不在說明書要求的范圍內(nèi)，特別是對(duì)于不經(jīng)常做細(xì)胞培養(yǎng)的“新手”來說，如何準(zhǔn)確判斷細(xì)胞匯合度達(dá)到70％-90％，也是個(gè)問題。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)不到說明書的推薦要求時(shí)，又要重新培養(yǎng)細(xì)胞，耽誤時(shí)間；或者有個(gè)別孔的細(xì)胞匯合度不在說明書要求的范圍內(nèi)，匆匆進(jìn)行轉(zhuǎn)染，既達(dá)不到實(shí)驗(yàn)效果，又浪費(fèi)試劑，浪費(fèi)時(shí)間。此外，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)會(huì)增加培養(yǎng)細(xì)胞被污染的風(fēng)險(xiǎn)。

然而，如果轉(zhuǎn)染前細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間過短，細(xì)胞就不能很好地黏附于培養(yǎng)皿上，與脂質(zhì)體接觸后，細(xì)胞容易脫落而逐漸死亡。

因此，需要一種無需長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞即可進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，其包括以下步驟：

s1：將包含細(xì)胞的液體培養(yǎng)基接種于轉(zhuǎn)染容器中，所述包含細(xì)胞的液體培養(yǎng)基中包含0.5-2μg/ml的纖粘蛋白；

s2：向所述轉(zhuǎn)染容器中添加轉(zhuǎn)染dna和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的混合液進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

通過在處理過程中使用纖粘蛋白可使細(xì)胞快速貼壁，從而無需將對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)以達(dá)到要求的匯合度，因此，該方法減少了操作時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作程序，降低了操作難度，同時(shí)降低了細(xì)胞被污染的風(fēng)險(xiǎn)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，s1中細(xì)胞的接種濃度為1-2×10⁶個(gè)/ml。控制細(xì)胞的接種濃度使得轉(zhuǎn)染過程中有足夠的被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞存活下來，同時(shí)又不會(huì)因?yàn)榧?xì)胞太密集而發(fā)生接觸抑制的現(xiàn)象。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述液體培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，s2具體包括：

s21：將所述轉(zhuǎn)染dna與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混勻，于室溫下靜置20分鐘，得到轉(zhuǎn)染dna與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的混合液；

s22：將所述轉(zhuǎn)染dna與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的混合液加入到裝有包含細(xì)胞的液體培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染孔中，混勻；

s23：細(xì)胞于37℃下培養(yǎng)12-18小時(shí)；

s24：更換新鮮的含10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基，即得到轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，s21中轉(zhuǎn)染dna為質(zhì)粒dna，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine2000、translipidhl。

附圖說明

圖1是采用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)染pegfp-c1的df-1細(xì)胞在白光和gfp激發(fā)光下顯微照片，顯微觀察倍數(shù)均為×100；

圖2是采用本發(fā)明方法使用translipidhl轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染gfp過表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的df-1細(xì)胞在gfp激發(fā)光下的熒光顯微照片；

圖3是采用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)染shrna逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的df-1細(xì)胞在rfp激發(fā)光下的熒光顯微照片。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.轉(zhuǎn)染的步驟如下：

將細(xì)胞接種至37℃預(yù)熱的6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清、1μg/ml纖粘蛋白(購自gibco公司)的dmem高糖培養(yǎng)基(購自gibco公司)，然后將轉(zhuǎn)染dna和轉(zhuǎn)染試劑混合后加入6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，37℃培養(yǎng)后后更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。

結(jié)果表明，該細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法可獲得較好的轉(zhuǎn)染效果，與常規(guī)轉(zhuǎn)染方法相比，可省去轉(zhuǎn)染前的約24h的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，并無須判斷細(xì)胞匯合度是否達(dá)到轉(zhuǎn)染要求，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。

2.實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

1)纖粘蛋白添加量的優(yōu)化

將接種濃度為1.2×10⁶的df-1細(xì)胞接種至37℃預(yù)熱的12孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液分別為含10％胎牛血清+0.1μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基、10％胎牛血清+0.5μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基、10％胎牛血清+1μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基、10％胎牛血清+2μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基，纖粘蛋白每個(gè)添加量設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將2μgpegfp-c1質(zhì)粒(一種表達(dá)綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體，由實(shí)驗(yàn)室保存)與4μllipofectamine2000(購自invitrogen公司)按照說明書步驟孵育混合后加入12孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，12h后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，并在不同時(shí)間顯微觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況.

結(jié)果表明，0.5-2μg/ml的纖粘蛋白都能實(shí)現(xiàn)良好的轉(zhuǎn)染效果，其中1μg/ml纖粘蛋白可獲得最好的轉(zhuǎn)染效果。

2)細(xì)胞接種濃度的優(yōu)化

分別將接種濃度為2×10⁵、5×10⁵、1.2×10⁶和2×10⁶的df-1細(xì)胞接種至37℃預(yù)熱的12孔板中，將接種濃度為5×10⁵、1×10⁶、2×10⁶和3.5×10⁶的df-1細(xì)胞接種至37℃預(yù)熱的6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清+1μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基，每個(gè)接種濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將4μgpegfp-c1質(zhì)粒與8μllipofectamine2000按照說明書步驟孵育混合后加入6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將2μgpegfp-c1質(zhì)粒與4μllipofectamine2000按照說明書步驟孵育混合后加入12孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，12h后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，并在不同時(shí)間顯微觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

結(jié)果表明，1-2×10⁶的細(xì)胞接種濃度都具有良好的轉(zhuǎn)染效果，其中用于6孔板時(shí)細(xì)胞最佳接種濃度為2×10⁶，12孔板細(xì)胞最佳接種濃度為1.2×10⁶。

3)培養(yǎng)液中有無血清與纖粘蛋白(fn)的比較

將接種濃度為1.2×10⁶的df-1細(xì)胞接種至37℃預(yù)熱的12孔板中，接種時(shí)將細(xì)胞分為四組：血清fn組、血清組、fn組和無血清fn組，四組細(xì)胞的培養(yǎng)液分別為含10％胎牛血清+1μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基(血清fn組)、含10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基(血清組)、含1μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基(fn組)和不含胎牛血清與纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基(無血清fn組)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將2μgpegfp-c1質(zhì)粒與4μllipofectamine2000按照說明書步驟孵育混合后加入12孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，12h后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，并在不同時(shí)間顯微觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

結(jié)果表明，本發(fā)明提供的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法在細(xì)胞培養(yǎng)液中含有血清與纖粘蛋白時(shí)可獲得較好的轉(zhuǎn)染效果。

4)轉(zhuǎn)染后換液時(shí)間的優(yōu)化

將接種濃度為1.2×10⁶的df-1細(xì)胞接種至37℃預(yù)熱的12孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清、1μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基。將2μgpegfp-c1質(zhì)粒與4μllipofectamine2000按照說明書步驟孵育混合后加入12孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染后6h、12h、18h和24h更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，并顯微觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后12-18小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液可獲得良好的轉(zhuǎn)染效果，其中轉(zhuǎn)染后12h更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液獲得的轉(zhuǎn)染效果最佳。

5)質(zhì)粒dna量及比例的優(yōu)化

將接種濃度為1.2×10⁶的df-1細(xì)胞接種至37℃預(yù)熱的12孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清、1μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基。分別將1.5μg、2μg和3μgpegfp-c1質(zhì)粒與lipofectamine2000按照1:1(μg：μl，下同)、1:1.5、1:2、1:3進(jìn)行孵育混合后加入12孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，12h后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，并在不同時(shí)間顯微觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

結(jié)果表明，本發(fā)明提供的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法在質(zhì)粒dna為2μg，與轉(zhuǎn)染試劑比例為1:2時(shí)可獲得較好的轉(zhuǎn)染效果。

實(shí)施例

實(shí)施例1

將濃度為1.2×10⁶的df-1細(xì)胞(購自美國atcc)接種至37℃預(yù)熱的6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清、1μg/ml纖粘蛋白(購自gibco公司)的dmem高糖培養(yǎng)基(購自gibco公司)，同時(shí)將4μgpegfp-c1質(zhì)粒(一種表達(dá)綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體，由實(shí)驗(yàn)室保存)與8μllipofectamine2000(購自invitrogen公司)按照說明書步驟孵育混合后加入6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，12h后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，于不同時(shí)間觀察轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染后的熒光顯微照片如圖1所示，這表明本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)染方法可獲得較好的轉(zhuǎn)染效果。

實(shí)施例2

將濃度為2×10⁶的df-1細(xì)胞接種至37℃預(yù)熱的6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清、1μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基；同時(shí)將4μgrcasbp.b-mstn-gfp質(zhì)粒(一種表達(dá)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的mstn基因過表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存)與10μltranslipidhl(購自全式金公司)按照說明書步驟孵育混合后加入6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，12h后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，于不同時(shí)間觀察轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染后的熒光顯微照片如圖2所示，這表明本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)染方法可適用于不同的轉(zhuǎn)染試劑，并獲得較好的轉(zhuǎn)染效果。

實(shí)施例3

將濃度為1.8×10⁷的df-1細(xì)胞接種至37℃預(yù)熱的10cm培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清、1μg/ml纖粘蛋白的dmem高糖培養(yǎng)基；同時(shí)將20μgrcasbp.b-rfp-u6-sh1質(zhì)粒(一種表達(dá)紅色熒光蛋白報(bào)告基因的mstn基因shrna逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存)與40μllipofectamine2000按照說明書步驟孵育混合后加入10cm培養(yǎng)板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，12h后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，于不同時(shí)間觀察轉(zhuǎn)染效果轉(zhuǎn)染后的熒光顯微照片如圖3所示，這表明本發(fā)明的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法可用于不同的載體類型。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。