本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年12月14日、國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮閜ct/jp2011/078935、中國(guó)國(guó)家階段申請(qǐng)?zhí)枮?01180060832.7、發(fā)明名稱為“蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體導(dǎo)入至少一種懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中、將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段重組到該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中的方法、對(duì)生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的方法、表達(dá)該蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
：利用基因重組技術(shù)的外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)在藥品和食品行業(yè)等各種產(chǎn)業(yè)中得到利用。多數(shù)情況下，重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)通過(guò)如下方法進(jìn)行：將含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的堿基序列的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞等宿主中，選擇出該表達(dá)載體重組到染色體中而得到的轉(zhuǎn)化株，再將該轉(zhuǎn)化株在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)而使其表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。但是，為了開(kāi)發(fā)出能夠高效地生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的宿主，需要根據(jù)每種目標(biāo)蛋白質(zhì)選擇出生產(chǎn)率良好的宿主細(xì)胞，因而期望對(duì)各個(gè)宿主中的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的技術(shù)革新。大腸桿菌等細(xì)菌和酵母的系統(tǒng)與動(dòng)物細(xì)胞不同，大多難以進(jìn)行糖鏈修飾等翻譯后修飾，在生產(chǎn)具有活性的蛋白質(zhì)的方面成為問(wèn)題。昆蟲(chóng)細(xì)胞的系統(tǒng)具有如下優(yōu)點(diǎn)：所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)接受磷酸化、糖鏈附加等翻譯后修飾，能夠在保持原有的生理活性的狀態(tài)下進(jìn)行表達(dá)。但是，分泌蛋白質(zhì)的糖鏈結(jié)構(gòu)與來(lái)源于哺乳類(lèi)的細(xì)胞的糖鏈結(jié)構(gòu)不同，因此，用于藥品用途時(shí)抗原性等成為問(wèn)題。另外，昆蟲(chóng)細(xì)胞的系統(tǒng)在外源基因的導(dǎo)入中使用重組病毒，因此，從安全性的觀點(diǎn)出發(fā)，存在需要使其滅活或?qū)⑵浒竦膯?wèn)題。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的系統(tǒng)而言，能夠以更等同于生物體中制造的蛋白質(zhì)的方式對(duì)以人類(lèi)為代表的高等動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化、糖鏈附加、折疊等翻譯后修飾。這種準(zhǔn)確的翻譯后修飾是在重組蛋白質(zhì)中重現(xiàn)蛋白質(zhì)本來(lái)具有的生理活性所必需的，對(duì)于需要這種生理活性的藥品等，經(jīng)常使用以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為宿主的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。但是，以動(dòng)物細(xì)胞為宿主的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)率一般較低，導(dǎo)入基因的穩(wěn)定性也大多存在問(wèn)題。提高以哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞為宿主的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率不僅在治療用藥品或診斷藥品等的制造中非常重要，對(duì)于它們的開(kāi)發(fā)研究也有很大貢獻(xiàn)。因此，當(dāng)務(wù)之急是開(kāi)發(fā)以哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞、特別是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(cho細(xì)胞)為宿主且能夠容易地獲得高生產(chǎn)株的基因表達(dá)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)座子是能夠從染色體的一個(gè)基因座移動(dòng)到另一個(gè)基因座的轉(zhuǎn)座性遺傳因子。轉(zhuǎn)座子是分子生物學(xué)或遺傳學(xué)的研究中強(qiáng)有力的工具，基于突變導(dǎo)入、基因捕獲、轉(zhuǎn)基因個(gè)體的制作等目的用于昆蟲(chóng)或線蟲(chóng)(例如黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)或秀麗隱桿線蟲(chóng)(caenorhabditiselegans))和植物中，但這種技術(shù)的開(kāi)發(fā)在包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞在內(nèi)的脊椎動(dòng)物中很緩慢。但是，近年來(lái)，在脊椎動(dòng)物中也報(bào)道了具有活性的轉(zhuǎn)座子，并且確認(rèn)了其中若干轉(zhuǎn)座子在小鼠或人類(lèi)等的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也具有活性。作為代表性的轉(zhuǎn)座子，可以列舉：由青鳉克隆得到的轉(zhuǎn)座子tol1(專利文獻(xiàn)1)、tol2(非專利文獻(xiàn)1)、由存在于鮭科魚(yú)類(lèi)基因組中的非自主性轉(zhuǎn)座子重構(gòu)而成的睡美人(sleepingbeauty)(非專利文獻(xiàn)2)、青蛙來(lái)源的人工轉(zhuǎn)座子青蛙王子(frogprince)(非專利文獻(xiàn)3)、昆蟲(chóng)來(lái)源的轉(zhuǎn)座子piggybac(非專利文獻(xiàn)4)。這些dna轉(zhuǎn)座子作為用于給哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組帶來(lái)新的表現(xiàn)型的基因?qū)牍ぞ咭呀?jīng)用于突變導(dǎo)入、基因捕獲、轉(zhuǎn)基因個(gè)體的制作、表達(dá)抗藥性蛋白質(zhì)等(非專利文獻(xiàn)5～12)。對(duì)于昆蟲(chóng)而言，研究了使用鱗翅目昆蟲(chóng)來(lái)源的轉(zhuǎn)座子piggybac將外源基因?qū)爰倚Q染色體并使其表達(dá)該外源基因所編碼的蛋白質(zhì)的方法，并公開(kāi)了使用該技術(shù)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法(專利文獻(xiàn)2)。但是，由于所表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量不充分且在家蠶全身都有生產(chǎn)，因此，為了從存在大量雜質(zhì)蛋白質(zhì)的體液中以高純度的形式回收表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，需要高度的純化技術(shù)，因此在經(jīng)濟(jì)方面存在問(wèn)題。另外，已知使用來(lái)源于青鳉的tol2轉(zhuǎn)座子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)與g418抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)的例子(非專利文獻(xiàn)12、非專利文獻(xiàn)13)。在利用來(lái)源于哺乳動(dòng)物的培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)醫(yī)療用蛋白質(zhì)藥品的情況下，為了防止未知病毒或者病原性多肽的不可預(yù)期的混入，重要的是在其生產(chǎn)步驟中不含來(lái)源于動(dòng)物的成分。cho細(xì)胞作為生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥品的動(dòng)物細(xì)胞最頻繁地使用，通過(guò)近年的研究，也確立了能夠在不使用血清或來(lái)源于動(dòng)物的成分的安全的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的懸浮性cho細(xì)胞株。但是，在無(wú)血清/無(wú)蛋白質(zhì)條件下進(jìn)行基因?qū)攵玫降募?xì)胞株止于在使用血清的條件下進(jìn)行基因?qū)攵玫降募?xì)胞株的一半的生產(chǎn)率(非專利文獻(xiàn)14)，表明在無(wú)血清/無(wú)蛋白質(zhì)條件下的基因?qū)朐诩夹g(shù)上困難。通常而言，用于篩選表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞的選擇標(biāo)記配置在同一基因表達(dá)載體上。這基于如下假說(shuō)：在基因組中存在的基因具有容易表達(dá)的位點(diǎn)和不易表達(dá)的位點(diǎn)(被稱為位置效果，非專利文獻(xiàn)15)，如果表達(dá)選擇標(biāo)記，則也表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。另一方面，還已知：如抗體等那樣，目標(biāo)蛋白質(zhì)由多個(gè)多肽構(gòu)成的情況下，使它們分別用不同的載體表達(dá)。在抗體的情況下，抗體的重鏈的表達(dá)與輕鏈的表達(dá)相比越高，則表示生產(chǎn)率越高(非專利文獻(xiàn)16)。預(yù)測(cè)在同一載體上重鏈與輕鏈的表達(dá)一定，為了得到高生產(chǎn)率，通過(guò)故意地使重鏈和輕鏈用不同的載體表達(dá)，結(jié)果能夠得到以最佳的比表達(dá)的細(xì)胞株。但是，在用多個(gè)不同的載體表達(dá)蛋白質(zhì)的情況下，也需要多個(gè)選擇標(biāo)記基因。作為克服其的方法，報(bào)道了如下例子：將本來(lái)由一條多肽鏈構(gòu)成的dhfr基因分割成兩條多肽鏈，在重鏈表達(dá)載體上配置一條多肽鏈，在輕鏈表達(dá)載體上配置另一條多肽鏈(非專利文獻(xiàn)17)。但是，在非專利文獻(xiàn)17中記載的細(xì)胞是添加在培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分依賴性的cho細(xì)胞，如上所述，與無(wú)血清/無(wú)蛋白質(zhì)條件下的基因?qū)氲那闆r不同，存在基因?qū)胄矢叩目赡苄?。仍然預(yù)測(cè)在不存在病毒感染等危險(xiǎn)性的安全性高的無(wú)血清/無(wú)蛋白質(zhì)條件下進(jìn)行基因?qū)霑r(shí)，難以篩選出生產(chǎn)率高的細(xì)胞?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：國(guó)際公開(kāi)第2008/072540號(hào)專利文獻(xiàn)2：日本特表2001-532188號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：nature383,30(1996)非專利文獻(xiàn)2：cell91,501-510(1997)非專利文獻(xiàn)3：nucleicacidsres,31,6873-6881(2003)非專利文獻(xiàn)4：insectmol.biol.5,141-151(1996)非專利文獻(xiàn)5：genetics.166,895-899(2004)非專利文獻(xiàn)6：plosgenet,2,e169(2006)非專利文獻(xiàn)7：proc.natl.acad.sci.usa95,10769-10773(1998)非專利文獻(xiàn)8：proc.natl.acad.sci.usa98:6759-6764(2001)非專利文獻(xiàn)9：nature436,221-226(2005)非專利文獻(xiàn)10：nucleicacidsres,31,6873-6881(2003)非專利文獻(xiàn)11：nucleicacidsres.35,e87(2007)非專利文獻(xiàn)12：procnatlacadsciusa,103,15008-15013(2006)非專利文獻(xiàn)13：plosgenetics,2,1715-1724(2006)非專利文獻(xiàn)14：biotech.bioeng.96,1118-1126(2007)非專利文獻(xiàn)15：naturebiotech.22,1393-1398(2004)非專利文獻(xiàn)16：biotech.bioeng.96,337-348(2007)非專利文獻(xiàn)17：biotech.bioeng.84,439-444(2003)技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的問(wèn)題為了生產(chǎn)、分析目標(biāo)蛋白質(zhì)，必須使用來(lái)源于哺乳動(dòng)物的培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇穩(wěn)定地高表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞株，但生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞的制作和培養(yǎng)需要大量的勞動(dòng)和時(shí)間。另外，迄今為止已知使用轉(zhuǎn)座子序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的技術(shù)，但關(guān)于通過(guò)使用轉(zhuǎn)座子序列制作能夠作為蛋白質(zhì)的生產(chǎn)系統(tǒng)利用的高表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞的技術(shù)以及使用轉(zhuǎn)座子序列的高生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的制作方法和使用該細(xì)胞的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法還沒(méi)有任何了解。一直以來(lái)期望高效且在短時(shí)間內(nèi)制作如上所述使用哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行高表達(dá)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)從而高生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的技術(shù)。此外，還期望在貫穿從基因?qū)氲缴a(chǎn)株建立的過(guò)程中完全不使用動(dòng)物來(lái)源的成分的生產(chǎn)細(xì)胞的建立。因此，本發(fā)明的目的在于提供能夠高效制作的、高表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞以及使用該細(xì)胞生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。用于解決問(wèn)題的方法本發(fā)明人為了解決上述問(wèn)題而反復(fù)進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端具有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體導(dǎo)入至少一種懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中、使插入在一對(duì)(兩個(gè))轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段重組到該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中，能夠高效地制作該目標(biāo)蛋白質(zhì)。而且還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用該細(xì)胞，能夠高效地生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如下所述。1.一種生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，其中，將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段重組到該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中，得到生產(chǎn)該目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且對(duì)該哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而生產(chǎn)該目標(biāo)蛋白質(zhì)。2.一種生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下的步驟(a)～(c)：(a)將以下的表達(dá)載體(a)和(b)同時(shí)導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，(a)包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體，(b)含有編碼識(shí)別轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶的dna的載體；(b)利用步驟(a)中導(dǎo)入到懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)載體(b)使轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性表達(dá)，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段重組到該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中而得到表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及(c)對(duì)步驟(b)中得到的表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)。3.一種得到生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其中，將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段重組到該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中，得到生產(chǎn)該目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。4.如上述項(xiàng)1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體的至少一種為包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna和選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體。5.如上述項(xiàng)1～4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，除了將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中之外，還將在包含選擇標(biāo)記基因的基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。6.如上述項(xiàng)1～5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna為編碼抗體的dna。7.如上述項(xiàng)6所述的方法，其中，編碼抗體的dna為編碼抗體的h鏈的dna和編碼抗體的l鏈的dna中的至少一種。8.如上述項(xiàng)4～7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將選自下述(a)～(d)的表達(dá)載體導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，(a)包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體、包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體；(b)包含含有編碼抗體的h鏈的dna和選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體；(c)包含含有編碼抗體的l鏈的dna和選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體；(d)包含含有編碼抗體的h鏈、l鏈和選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體。9.如上述項(xiàng)1～8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞為能夠在無(wú)血清培養(yǎng)條件下存活和增殖的細(xì)胞。10.如上述項(xiàng)1～9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞為選自將cho細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中馴化而得到的懸浮性cho細(xì)胞、per.c6細(xì)胞、大鼠骨髓瘤細(xì)胞yb2/3hl.p2.g11.16ag.20(或者也稱為yb2/0)和在懸浮培養(yǎng)中馴化而得到的懸浮性小鼠骨髓瘤細(xì)胞ns0中的任意一種細(xì)胞。11.如上述項(xiàng)10所述的方法，其中，cho細(xì)胞為選自cho-k1、cho-k1sv、dukxb11、cho/dg44、pro-3和cho-s中的任意一種細(xì)胞。12.如上述項(xiàng)4～11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，選擇標(biāo)記基因?yàn)榭狗啪€菌酮基因。13.如上述項(xiàng)12所述的方法，其中，抗放線菌酮基因?yàn)楹颂求w蛋白質(zhì)。14.如上述項(xiàng)1～13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用的一對(duì)來(lái)源于dna型轉(zhuǎn)座子的堿基序列。15.如上述項(xiàng)14所述的方法，其中，一對(duì)來(lái)源于dna型轉(zhuǎn)座子的堿基序列為一對(duì)來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列或者來(lái)源于tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列。16.如上述項(xiàng)15所述的方法，其中，一對(duì)來(lái)源于tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列為由序列號(hào)2表示的堿基序列和由序列號(hào)3表示的堿基序列。17.如上述項(xiàng)15所述的方法，其中，一對(duì)來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列為由序列號(hào)14表示的堿基序列和由序列號(hào)15表示的堿基序列。18.一種懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其通過(guò)將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體(a)和含有編碼識(shí)別該轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶(轉(zhuǎn)移酶)的dna的表達(dá)載體(b)同時(shí)導(dǎo)入而將插入在該一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的該基因片段重組到染色體中并且生產(chǎn)該目標(biāo)蛋白質(zhì)。19.如上述項(xiàng)18所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體(a)為包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna和選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體。20.如上述項(xiàng)18或19所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其為將表達(dá)載體(a)和(b)、以及包含含有選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體(c)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞而得到的細(xì)胞。21.如上述項(xiàng)18～20中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna為編碼抗體的dna。22.如上述項(xiàng)21所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，編碼抗體的dna為編碼抗體的h鏈的dna和編碼抗體的l鏈的dna中的至少一種。23.如上述項(xiàng)18～22中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，導(dǎo)入有選自下述(a)～(d)的表達(dá)載體，(a)包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體、包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體；(b)包含含有編碼抗體的h鏈的dna和選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體；(c)包含含有編碼抗體的l鏈的dna和選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體；(d)包含含有編碼抗體的h鏈、l鏈和選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體。24.如上述項(xiàng)18～23中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其為能夠在無(wú)血清培養(yǎng)條件下存活和增殖的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。25.如上述項(xiàng)18～24中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其為選自將cho細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中馴化而得到的懸浮性cho細(xì)胞、per.c6細(xì)胞、大鼠骨髓瘤細(xì)胞yb2/3hl.p2.g11.16ag.20(或者也稱為yb2/0)和在懸浮培養(yǎng)中馴化而得到的懸浮性小鼠骨髓瘤細(xì)胞ns0中的任意一種懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。26.如上述項(xiàng)25所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，cho細(xì)胞為選自cho-k1、cho-k1sv、dukxb11、cho/dg44、pro-3和cho-s中的任意一種細(xì)胞。27.如上述項(xiàng)19～26中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，選擇標(biāo)記基因?yàn)榭狗啪€菌酮基因。28.如上述項(xiàng)27所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，抗放線菌酮基因?yàn)榫幋a人核糖體蛋白質(zhì)的突變體的基因。29.如上述項(xiàng)19～28中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用的一對(duì)來(lái)源于dna型轉(zhuǎn)座子的堿基序列。30.如上述項(xiàng)29所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，一對(duì)來(lái)源于dna型轉(zhuǎn)座子的堿基序列為一對(duì)來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列或者來(lái)源于tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列。31.如上述項(xiàng)30所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，一對(duì)來(lái)源于tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列為由序列號(hào)2表示的堿基序列和由序列號(hào)3表示的堿基序列。32.如上述項(xiàng)30所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，一對(duì)來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列為由序列號(hào)14表示的堿基序列和由序列號(hào)15表示的堿基序列。33.一種表達(dá)載體，其包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段，并且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列。34.如上述項(xiàng)33所述的表達(dá)載體，其中，一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列為一對(duì)來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列或者來(lái)源于tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列。35.如上述項(xiàng)34所述的表達(dá)載體，其中，一對(duì)來(lái)源于tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列為由序列號(hào)2表示的堿基序列和由序列號(hào)3表示的堿基序列。36.如上述項(xiàng)34所述的表達(dá)載體，其中，一對(duì)來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的序列為由序列號(hào)14表示的堿基序列和由序列號(hào)15表示的堿基序列。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，能夠使用懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效地生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明的細(xì)胞能夠作為用于高效地生產(chǎn)基因重組蛋白質(zhì)或基因重組多肽的生產(chǎn)細(xì)胞使用。附圖說(shuō)明圖1表示抗人流感m2抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的示意圖。tol2-l表示左端tol2轉(zhuǎn)座子(序列號(hào)2)，tol2-r表示右端tol2轉(zhuǎn)座子(序列號(hào)3)，cmv表示cmv啟動(dòng)子，polya表示多聚腺苷酸化位點(diǎn)，hc表示人抗體h鏈cdna，lc表示人抗體l鏈cdna，chx-r表示抗放線菌酮基因。圖2表示抗人流感m2抗體表達(dá)載體的示意圖。cmv表示cmv啟動(dòng)子，polya表示多聚腺苷酸化位點(diǎn)，hc表示人抗體h鏈cdna，lc表示人抗體l鏈cdna，chx-r表示抗放線菌酮基因。圖3表示tol2轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體的示意圖。caggs表示caggs啟動(dòng)子，polya表示多聚腺苷酸化位點(diǎn)，tpasecdna表示tol2轉(zhuǎn)座酶cdna。圖4表示對(duì)使用抗人流感m2抗體表達(dá)tol2轉(zhuǎn)座子載體時(shí)的、懸浮性cho-k1細(xì)胞和粘附性cho-k1細(xì)胞中的抗人流感m2抗體的表達(dá)量進(jìn)行研究而得到的結(jié)果。圖4a表示懸浮性cho-k1細(xì)胞的結(jié)果，圖4b表示粘附性cho-k1細(xì)胞的結(jié)果。在任意一個(gè)圖中，縱軸均表示抗體產(chǎn)生量(μg/ml)，橫軸均表示各細(xì)胞的基因?qū)肟寺【幪?hào)。圖5表示抗人流感m2抗體表達(dá)tol1轉(zhuǎn)座子載體的示意圖。tol1-l表示左端tol1轉(zhuǎn)座子(序列號(hào)14)，tol1-r表示右端tol1轉(zhuǎn)座子(序列號(hào)15)，cmv表示cmv啟動(dòng)子，polya表示多聚腺苷酸化位點(diǎn)，hc表示人抗體h鏈cdna，lc表示人抗體l鏈cdna，chx-r表示抗放線菌酮基因。圖6表示tol1轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體的示意圖。caggs表示caggs啟動(dòng)子，polya表示多聚腺苷酸化位點(diǎn)，tpasecdna表示tol1轉(zhuǎn)座酶cdna。圖7表示對(duì)使用抗人流感m2抗體表達(dá)tol1轉(zhuǎn)座子載體時(shí)的、懸浮性cho-k1細(xì)胞中的抗人流感m2抗體的表達(dá)量進(jìn)行研究而得到的結(jié)果?？v軸表示抗體產(chǎn)生量(μg/ml)，橫軸表示各細(xì)胞的基因?qū)肟寺【幪?hào)。圖8表示抗人cd98抗體重鏈表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的示意圖。tol2-l表示左端tol2轉(zhuǎn)座子(序列號(hào)2)，tol2-r表示右端tol2轉(zhuǎn)座子(序列號(hào)3)，pmo表示莫洛尼小鼠白血病病毒啟動(dòng)子，polya表示多聚腺苷酸化位點(diǎn)，hc表示抗人cd98抗體重鏈cdna(序列號(hào)18)。圖9表示抗人cd98抗體輕鏈表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的示意圖。tol2-l表示左端tol2轉(zhuǎn)座子(序列號(hào)2)，tol2-r表示右端tol2轉(zhuǎn)座子(序列號(hào)3)，cmv表示cmv啟動(dòng)子，polya表示多聚腺苷酸化位點(diǎn)，lc表示抗人cd98抗體輕鏈cdna(序列號(hào)21)。圖10表示抗放線菌酮基因表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的示意圖。tol2-l表示左端tol2轉(zhuǎn)座子(序列號(hào)2)，tol2-r表示右端tol2轉(zhuǎn)座子(序列號(hào)3)，cmv表示cmv啟動(dòng)子，polya表示多聚腺苷酸化位點(diǎn)，chx-r表示抗放線菌酮基因(序列號(hào)7)。圖11表示將tnfα-chx串聯(lián)載體、或者tnfαh-chx載體以及tnfαl載體向cho-k1細(xì)胞進(jìn)行基因?qū)霑r(shí)的、抗人tnfα抗體產(chǎn)生量?？v軸表示培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗體濃度(mg/ml)，對(duì)照區(qū)用對(duì)照表示，實(shí)驗(yàn)區(qū)用exp.表示。圖12表示將cd20-chx串聯(lián)載體、或者cd20h-chx載體以及cd20l載體向cho-k1細(xì)胞進(jìn)行基因?qū)霑r(shí)的、抗人cd20抗體產(chǎn)生量?？v軸表示培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抗體濃度(mg/ml)，對(duì)照區(qū)用對(duì)照表示，實(shí)驗(yàn)區(qū)用exp.表示。圖13表示抗體表達(dá)載體a的結(jié)構(gòu)。圖13中，tol2-l表示由tol2-l序列(序列號(hào)2)構(gòu)成的dna片段，tol2-r表示由tol2-r序列(序列號(hào)3)構(gòu)成的dna片段，cmv表示cmv啟動(dòng)子，polya表示多聚腺苷酸化位點(diǎn)，hc表示抗人cd98抗體的重鏈基因，lc表示抗人cd98抗體輕鏈基因，so表示sv40啟動(dòng)子，sv表示sv40多聚腺苷酸化位點(diǎn)，neo-r表示抗新霉素基因。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中、將插入在一對(duì)(兩個(gè))轉(zhuǎn)座子序列之間的含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段重組到懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中的方法、對(duì)生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的方法以及表達(dá)該蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。作為本發(fā)明的生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法(以下也稱為本發(fā)明的方法)，可以列舉包括以下的步驟(a)～(c)的生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。步驟(a)將以下的表達(dá)載體(a)和(b)同時(shí)導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，(a)包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體，(b)含有編碼識(shí)別轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶的dna的載體；步驟(b)利用步驟(a)中導(dǎo)入到懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)載體(b)使轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性表達(dá)，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段重組到上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中而得到表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及步驟(c)對(duì)步驟(b)中得到的表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明涉及一種懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，導(dǎo)入有包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的該基因片段重組到染色體中，并且生產(chǎn)該目標(biāo)蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是指由一個(gè)以上多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠進(jìn)行表達(dá)至少一種目標(biāo)蛋白質(zhì)和/或表達(dá)至少一個(gè)多肽中的任意一種。包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體是指一種或兩種以上的該表達(dá)載體。具體而言，為了表達(dá)由多個(gè)多肽構(gòu)成的目標(biāo)蛋白質(zhì)，使用包含含有編碼各多肽的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的多個(gè)表達(dá)載體。更具體而言，例如，在上述由多個(gè)多肽構(gòu)成的目標(biāo)蛋白質(zhì)為抗體的情況下，可以通過(guò)一種表達(dá)載體表達(dá)抗體的h鏈和l鏈，也可以使用表達(dá)h鏈的載體和表達(dá)l鏈的載體這兩種表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠使用導(dǎo)入包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體、將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的該基因片段重組到染色體中并且生產(chǎn)該目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)制造目標(biāo)蛋白質(zhì)。作為基因插入的指標(biāo)的選擇標(biāo)記基因可以重組到與含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的表達(dá)載體相同的載體上，也可以重組到其他載體上。即，可以將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體中的至少一種設(shè)定為包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna和選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體。另外，除了可以將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中之外，還可以將包含含有選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。具體而言，作為本發(fā)明的生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，可以列舉包括以下的步驟(a)～(c)的生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。步驟(a)將以下的表達(dá)載體(a)和(b)同時(shí)導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，(a)包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna和選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的蛋白質(zhì)表達(dá)載體，(b)含有編碼識(shí)別轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶的dna的載體；步驟(b)利用步驟(a)中導(dǎo)入到懸浮性動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)載體(b)使轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性表達(dá)，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的上述基因片段重組到該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中而得到表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及步驟(c)對(duì)步驟(b)中得到的表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)。另外，作為本發(fā)明的生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，可以列舉包括以下的步驟(a)～(c)的生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。步驟(a)將以下的表達(dá)載體(a)、(b)和(c)同時(shí)導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，(a)包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體，(b)在選擇標(biāo)記基因的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(c)含有編碼識(shí)別轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶的dna的載體；步驟(b)利用步驟(a)中導(dǎo)入到懸浮性動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)載體(c)使轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性表達(dá)，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的上述基因片段重組到該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中而得到表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞；步驟(c)對(duì)步驟(b)中得到的表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及一種懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，導(dǎo)入有包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種表達(dá)載體和在選擇標(biāo)記基因的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的該基因片段和選擇標(biāo)記基因重組到染色體中，并且生產(chǎn)該目標(biāo)蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明涉及一種懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中，導(dǎo)入有包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna和選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的蛋白質(zhì)表達(dá)載體，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的該基因片段重組到染色體中，并且生產(chǎn)該目標(biāo)蛋白質(zhì)。另外，作為本發(fā)明的生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以列舉通過(guò)將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna和選擇標(biāo)記基因的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的蛋白質(zhì)表達(dá)載體(a)和含有編碼識(shí)別該轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶(轉(zhuǎn)移酶)的dna的載體(b)同時(shí)導(dǎo)入而將插入在該一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的該基因片段重組到染色體中并且生產(chǎn)該目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明中，包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的、導(dǎo)入到懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)載體只要能夠利用該哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)和制造目標(biāo)蛋白質(zhì)，則數(shù)目沒(méi)有限制，可以優(yōu)選列舉1～20種表達(dá)載體，可以更優(yōu)選列舉2～10種表達(dá)載體，優(yōu)選例如3～8種表達(dá)載體、4～7種表達(dá)載體、1～6種表達(dá)載體、1～5種表達(dá)載體、1～4種表達(dá)載體、1～3種表達(dá)載體。另外，作為本發(fā)明的方式，可以列舉：通過(guò)將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的至少一種蛋白質(zhì)表達(dá)載體(a)和含有編碼識(shí)別該轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶的dna的載體(b)同時(shí)導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中而將插入在該一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的該基因片段向該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中的重組增加的方法；將編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna以高頻率重組到該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中的方法；以及通過(guò)該方法得到的生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本說(shuō)明書(shū)中，“轉(zhuǎn)座子”為轉(zhuǎn)座性遺傳因子，是指在保持一定結(jié)構(gòu)的狀態(tài)下在染色體上轉(zhuǎn)座(transposition)或者從染色體轉(zhuǎn)座到其他染色體上的基因單元。轉(zhuǎn)座子包含在基因單元的兩端具有反向或同向的重復(fù)的轉(zhuǎn)座子序列[也稱為反向重復(fù)序列(ir序列)或末端反向重復(fù)序列(tir序列)]和編碼識(shí)別該轉(zhuǎn)座子序列并使存在于轉(zhuǎn)座子序列之間的基因發(fā)生轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座酶的堿基序列。由轉(zhuǎn)座子翻譯而成的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別轉(zhuǎn)座子兩端的轉(zhuǎn)座子序列，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的dna片段切出并插入到轉(zhuǎn)移目的地，由此能夠進(jìn)行dna的轉(zhuǎn)移。本說(shuō)明書(shū)中，“轉(zhuǎn)座子序列”是指被轉(zhuǎn)座酶識(shí)別的轉(zhuǎn)座子的堿基序列，與ir序列或tir序列具有相同的含義。包含該堿基序列的dna只要能夠在轉(zhuǎn)座酶的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)移(插入到基因組中的其他位置)則也可以含有不完全的重復(fù)部分，存在對(duì)轉(zhuǎn)座酶具有特異性的轉(zhuǎn)座子序列。本發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)座子序列優(yōu)選為來(lái)源于dna型轉(zhuǎn)座子的堿基序列，更優(yōu)選為被轉(zhuǎn)座酶識(shí)別的、能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座的天然或人工的一對(duì)來(lái)源于dna型轉(zhuǎn)座子的堿基序列。作為來(lái)源于dna型轉(zhuǎn)座子的堿基序列，可以列舉例如：來(lái)源于青鳉來(lái)源的tol1和tol2轉(zhuǎn)座子、由存在于鮭科魚(yú)類(lèi)基因組中的非自主性轉(zhuǎn)座子重構(gòu)而成的睡美人(sleepingbeauty)、青蛙來(lái)源的人工轉(zhuǎn)座子青蛙王子(frogprince)和昆蟲(chóng)來(lái)源的轉(zhuǎn)座子piggybac的堿基序列。這些中，優(yōu)選來(lái)源于由序列表的序列號(hào)6表示的堿基序列構(gòu)成的青鳉來(lái)源的tol2轉(zhuǎn)座子和由序列表的序列號(hào)13表示的堿基序列構(gòu)成的青鳉來(lái)源的tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列。作為一對(duì)來(lái)源于tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列，可以列舉：由序列表的序列號(hào)6表示的tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列的第1位至第2229位的堿基序列和第4148位至第4682位的堿基序列。作為一對(duì)來(lái)源于tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列，可以更優(yōu)選列舉：由序列表的序列號(hào)1表示的tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列中第1位至第200位的堿基序列(序列號(hào)2)(以下，記作tol2-l序列)和第2285位至第2788位的堿基序列(序列號(hào)3)(以下，記作tol2-r序列)。作為一對(duì)來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列，可以列舉：由序列表的序列號(hào)13表示的tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列中第1位至第157位的堿基序列和第1748位至第1855位的堿基序列。作為一對(duì)來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列，可以更優(yōu)選列舉：由序列表的序列號(hào)13表示的tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列中第1位至第200位的堿基序列(序列號(hào)14)(以下，記作“tol1-l序列”)和第1351位至第1855位的堿基序列(序列號(hào)15)(以下，記作tol1-r序列)。本發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)座子序列也包括通過(guò)使用上述的轉(zhuǎn)座子來(lái)源的轉(zhuǎn)座子序列的部分序列、調(diào)節(jié)堿基序列的長(zhǎng)度以及利用堿基序列的添加、缺失或取代進(jìn)行改變而對(duì)轉(zhuǎn)移反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控后的轉(zhuǎn)座子序列。作為本發(fā)明的生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，也包括使用至少兩種轉(zhuǎn)座子序列和至少兩種轉(zhuǎn)座酶來(lái)制造至少一種目標(biāo)蛋白質(zhì)。具體而言，可以列舉例如包括如下步驟的蛋白質(zhì)的制造方法：將插入在兩個(gè)tol1轉(zhuǎn)座子序列中的第一個(gè)含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的載體、插入在兩個(gè)tol2轉(zhuǎn)座子序列中的第二個(gè)含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的載體、tol1轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體和tol2轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體同時(shí)或者依次導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，使各個(gè)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna重組到該哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中，獲得生產(chǎn)兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。另外，第一個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)與第二個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)可以相同，也可以通過(guò)使導(dǎo)入細(xì)胞中的基因的拷貝數(shù)增加來(lái)提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率。轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的調(diào)控可以通過(guò)促進(jìn)或抑制利用轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座子序列的識(shí)別來(lái)促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)移反應(yīng)。另外，轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)可以通過(guò)縮短一對(duì)(兩個(gè))轉(zhuǎn)座子序列之間含有的堿基序列的長(zhǎng)度而使該轉(zhuǎn)移反應(yīng)增強(qiáng)，可以通過(guò)延長(zhǎng)一對(duì)(兩個(gè))轉(zhuǎn)座子序列之間含有的堿基序列的長(zhǎng)度而使轉(zhuǎn)移反應(yīng)減弱。因此，在表達(dá)、制造由多個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)成的目標(biāo)蛋白質(zhì)的情況下，可以制作將編碼各蛋白質(zhì)的dna重組到各自的表達(dá)載體中、使該dna重組到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)并且生產(chǎn)該目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并使用該細(xì)胞來(lái)制造目標(biāo)蛋白質(zhì)。本說(shuō)明書(shū)中，“轉(zhuǎn)座酶”是指識(shí)別具有轉(zhuǎn)座子序列的堿基序列并使存在于該堿基序列之間的基因片段在染色體上轉(zhuǎn)座或者從染色體轉(zhuǎn)座到其他染色體上的酶。作為轉(zhuǎn)座酶，可以列舉例如來(lái)源于青鳉來(lái)源的tol1和tol2、由存在于鮭科魚(yú)類(lèi)基因組中的非自主性轉(zhuǎn)座子重構(gòu)而成的睡美人(sleepingbeauty，sb)、睡美人11(sleepingbeauty11，sb11)、青蛙來(lái)源的人工轉(zhuǎn)座子青蛙王子(frogprince，fp)或昆蟲(chóng)來(lái)源的轉(zhuǎn)座子piggybac(pb)的酶。轉(zhuǎn)座酶可以使用天然型酶，只要保持與轉(zhuǎn)座酶同樣的轉(zhuǎn)座活性，也可以對(duì)其一部分氨基酸進(jìn)行取代、缺失、插入和/或添加。通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)座酶的酶活性，能夠調(diào)控存在于轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。分析是否保持與轉(zhuǎn)座酶同樣的轉(zhuǎn)移活性時(shí)，可以利用日本特開(kāi)2003-235575號(hào)公報(bào)所公開(kāi)的雙組分分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。具體而言，可以分別使用含有tol2轉(zhuǎn)座酶發(fā)生缺陷的tol2轉(zhuǎn)座子(tol2來(lái)源的非自主性轉(zhuǎn)座子)的質(zhì)粒和含有tol2轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒，對(duì)非自主性tol2元件是否能夠在轉(zhuǎn)座酶的作用下轉(zhuǎn)移、插入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體內(nèi)進(jìn)行分析。本說(shuō)明書(shū)中，“非自主性轉(zhuǎn)座子”是指存在于轉(zhuǎn)座子內(nèi)的轉(zhuǎn)座酶發(fā)生缺陷、不能自主性地轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座子。對(duì)于非自主性轉(zhuǎn)座子而言，可以通過(guò)使細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在轉(zhuǎn)座酶的蛋白質(zhì)、編碼轉(zhuǎn)座酶的蛋白質(zhì)的mrna或編碼轉(zhuǎn)座酶的蛋白質(zhì)的dna而將插入在非自主性轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座子序列之間的dna轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)。轉(zhuǎn)座酶基因是指編碼轉(zhuǎn)座酶的基因。為了提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)效率，可以在該基因的翻譯起始密碼子atg的上游連接有kozak的共有序列(kozak,m.nucleicacidsres.,12,857-872,1984)或者將作為核糖體結(jié)合序列的夏因-達(dá)爾加諾(shine-dalgarno)序列與起始密碼子之間調(diào)節(jié)至適當(dāng)距離(例如6～18個(gè)堿基)而得到的序列。本發(fā)明的方法中，為了將至少一種表達(dá)載體中的編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna重組到宿主細(xì)胞的染色體中，將包含含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，使轉(zhuǎn)座酶對(duì)導(dǎo)入到該細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)載體中含有的轉(zhuǎn)座子序列發(fā)揮作用。為了使轉(zhuǎn)座酶對(duì)導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)載體中含有的轉(zhuǎn)座子序列發(fā)揮作用，可以將轉(zhuǎn)座酶注入該細(xì)胞內(nèi)，也可以將包含編碼轉(zhuǎn)座酶的dna的表達(dá)載體與包含至少一種編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna或者包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna和選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。另外，也可以將編碼轉(zhuǎn)座酶基因的rna導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使轉(zhuǎn)座酶在該細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。作為表達(dá)載體，沒(méi)有特別限定，可以根據(jù)重組有轉(zhuǎn)座酶基因的載體所要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞、用途等從本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的表達(dá)載體中適當(dāng)選擇來(lái)使用。本發(fā)明中，在生產(chǎn)由兩種以上的多肽構(gòu)成的目標(biāo)蛋白質(zhì)、或者兩種以上的目標(biāo)蛋白質(zhì)的情況下，將編碼各蛋白質(zhì)的dna重組到同一表達(dá)載體中，或者重組到各自不同的表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，由此，能夠制作該dna重組到該細(xì)胞的染色體中的蛋白質(zhì)生產(chǎn)細(xì)胞。轉(zhuǎn)座酶可以重組到表達(dá)載體中與目標(biāo)蛋白質(zhì)一起表達(dá)，也可以重組到表達(dá)載體之外的載體中進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)座酶可以暫時(shí)性地起作用，也可以持續(xù)性地起作用，為了制作穩(wěn)定的產(chǎn)生細(xì)胞，優(yōu)選使轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性地起作用。作為使轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性地起作用的方法，可以列舉例如將編碼轉(zhuǎn)座酶的dna重組到含有編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的表達(dá)載體之外的表達(dá)載體中并將兩表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法。本說(shuō)明書(shū)中，“表達(dá)載體”是指為了轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞并表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)而使用的表達(dá)載體。本發(fā)明中使用的表達(dá)載體具有在表達(dá)盒的兩側(cè)至少存在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的結(jié)構(gòu)。本說(shuō)明書(shū)中，“表達(dá)盒”是指具有用于表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)所需要的基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域和編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的序列的核酸序列。作為該基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域，可以列舉例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和終止子等。表達(dá)盒中可以含有選擇標(biāo)記基因。作為啟動(dòng)子，只要能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能則可以使用任意一種啟動(dòng)子?？梢粤信e例如：巨細(xì)胞病毒(cmv)的ie(immediateearly，即刻早期)基因的啟動(dòng)子、sv40的初期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、srα啟動(dòng)子、莫洛尼小鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等。另外，可以將人cmv的ie基因的增強(qiáng)子與啟動(dòng)子一起使用。“選擇標(biāo)記基因”是指能夠用于區(qū)別導(dǎo)入有質(zhì)粒載體的細(xì)胞和缺少該載體的細(xì)胞的任意的標(biāo)記基因。作為選擇標(biāo)記基因，可以列舉例如：抗藥性基因[抗新霉素基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因、抗嘌呤霉素基因、抗殺稻瘟菌素基因、抗博萊霉素基因、抗潮霉素基因、抗放線菌酮基因(日本特開(kāi)2002-262879號(hào)公報(bào))]以及熒光或生物發(fā)光標(biāo)記基因(綠色熒光蛋白gfp等)等。本發(fā)明中，優(yōu)選的選擇標(biāo)記為抗藥性基因，特別優(yōu)選的選擇標(biāo)記為抗放線菌酮基因。另外，通過(guò)對(duì)選擇標(biāo)記基因進(jìn)行基因改變而制作氨基酸改變體或者調(diào)節(jié)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯(例如，啟動(dòng)子的改變以及氨基酸密碼子的改變等)，也可以改變選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗藥性能和發(fā)光能力。另外，通過(guò)調(diào)節(jié)藥劑濃度，也可以選擇抗藥性強(qiáng)度不同的選擇標(biāo)記基因?qū)爰?xì)胞。為了調(diào)節(jié)選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗藥性能和發(fā)光能力，優(yōu)選使用弱化的選擇標(biāo)記基因。弱化的選擇標(biāo)記基因是指以使選擇標(biāo)記基因所編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的活性降低的方式進(jìn)行改變后的選擇標(biāo)記基因。作為以使細(xì)胞內(nèi)的活性降低的方式進(jìn)行改變后的選擇標(biāo)記基因，可以列舉例如：(a)通過(guò)改變選擇標(biāo)記基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列而使該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的活性降低的選擇標(biāo)記基因，以及(b)通過(guò)改變對(duì)選擇標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的堿基序列或改變選擇標(biāo)記基因的orf(openreadingframe，開(kāi)放讀碼框)內(nèi)的堿基序列而使該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量降低的選擇標(biāo)記基因。作為通過(guò)改變選擇標(biāo)記基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列而使該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的活性降低的選擇標(biāo)記基因，可以列舉例如：sauteretal.[biotech.bioeng.89,530-538(2005)]或chenetal.[journalofimmunologicalmethods295,49-56(2004)]中記載的抗新霉素基因。作為通過(guò)改變對(duì)選擇標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的堿基序列而使該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量降低的方法，可以列舉例如：對(duì)調(diào)控選擇標(biāo)記基因的表達(dá)的啟動(dòng)子序列、終止子序列、增強(qiáng)子序列、kozak的共有序列或夏因-達(dá)爾加諾序列的序列進(jìn)行改變的方法。更具體而言，可以列舉例如：將調(diào)控選擇標(biāo)記基因的表達(dá)的啟動(dòng)子序列取代成更弱的啟動(dòng)子序列的方法。作為通過(guò)改變選擇標(biāo)記基因的orf內(nèi)的堿基序列而使該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量降低的方法，可以列舉例如將該orf內(nèi)的密碼子取代成在該細(xì)胞內(nèi)的使用頻率更低的同義密碼子的方法。作為本發(fā)明的弱化的選擇標(biāo)記基因，可以列舉例如：將上述的該基因的orf內(nèi)的密碼子取代成在該細(xì)胞內(nèi)的使用頻率更低的同義密碼子的選擇標(biāo)記基因。在各種生物種類(lèi)的細(xì)胞內(nèi)，各同義密碼子中使用頻率更低的同義密碼子可以基于公知的文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行選擇。這種取代成使用頻率低的同義密碼子的取代，具體而言，例如，在cho細(xì)胞的情況下，是指將亮氨酸的密碼子取代成tta、將精氨酸的密碼子取代成cga或cgt、將丙氨酸的密碼子取代成gcg、將纈氨酸的密碼子取代成gta、將絲氨酸的密碼子取代成tcg、將異亮氨酸的密碼子取代成ata、將蘇氨酸的密碼子取代成acg、將脯氨酸的密碼子取代成ccg、將谷氨酸的密碼子取代成gaa、將酪氨酸的密碼子取代成tat、將賴氨酸的密碼子取代成aaa、將苯丙氨酸的密碼子取代成ttt、將組氨酸的密碼子取代成cat、將谷氨酰胺的密碼子取代成caa、將天冬酰胺的密碼子取代成aat、將天冬氨酸的密碼子取代成gat、將半胱氨酸的密碼子取代成tgt或者將甘氨酸的密碼子取代成ggt。弱化的選擇標(biāo)記基因中，只要能夠高效地獲得生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞則與改變前的選擇標(biāo)記基因相比被取代的密碼子數(shù)沒(méi)有特別限制，優(yōu)選對(duì)20個(gè)以上的氨基酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子進(jìn)行取代。弱化的選擇標(biāo)記基因中，與改變前的選擇標(biāo)記基因相比被改變的堿基數(shù)沒(méi)有特別限制，優(yōu)選對(duì)編碼選擇標(biāo)記基因的堿基序列的10％以上進(jìn)行改變。另外，弱化的選擇標(biāo)記基因中取代的密碼子所編碼的氨基酸殘基沒(méi)有特別限制，可以優(yōu)選列舉亮氨酸、丙氨酸、絲氨酸和纈氨酸。弱化的選擇標(biāo)記基因中，在對(duì)亮氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子進(jìn)行取代的情況下，沒(méi)有特別限制，優(yōu)選對(duì)選擇標(biāo)記基因中含有的全部亮氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子中70％以上的亮氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子進(jìn)行取代。另外，弱化的選擇標(biāo)記基因中，在對(duì)丙氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子進(jìn)行取代的情況下，沒(méi)有特別限制，優(yōu)選對(duì)選擇標(biāo)記基因中含有的全部丙氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子中70％以上的丙氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子進(jìn)行取代。作為這種通過(guò)取代成使用頻率低的同義密碼子而改變得到的、弱化的選擇標(biāo)記基因的例子，具體而言，可以列舉：由序列號(hào)37、38或39表示的堿基序列構(gòu)成的抗新霉素基因、由序列號(hào)41、43或44表示的堿基序列構(gòu)成的抗嘌呤霉素基因、由序列號(hào)45或46表示的堿基序列構(gòu)成的抗博萊霉素基因、由序列號(hào)47或48表示的堿基序列構(gòu)成的抗潮霉素基因。另外，也可以通過(guò)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞的制作中使選擇抗藥性細(xì)胞時(shí)的藥劑的濃度與通常使用的濃度相比顯著提高或在藥劑代謝、分解之前追加施用抗藥性基因等來(lái)使選擇標(biāo)記基因弱化。放線菌酮(以下，也有時(shí)簡(jiǎn)記為chx)為蛋白質(zhì)合成抑制劑，作為將抗chx基因用作選擇標(biāo)記的例子，已知酵母[kondok.j.bacteriol.,177,24,7171-7177(1995)]、動(dòng)物細(xì)胞(日本特開(kāi)2002-262879號(hào)公報(bào))的例子。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞而言，明確了使由序列表的序列號(hào)5表示的堿基序列編碼的人核糖體蛋白質(zhì)亞單位的l36a的54位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺的、表達(dá)由序列表的序列號(hào)7表示的堿基序列編碼的蛋白質(zhì)而得到的轉(zhuǎn)化株賦予對(duì)放線菌酮的抗性。另外，作為抗放線菌酮標(biāo)記，可以列舉例如：人核糖體蛋白質(zhì)亞單位l44的54位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺的突變?nèi)撕颂求w蛋白質(zhì)亞單位l44。作為將包含上述轉(zhuǎn)座子序列的蛋白質(zhì)表達(dá)載體、表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒載體或rna導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法，沒(méi)有特別限定，可以列舉例如磷酸鈣法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、基因槍法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等。在將轉(zhuǎn)座酶以蛋白質(zhì)的形式直接導(dǎo)入的情況下，可以列舉例如通過(guò)顯微注射法或胞吞作用供給到細(xì)胞內(nèi)的方法?；?qū)肟梢酝ㄟ^(guò)新基因工程手冊(cè)、村松正實(shí)、山本雅編著、羊土社、isbn9784897063737中記載的方法進(jìn)行。作為宿主細(xì)胞，可以列舉能夠傳代培養(yǎng)且能夠穩(wěn)定地表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。作為宿主細(xì)胞，可以列舉例如：per.c6細(xì)胞、人白血病細(xì)胞那馬瓦(namalwa)細(xì)胞、猴細(xì)胞cos細(xì)胞、大鼠骨髓瘤細(xì)胞yb2/3hl.p2.g11.16ag.20(或者也稱為yb2/0)、小鼠骨髓瘤細(xì)胞ns0、小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0-ag14、敘利亞倉(cāng)鼠細(xì)胞bhk、hbt5637(日本特開(kāi)昭63-000299號(hào)公報(bào))、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞cho細(xì)胞[journalofexperimentalmedicine,108,945(1958)；proc.natl.acad.sci.usa,601275(1968)；genetics,55,513(1968)；chromosoma,41,129(1973)；methodsincellscience,18,115(1996)；radiationresearch,148,260(1997)；proc.natl.acad.sci.usa,77,4216(1980)；proc.natl.acad.sci.,60,1275(1968)；cell,6,121(1975)；molecularcellgenetics,appendixi,ii(pp.883-900)]、cho/dg44、cho-k1(atccccl-61)、dukxb11(atccccl-9096)、pro-5(atccccl-1781)、cho-s(lifetechnologies,cat#11619)、pro-3和cho細(xì)胞的亞系。另外，上述宿主細(xì)胞也可以通過(guò)改變?nèi)旧wdna和導(dǎo)入外源性基因等以適合蛋白質(zhì)生產(chǎn)的方式進(jìn)行改變后用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。另外，作為宿主細(xì)胞，為了調(diào)控生產(chǎn)的目標(biāo)蛋白質(zhì)上結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)，也可以使用獲得了植物凝集素抗性的lec13[somaticcellandmoleculargenetics,12,55(1986)]、α1,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因發(fā)生缺陷的cho細(xì)胞(國(guó)際公開(kāi)第05/35586號(hào)、國(guó)際公開(kāi)第02/31140號(hào))、gdp-甘露糖4,6-脫水酶(gmd)發(fā)生缺陷的細(xì)胞和fx蛋白質(zhì)發(fā)生缺陷的細(xì)胞。本發(fā)明中，目標(biāo)蛋白質(zhì)也包括由至少一種多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)、由多種多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合蛋白質(zhì)中的任意一種。另外，本發(fā)明中，蛋白質(zhì)與多肽的含義相同，但有時(shí)也將較低分子量的蛋白分子或者構(gòu)成復(fù)合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)定義為多肽。本發(fā)明中，目標(biāo)蛋白質(zhì)只要能夠通過(guò)本發(fā)明的方法表達(dá)，則可以為任意的蛋白質(zhì)、多肽。具體而言，可以列舉例如：人血清蛋白、白蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)、肽類(lèi)激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、血液凝固因子、纖溶類(lèi)蛋白質(zhì)、抗體、選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)、膜蛋白質(zhì)和各種蛋白質(zhì)的部分片段等。具體而言，可以列舉例如：人靜脈免疫球蛋白(ivig)、紅細(xì)胞生成素(epo)、白蛋白、生長(zhǎng)激素(gh)、卵泡刺激激素(fsh)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-i(igf-i)、干擾素(inf)、fas配體、血液凝固因子(ii、vii、viii、ix、x)、凝血酶原、纖維蛋白原、蛋白c、蛋白s、抗凝血酶iii(atiii)、組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tpa)、單克隆抗體、多克隆抗體以及藥劑選擇(抗性)基因等。抗體是由抗體重鏈(h鏈)多肽和兩條抗體輕鏈(l鏈)多肽構(gòu)成的分子，已知iga、igd、ige、igg和igm亞類(lèi)。另外，igg分類(lèi)成igg1、igg2、igg3和igg4類(lèi)。igg抗體是指由兩條h鏈多肽和兩條l鏈多肽構(gòu)成的異四聚體分子。h鏈和l鏈分別由與抗原結(jié)合相關(guān)的可變區(qū)(v)和恒定區(qū)(c)構(gòu)成，被稱為vh、ch、vl或cl。ch區(qū)進(jìn)一步分類(lèi)成ch1區(qū)、ch2區(qū)、ch3區(qū)，將ch2區(qū)和ch3區(qū)合并稱為fc區(qū)或者簡(jiǎn)稱為fc?？贵w包括與單一表位反應(yīng)的單克隆抗體、與多個(gè)表位反應(yīng)的多克隆抗體、基因重組抗體。單克隆抗體是指單一克隆的抗體產(chǎn)生細(xì)胞分泌的抗體，僅識(shí)別一個(gè)表位(也稱為抗原決定簇)，構(gòu)成單克隆抗體的氨基酸序列(一級(jí)結(jié)構(gòu))是均勻的。多克隆抗體是指單克隆抗體的混合物，能夠與多個(gè)表位反應(yīng)。作為基因重組抗體，可以列舉例如：嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、fc融合蛋白、fc氨基酸改變抗體、多價(jià)抗體及該部分片段等。氨基酸改變抗體可以對(duì)可變區(qū)或恒定區(qū)中的任意一個(gè)部分實(shí)施氨基酸殘基改變，使抗體的活性得到調(diào)控。多價(jià)抗體有與一個(gè)抗原上的兩個(gè)以上不同的表位反應(yīng)的多價(jià)抗體、與兩個(gè)以上不同的抗原反應(yīng)的多價(jià)抗體等，可以為其中的任意一種。另外，只要是維持與抗原的結(jié)合活性的多價(jià)抗體，則可以為任意結(jié)構(gòu)的多價(jià)抗體(國(guó)際公開(kāi)第2001/77342號(hào)、美國(guó)專利第7612181號(hào)說(shuō)明書(shū)、國(guó)際公開(kāi)第2009/131239號(hào))。根據(jù)本發(fā)明的制造方法，能夠表達(dá)、制造上述任意的目標(biāo)蛋白質(zhì)和/或目標(biāo)肽。作為本發(fā)明的導(dǎo)入有至少一種編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的細(xì)胞，可以列舉通過(guò)以下的(a)和(b)的步驟制造的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，步驟(a)將選自以下的(a)～(c)中的一種表達(dá)載體的組合或表達(dá)載體(d)、以及表達(dá)載體(e)同時(shí)導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，(a)包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體、包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體；(b)包含含有編碼抗體的h鏈的dna和編碼選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體；(c)包含含有編碼抗體的l鏈的dna和編碼抗藥性基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體；(d)包含含有編碼抗體的h鏈、l鏈和選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體；(e)含有編碼識(shí)別轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶的dna的載體；步驟(b)利用步驟(a)中導(dǎo)入到懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)載體(e)使轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性表達(dá)，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的上述h鏈、l鏈和選擇標(biāo)記基因重組到上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中，選擇出表達(dá)抗體的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。作為本發(fā)明的制造抗體的方法，可以列舉包括以下的步驟(a)～(c)的、生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，步驟(a)將選自以下的(a)～(c)中的一種表達(dá)載體的組合或表達(dá)載體(d)、以及表達(dá)載體(e)同時(shí)導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，(a)包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體、包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(b)包含含有編碼抗體的h鏈的dna和編碼抗藥性基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(c)包含含有編碼抗體的l鏈的dna和編碼選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(d)包含含有編碼抗體的h鏈、l鏈和選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(e)含有編碼識(shí)別轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶的dna的載體；步驟(b)利用步驟(a)中導(dǎo)入到懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)載體(e)使轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性表達(dá)，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的上述h鏈、l鏈和選擇標(biāo)記基因重組到上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中，得到表達(dá)抗體的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞；步驟(c)對(duì)步驟(b)中得到的表達(dá)抗體的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而生產(chǎn)抗體。另外，本發(fā)明包括包含以下的(a)和(b)的步驟的抗體高生產(chǎn)株的制造方法以及篩選方法，步驟(a)將選自以下的(a)～(c)中的一種表達(dá)載體的組合或表達(dá)載體(d)、以及表達(dá)載體(e)同時(shí)導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，(a)包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體、包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(b)包含含有編碼抗體的h鏈的dna和編碼選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(c)包含含有編碼抗體的l鏈的dna和編碼選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(d)包含含有編碼抗體的h鏈、l鏈和選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(e)含有編碼識(shí)別轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶的dna的載體；步驟(b)利用步驟(a)中導(dǎo)入到懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)載體(e)使轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性表達(dá)，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的上述h鏈、l鏈和選擇標(biāo)記基因重組到上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中，選擇出高表達(dá)抗體的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。另外，本發(fā)明包括包含以下的(a)、(b)和(c)的步驟的抗體制造方法，步驟(a)將選自以下的(a)～(c)中的一種表達(dá)載體的組合或表達(dá)載體(d)、以及表達(dá)載體(e)同時(shí)導(dǎo)入懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，(a)包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體、包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(b)包含含有編碼抗體的h鏈的dna和編碼選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的l鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(c)包含含有編碼抗體的l鏈的dna和編碼選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體以及包含含有編碼抗體的h鏈的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(d)包含含有編碼抗體的h鏈、l鏈和選擇標(biāo)記基因的dna的基因片段且在該基因片段的兩端含有一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)載體，(e)含有編碼識(shí)別轉(zhuǎn)座子序列且具有使插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的基因片段轉(zhuǎn)移到染色體上的活性的轉(zhuǎn)座酶的dna的載體；步驟(b)利用步驟(a)中導(dǎo)入到懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)載體(e)使轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性表達(dá)，將插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的上述h鏈、l鏈和選擇標(biāo)記基因重組到上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體中，得到表達(dá)抗體的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞；步驟(c)對(duì)步驟(b)中得到的表達(dá)抗體的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而生產(chǎn)抗體。作為本發(fā)明的導(dǎo)入有至少一種編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的dna的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以列舉例如：導(dǎo)入有多個(gè)不同的抗體基因的多克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞以及復(fù)合物分子產(chǎn)生細(xì)胞等。作為多克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞，可以列舉例如：導(dǎo)入有抗一種抗原的至少兩種以上不同的單克隆抗體基因的細(xì)胞、導(dǎo)入有抗多種抗原的多種單克隆抗體基因的細(xì)胞、導(dǎo)入有抗原被免疫的來(lái)源于非人動(dòng)物的抗體基因文庫(kù)的細(xì)胞、以及導(dǎo)入有來(lái)源于患者的抗體基因文庫(kù)的細(xì)胞等。復(fù)合物分子生產(chǎn)細(xì)胞只要是導(dǎo)入有編碼在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)的各個(gè)分子形成復(fù)合物分子的蛋白質(zhì)的dna的細(xì)胞，則可以為任意一種細(xì)胞。具體而言，可以列舉例如：共導(dǎo)入有fcγriii(cd16)和共有γ鏈的細(xì)胞、共導(dǎo)入有新生兒fc受體(fcrn)和β2巨球蛋白的細(xì)胞、以及共導(dǎo)入有cd98和lat1的細(xì)胞(國(guó)際公開(kāi)第2007/114496號(hào))等。通過(guò)本發(fā)明的抗體制造方法制造的抗體可以為任意的抗體，可以列舉例如：識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的抗體、識(shí)別與過(guò)敏或炎癥相關(guān)的抗原的抗體、識(shí)別與循環(huán)器官疾病相關(guān)的抗原的抗體、識(shí)別與自身免疫疾病相關(guān)的抗原的抗體、以及識(shí)別與病毒或細(xì)菌感染相關(guān)的抗原的抗體等。作為腫瘤相關(guān)抗原，可以列舉例如：cd1a、cd2、cd3、cd4、cd5、cd6、cd7、cd9、cd10、cd13、cd19、cd20、cd21、cd22、cd25、cd28、cd30、cd32、cd33、cd38、cd40、cd40配體(cd40l)、cd44、cd45、cd46、cd47、cd52、cd54、cd55、cd55、cd59、cd63、cd64、cd66b、cd69、cd70、cd74、cd80、cd89、cd95、cd98、cd105、cd134、cd137、cd138、cd147、cd158、cd160、cd162、cd164、cd200、cd227、腎上腺髓質(zhì)素、血管生成素相關(guān)蛋白4(arp4)、極光激酶、b7-h1、b7-dc、整合素、骨髓基質(zhì)抗原2(bst2)、ca125、ca19.9、碳酸酐酶9(ca9)、鈣粘蛋白、cc-趨化因子受體(ccr)4、ccr7、癌胚抗原(cea)、富含半胱氨酸的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1(cfr-1)、c-met、c-myc、膠原蛋白、cta、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(ctgf)、ctla-4、細(xì)胞角蛋白-18、df3、e-鈣粘蛋白、表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)、egfrviii、egfr2(her2)、egfr3(her3)、egfr4(her4)、細(xì)胞膜糖蛋白、上皮細(xì)胞粘附分子(epcam)、血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白c受體(epcr)、肝配蛋白、肝配蛋白受體(eph)、epha2、endotheliase-2(et2)、fam3d、成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)、fc受體同系物1(fcrh1)、鐵蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8(fgf-8)、fgf8受體、堿性fgf(bfgf)、bfgf受體、fgf受體(fgfr)3、fgfr4、flt1、flt3、葉酸受體、卷曲同源物10(fzd10)、卷曲受體4(fzd-4)、g250、g-csf受體、神經(jīng)節(jié)苷脂(例如，gd2、gd3、gm2和gm3等)、globoh、gp75、gp88、gpr-9-6、乙酰肝素酶i、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)、hgf受體、hla抗原(例如，hla-dr等)、hm1.24、人乳脂肪球蛋白(hmfg)、hrs7、熱休克蛋白90(hsp90)、獨(dú)特型表位、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子(igf)、igf受體(igfr)、白細(xì)胞介素(例如，il-6和il-15等)、白細(xì)胞介素受體(例如，il-6r和il-15r等)、整合素、免疫受體轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)-4(irta-4)、激肽釋放酶1、kdr、kir2dl1、kir2dl2/3、ks1/4、lamp-1、lamp-2、層粘連蛋白-5、路易斯寡糖y、唾液酸化的路易斯寡糖x、淋巴毒素β-受體(ltbr)、lunx、黑色素瘤相關(guān)的硫酸軟骨素蛋白多糖(mcsp)、間皮素、mica、苗勒管抑制物質(zhì)ii型受體(misiir)、粘蛋白、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(ncam)、necl-5、notch1、骨橋蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf)、pdgf受體、血小板因子-4(pf-4)、磷脂酰絲氨酸、前列腺特異性抗原(psa)、前列腺干細(xì)胞抗原(psca)、前列腺特異性膜抗原(psma)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白/肽(pthrp)、nf-κb配體的受體激活劑(rankl)、透明質(zhì)酸受體介導(dǎo)的細(xì)胞游走受體(rhamm)、robo1、sart3、腦信號(hào)蛋白4b(sema4b)、白細(xì)胞蛋白酶抑制因子(slpi)、sm5-1、1-磷酸鞘氨醇、腫瘤相關(guān)糖蛋白-72(tag-72)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(tfr)、tgf-β、thy-1、tie-1、tie2受體、t細(xì)胞免疫球蛋白域粘蛋白域1(tim-1)、人組織因子(htf)、tn抗原、腫瘤壞死因子(tnf)、thomsen-friedenreich抗原(tf抗原)、tnf受體、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(trail)、trail受體(例如，dr4和dr5等)、系統(tǒng)asc氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(asct2)、trkc、trop-2、tweak受體fn14、iv型膠原酶、尿激酶受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、vegf受體(例如，vegfr1、vegfr2和vegfr3等)、波形蛋白和vla-4等，可以列舉抗這些抗原的抗體等。另外，作為識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的抗體，可以列舉例如：抗gd2抗體[anticancerres.,13,331(1993)]、抗gd3抗體[cancerimmunol.immunother.,36,260(1993)]、抗gm2抗體[cancerres.,54,1511(1994)]、抗cd52抗體[proc.natl.acad.sci.usa,89,4285(1992)]、抗mage抗體[britishj.cancer,83,493(2000)]、抗hm1.24抗體[molecularimmunol.,36,387(1999)]、抗甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(pthrp)抗體[cancer,88,2909(2000)]、抗bfgf抗體、抗fgf-8抗體[proc.natl.acad.sci.usa,86,9911(1989)]、抗bfgfr抗體、抗fgfr1抗體(國(guó)際公開(kāi)第2005/037235號(hào))、抗fgf-8r抗體[j.biol.chem.,265,16455(1990)]、抗igf抗體[j.neurosci.res.,40,647(1995)]、抗igf-ir抗體[j.neurosci.res),40,647(1995)]、抗psma抗體[j.urology,160,2396(1998)]、抗vegf抗體[cancerres),57,4593(1997)、avastin(r)]、抗vegfr抗體[oncogene,19,2138(2000)、國(guó)際公開(kāi)第96/30046號(hào)]、抗cd20抗體[curr.opin.oncol.,10,548(1998)、us5,736,137、rituxan(r)、ocrelizumab、ofatumumab]、抗egfr抗體(erbitux(r)、vectivix(r))、抗her2抗體(proc.natl.acad.sci.usa,89,4285(1992)、us5,725,856、herceptin(r)、pertuzumab)、抗her3抗體(us2008/0124345)、c-met抗體(us6,468,529)、抗cd10抗體、抗egfr抗體(國(guó)際公開(kāi)第96/402010號(hào))、抗apo-2r抗體(國(guó)際公開(kāi)第98/51793號(hào))、抗asct2抗體(國(guó)際公開(kāi)第2010/008075號(hào))、抗cea抗體[キャンサー·リサーチ(cancerres.),55(23suppl)：5935s-5945s,(1995)]、抗cd38抗體、抗cd33抗體、抗cd22抗體、抗cd20氨基酸改變抗體(immunology,115,4393,2010.)、抗epcam抗體、抗a33抗體和抗葉酸受體抗體(mrab-003)等。作為識(shí)別與過(guò)敏或炎癥相關(guān)的抗原的抗體，可以列舉例如：抗白介素6抗體[immunol.rev.,127,5(1992)]、抗白介素6受體抗體[molecularimmunol.,31,371(1994)、actemura(r)]、抗白介素5抗體[immunol.rev.,127,5(1992)]、抗白介素5受體抗體、抗白介素4抗體[cytokine,3,562(1991)]、抗白介素4受體抗體[j.immunol.methods,217,41(1998)]、抗腫瘤壞死因子抗體[hybridoma,13,183(1994)、humira(r)]、抗腫瘤壞死因子受體抗體[molecularpharmacol.,58,237(2000)]、抗ccr4抗體[nature,400,776,(1999)]、抗趨化因子抗體(perietal.,j.immunol.meth.,174,249-257,1994)以及抗趨化因子受體抗體[j.exp.med.,186,1373(1997)]等。作為識(shí)別與循環(huán)器官疾病相關(guān)的抗原的抗體，可以列舉例如：抗gpiib/iiia抗體[j.immunol.,152,2968(1994)]、抗血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子抗體[サイエンス(science),253,1129(1991)]、抗血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子受體抗體[j.biol.chem.,272,17400(1997)]、抗血液凝固因子抗體[circulation,101,1158(2000)]、抗ige抗體、抗αvβ3抗體以及α4β7抗體等。作為識(shí)別與病毒或細(xì)菌感染相關(guān)的抗原的抗體，可以列舉例如：抗gp120抗體[structure,8,385(2000)]、抗cd4抗體[j.rheumatology,25,2065(1998)]、抗ccr5抗體、抗志賀毒素抗體[j.clin.microbiol.,37,396(1999)]以及抗m2抗體(日本特開(kāi)2003-235575號(hào)公報(bào))等。通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的單克隆抗體的效應(yīng)活性可以通過(guò)各種方法進(jìn)行調(diào)控。已知例如：對(duì)抗體的fc區(qū)的第297位的天冬酰胺(asn)上結(jié)合的n連接復(fù)合型糖鏈的還原末端上存在的n-乙酰葡糖胺(glcnac)上α-1,6連接的巖藻糖(也稱為核心巖藻糖)的量進(jìn)行調(diào)控的方法(國(guó)際公開(kāi)第05/035586號(hào)、國(guó)際公開(kāi)第02/31140號(hào)、國(guó)際公開(kāi)第00/61739號(hào))；以及通過(guò)改變抗體的fc區(qū)的氨基酸殘基來(lái)進(jìn)行調(diào)控的方法；等。通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的單克隆抗體可以使用任意一種方法調(diào)控效應(yīng)活性?！靶?yīng)活性”是指經(jīng)由抗體的fc區(qū)而引起的抗體依賴性活性，已知抗體依賴性細(xì)胞毒活性(adcc活性)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒活性(cdc活性)或者巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞等吞噬細(xì)胞的抗體依賴性吞噬作用(antibody-dependentphagocytosis，adp活性)等。另外，通過(guò)對(duì)利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的單克隆抗體的fc區(qū)的n連接復(fù)合型糖鏈的核心巖藻糖的含量進(jìn)行調(diào)控，能夠增加或降低抗體的效應(yīng)活性。作為使抗體的fc區(qū)上結(jié)合的n連接復(fù)合型糖鏈上結(jié)合的巖藻糖的含量降低的方法，可以通過(guò)使用α1,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因發(fā)生缺陷的cho細(xì)胞表達(dá)抗體而獲得未結(jié)合巖藻糖的抗體。未結(jié)合巖藻糖的抗體具有高adcc活性。另一方面，作為使抗體的fc上結(jié)合的n連接復(fù)合型糖鏈上結(jié)合的巖藻糖的含量增加的方法，可以通過(guò)使用導(dǎo)入有α1,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因的宿主細(xì)胞表達(dá)抗體而獲得結(jié)合有巖藻糖的抗體。結(jié)合有巖藻糖的抗體具有比未結(jié)合巖藻糖的抗體更低的adcc活性。另外，可以通過(guò)改變抗體的fc區(qū)的氨基酸殘基來(lái)增加或降低adcc活性或cdc活性。例如，可以通過(guò)使用美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第2007/0148165號(hào)說(shuō)明書(shū)中記載的抗體的fc區(qū)的氨基酸序列來(lái)增加抗體的cdc活性。另外，也可以通過(guò)進(jìn)行美國(guó)專利第6737056號(hào)說(shuō)明書(shū)、美國(guó)專利第7297775號(hào)說(shuō)明書(shū)或美國(guó)專利第7317091號(hào)說(shuō)明書(shū)中記載的氨基酸改變來(lái)增加或降低adcc活性或cdc活性。本發(fā)明中使用的“懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞”是指不粘附于微珠或組織培養(yǎng)用培養(yǎng)器(也稱為組織培養(yǎng)容器或粘附培養(yǎng)容器等)等培養(yǎng)細(xì)胞容易粘附且施加有涂層的細(xì)胞培養(yǎng)支持體上而能夠懸浮于培養(yǎng)液中存活和增殖的細(xì)胞。只要細(xì)胞不粘附于細(xì)胞培養(yǎng)支持體上，則可以是在培養(yǎng)液中以一個(gè)細(xì)胞的狀態(tài)存活、增殖或者以多個(gè)細(xì)胞相互聚集而成的細(xì)胞團(tuán)的狀態(tài)存活、增殖中的任意一種狀態(tài)。另外，作為本發(fā)明中使用的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選能夠在不含胎牛血清(fetalcalfserum，以下記作fcs)等的無(wú)血清培養(yǎng)基中不粘附于細(xì)胞培養(yǎng)支持體上而懸浮于培養(yǎng)液中存活和增殖的細(xì)胞，更優(yōu)選能夠在不含蛋白質(zhì)的無(wú)蛋白培養(yǎng)基中以懸浮狀態(tài)存活和增殖的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。作為組織培養(yǎng)用培養(yǎng)器，只要是粘附培養(yǎng)用的施加有涂層的燒瓶、培養(yǎng)皿等則可以是任何一種培養(yǎng)器。具體而言，通過(guò)使用市售的組織培養(yǎng)燒瓶(グライナー公司制造)和粘附培養(yǎng)燒瓶(住友ベークライト公司制造)等，可以確認(rèn)為懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。作為本發(fā)明中使用的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以是原來(lái)就具有懸浮性的性質(zhì)的在懸浮培養(yǎng)中馴化而得到的細(xì)胞，也可以是使粘附性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在懸浮性培養(yǎng)條件下馴化而得到的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。作為原來(lái)就具有懸浮性的性質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以列舉例如：per.c6細(xì)胞、大鼠骨髓瘤細(xì)胞yb2/3hl.p2.g11.16ag.20(或者也稱為yb2/0)和cho-s細(xì)胞(invitrogen公司制造)等。上述“將粘附性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在懸浮性培養(yǎng)條件下馴化而得到的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞”可以通過(guò)mol.biotechnol.2000,15(3),249-57中記載的方法或以下所示的方法等進(jìn)行制作，可以通過(guò)建立與懸浮培養(yǎng)馴化前同樣或者比懸浮培養(yǎng)馴化前更優(yōu)良的增殖和存活的細(xì)胞來(lái)制作(j.biotechnol.2007,130(3),282-90)?！芭c懸浮培養(yǎng)馴化前同等”是指懸浮培養(yǎng)中馴化得到的細(xì)胞的存活率和增殖速度(倍增時(shí)間)等與懸浮培養(yǎng)馴化前的細(xì)胞相比實(shí)質(zhì)上相同。本發(fā)明中，作為使粘附性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在懸浮性培養(yǎng)條件下馴化的方法，可以列舉如下方法。將含有血清的培養(yǎng)基的血清含量減至1/10，以比較高的細(xì)胞濃度重復(fù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠存活和增殖的時(shí)刻進(jìn)一步減少血清含量并重復(fù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。根據(jù)該方法，可以制作能夠在無(wú)血清條件下存活、增殖的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。另外，也可以通過(guò)向培養(yǎng)液中添加適當(dāng)?shù)姆请x子性表面活性劑pluronic-f68等并進(jìn)行培養(yǎng)的方法來(lái)制作懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。作為通過(guò)在懸浮性培養(yǎng)條件下馴化而成為懸浮性的粘附性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以列舉例如：小鼠骨髓瘤細(xì)胞ns0和cho細(xì)胞等。本發(fā)明中，作為懸浮性cho細(xì)胞所具有的性質(zhì)，在將該細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/ml進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的情況下，3～4天后培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞密度優(yōu)選為5×105個(gè)細(xì)胞/ml以上，更優(yōu)選為8×105個(gè)細(xì)胞/ml以上，特別優(yōu)選為1×106個(gè)細(xì)胞/ml以上，最優(yōu)選為1.5×106個(gè)細(xì)胞/ml以上。另外，作為本發(fā)明的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的倍增時(shí)間，優(yōu)選為48小時(shí)以下，更優(yōu)選為24小時(shí)以下，特別優(yōu)選為18小時(shí)以下，最優(yōu)選為11小時(shí)以下。懸浮培養(yǎng)基可以使用例如cd-cho培養(yǎng)基(invitrogen公司)、ex-cell325-pf培養(yǎng)基(safcbiosciences公司)以及sfm4cho培養(yǎng)基(hyclone公司)等市售的培養(yǎng)基。另外，也可以通過(guò)配合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)所需的糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)等并進(jìn)行制備而得到。懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)可以使用能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)容器，通過(guò)能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)條件來(lái)進(jìn)行。作為培養(yǎng)容器，可以使用例如：細(xì)胞培養(yǎng)用的96孔板(康寧公司)、t-燒瓶(bd公司)和三角燒瓶(康寧公司)等。作為培養(yǎng)條件，例如可以在5％co2氣氛中、37℃的培養(yǎng)溫度下通過(guò)靜置培養(yǎng)等來(lái)進(jìn)行。也可以使用作為懸浮培養(yǎng)專用培養(yǎng)設(shè)備的wave生物反應(yīng)器(ge醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部)等振蕩培養(yǎng)裝置等。關(guān)于使用wave生物反應(yīng)裝置的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)條件，可以通過(guò)ge醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部主頁(yè)http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/cellcult/wave_03_16.pdf中記載的方法進(jìn)行。除了振蕩培養(yǎng)以外，也可以利用生物反應(yīng)器等旋轉(zhuǎn)攪拌裝置進(jìn)行培養(yǎng)。利用生物反應(yīng)器的培養(yǎng)可以通過(guò)cytotechnology(2006)52:199-207中記載的方法等進(jìn)行。本發(fā)明中，在使用懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞以外的細(xì)胞株的情況下，也可以應(yīng)用通過(guò)如上所述的方法在懸浮培養(yǎng)中馴化得到的且能夠使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法的細(xì)胞株中的任意一種細(xì)胞株。由懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化可以通過(guò)從含有蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液或細(xì)胞破碎液中將目標(biāo)蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)以外的雜質(zhì)分離來(lái)進(jìn)行。作為分離的方法，可以列舉例如：離心、透析、硫酸銨沉淀、柱層析或過(guò)濾器等，可以利用目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)的差異或在單一柱上的結(jié)合力的差異來(lái)進(jìn)行。純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法可以通過(guò)例如蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)記錄(上)提取、分離和重組蛋白的表達(dá)(羊土社，岡田雅人、宮崎香編著，isbn9784897069180)中記載的方法來(lái)進(jìn)行。本說(shuō)明書(shū)中引用的科學(xué)文獻(xiàn)、專利、專利申請(qǐng)等參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容按照與各自具體記載的內(nèi)容相同的程度作為參考援引到本說(shuō)明書(shū)中。以上，為便于理解，示出了優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明。以下，基于實(shí)施例對(duì)本發(fā)明更具體地進(jìn)行說(shuō)明，但上述說(shuō)明和下述實(shí)施例只是為了例示的目的而提供，并不是為了限定本發(fā)明的目的而提供。因此，本發(fā)明的范圍不受本說(shuō)明書(shū)中具體記載的實(shí)施方式和實(shí)施例的限定而僅由權(quán)利要求書(shū)進(jìn)行限定。關(guān)于以下記載的克隆等與基因重組相關(guān)的各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，依據(jù)j.sambrook,e.f.frisch,t.maniatis著、分子克隆第二版(molecularcloning2ndedition)和frederickm.ausubel等編著、currentprotocols發(fā)行、currentprotocolsinmolecularbiology(最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作指南)等中記載的基因工程方法進(jìn)行。實(shí)施例[實(shí)施例1]抗人流感m2抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作蛋白質(zhì)表達(dá)用質(zhì)粒載體使用包含含有插入在一對(duì)tol2轉(zhuǎn)座子序列之間的任意的人抗體基因和藥劑選擇標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用基因表達(dá)盒的質(zhì)粒。所使用的基因的dna通過(guò)基于已知的堿基序列進(jìn)行人工化學(xué)合成或者制作其兩端序列的引物并以適當(dāng)?shù)膁na源為模板進(jìn)行pcr來(lái)獲得。為了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。轉(zhuǎn)座子序列使用由日本特開(kāi)2003-235575號(hào)公報(bào)公開(kāi)的非自主性tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列(序列號(hào)1)中第1位至第200位的堿基序列(tol2-l序列)(序列號(hào)2)和第2285位至第2788位的堿基序列(tol2-r序列)(序列號(hào)3)的堿基序列。通過(guò)如下方法分別制作包含一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的合成dna片段(寶生物株式會(huì)社制造)。制作包含在tol2-r序列的5’末端和3’末端這兩個(gè)末端都連接有限制性內(nèi)切酶nrui的識(shí)別序列的堿基序列的dna片段。另外，制作包含在tol2-l序列的5’末端連接有限制性內(nèi)切酶fsei的識(shí)別序列且在3’末端連接有限制性內(nèi)切酶asci的識(shí)別序列的堿基序列的dna片段。接著，將制作的包含tol2-r序列和tol2-l序列的dna片段插入包含編碼抗人流感m2抗體z3g1的氨基酸序列的堿基序列的表達(dá)載體n5lg1_m2_z3載體(國(guó)際公開(kāi)第06/061723號(hào))中?？贵w基因表達(dá)盒使用在cmv增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控下插入編碼抗人流感m2抗體z3g1(atccdepositno.pta-5968；depositedmarch13,2004,americantypeculturecollection,manassas,va,usa)的h鏈(序列號(hào)10)的堿基序列(序列號(hào)9)以及編碼l鏈(序列號(hào)12)的堿基序列(序列號(hào)11)而得到的n5lg1_m2_z3載體(國(guó)際公開(kāi)第06/061723號(hào))。在m5lg1_m2_z3載體的、包含抗體基因表達(dá)盒和選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒的基因片段的5’末端側(cè)存在的限制性內(nèi)切酶nrui位點(diǎn)上插入包含tol2-r序列的dna片段。另外，在3’末端側(cè)存在的限制性內(nèi)切酶fsei和asci位點(diǎn)上插入包含tol2-l序列的dna片段。另外，在cmv增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控下將連接有編碼抗放線菌酮基因(人核糖體蛋白質(zhì)l36a的54位的脯氨酸突變?yōu)楣劝滨０返幕?的堿基序列(序列號(hào)5)的抗放線菌酮基因表達(dá)盒插入到連接有tol2轉(zhuǎn)座子序列的n5lg1_m2_z3載體的fsei識(shí)別位點(diǎn)，構(gòu)建抗人流感m2抗體轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體(圖1)。另一方面，將不含轉(zhuǎn)座子序列的載體命名為抗人流感m2抗體表達(dá)載體，作為對(duì)照載體使用(圖2)。[實(shí)施例2]轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體的制作轉(zhuǎn)座酶使用與目標(biāo)抗體的表達(dá)載體獨(dú)立的表達(dá)載體來(lái)表達(dá)。即，將編碼來(lái)源于青鳉的tol2轉(zhuǎn)座酶的基因(序列號(hào)4)插入到pcaggs載體(gene108,193-200,1991)的caggs啟動(dòng)子的下游，制作tol2轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體(以下，簡(jiǎn)記為tol2載體)(圖3)。[實(shí)施例3]使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體的制作(1)懸浮化cho細(xì)胞的制作將在添加有10％血清(fcs)的α-mem培養(yǎng)基(invitrogen公司)中培養(yǎng)的粘附性cho細(xì)胞通過(guò)胰蛋白酶處理進(jìn)行剝離、回收，使用新的添加有10％fcs的α-mem培養(yǎng)基，在37℃、5％co2孵育箱內(nèi)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。幾天后，確認(rèn)這些細(xì)胞進(jìn)行增殖后，以2×105個(gè)/ml的濃度接種到添加有5％fcs的α-mem培養(yǎng)基中并進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。再過(guò)幾天后，使用添加有5％fcs的α-mem培養(yǎng)基進(jìn)行同樣的接種操作。最后使用不含血清的α-mem培養(yǎng)基重復(fù)進(jìn)行傳代、振蕩培養(yǎng)，確認(rèn)與血清存在下的培養(yǎng)具有同樣的增殖能力，制作懸浮培養(yǎng)馴化株。(2)生產(chǎn)抗體的cho細(xì)胞的制作作為表達(dá)載體，使用實(shí)施例1和實(shí)施例2的抗人流感m2抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(以下，簡(jiǎn)記為轉(zhuǎn)座子載體)和tol2載體pcaggs-t2tp[圖3、kawakamik&nodat.genetics.166,895-899(2004)]。另外，作為對(duì)照，使用不具有轉(zhuǎn)座子序列的抗人流感m2抗體表達(dá)載體。將上述表達(dá)載體導(dǎo)入到在懸浮培養(yǎng)中馴化而得到的cho-k1細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection)，目錄號(hào)ccl-61)或hek293細(xì)胞(invitrogen公司，freestyle293f細(xì)胞)中，并對(duì)得到抗放線菌酮克隆的頻率進(jìn)行比較。使各4×106個(gè)的細(xì)胞懸濁于400μl的pbs中，將抗人流感m2抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(10μg)與tol2載體(25μg)通過(guò)電穿孔法以環(huán)狀dna的狀態(tài)進(jìn)行共導(dǎo)入。需要說(shuō)明的是，tol2載體使tol2轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性地表達(dá)，因此，為了防止重組到宿主染色體中而以環(huán)狀dna的狀態(tài)導(dǎo)入。另外，作為對(duì)照，根據(jù)利用標(biāo)準(zhǔn)的電穿孔的基因?qū)敕?，將抗人流感m2抗體表達(dá)載體(10μg)利用限制性內(nèi)切酶形成為直鏈狀后，導(dǎo)入各細(xì)胞中。電穿孔使用電穿孔儀(genepulserxceiisystem(bio-rad公司制造))，在電壓300v、靜電容量500μf、室溫的條件下使用間隙寬度為4mm的小池(bio-rad公司制造)進(jìn)行。通過(guò)電穿孔導(dǎo)入基因后，將各細(xì)胞接種到3塊96孔板上，并將cho細(xì)胞使用safcbiosciences公司的ex-cell325-pf培養(yǎng)基在co2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)3天，將hek293細(xì)胞使用freestyle-293培養(yǎng)基(invitrogen公司)在co2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)3天。接著，從基因?qū)?天后的培養(yǎng)基更換開(kāi)始，加入3μg/ml的放線菌酮，在放線菌酮存在下進(jìn)行培養(yǎng)，每周進(jìn)行培養(yǎng)基更換，并培養(yǎng)3周。培養(yǎng)3周后，計(jì)數(shù)觀察到抗放線菌酮菌落的孔數(shù)。將該結(jié)果示于表1和表2。表1抗放線菌酮細(xì)胞數(shù)的比較(cho細(xì)胞)表2抗放線菌酮細(xì)胞數(shù)的比較(nek293細(xì)胞)如表1所示，在懸浮性cho-k1細(xì)胞中導(dǎo)入有抗人流感m2抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體或抗人流感m2抗體表達(dá)載體后，與其他細(xì)胞株同樣地不會(huì)由導(dǎo)入有抗人流感m2抗體表達(dá)載體的細(xì)胞獲得放線菌酮抗性的轉(zhuǎn)化株，但由抗人流感m2抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體導(dǎo)入細(xì)胞以高頻率得到放線菌酮抗性的轉(zhuǎn)化株。另一方面，如表2所示，即使在hek293細(xì)胞中導(dǎo)入抗人流感m2抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體或抗人流感m2抗體表達(dá)載體中的任意一種表達(dá)載體，也不會(huì)獲得放線菌酮抗性的轉(zhuǎn)化株。由這些結(jié)果可知，懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因和抗放線菌酮基因高效地導(dǎo)入到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)。(3)懸浮性cho細(xì)胞和粘附性cho細(xì)胞中的抗體生產(chǎn)的研究為了研究懸浮性cho細(xì)胞或者粘附性cho細(xì)胞中的抗體生產(chǎn)效率，對(duì)各細(xì)胞株中的抗體的產(chǎn)生量進(jìn)行研究。作為懸浮性cho細(xì)胞，使用在懸浮培養(yǎng)中馴化后的懸浮性cho-k1細(xì)胞。另外，作為粘附性cho細(xì)胞，使用懸浮培養(yǎng)馴化前的粘附性cho-k1細(xì)胞。分別以抗人流感m2抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(10μg)和tol2載體(25μg)對(duì)懸浮性cho-k1細(xì)胞和粘附性cho-k1細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。然后，將懸浮性cho-k1細(xì)胞和粘附性cho-k1細(xì)胞分別接種到3塊96孔板上。對(duì)于懸浮性cho-k1細(xì)胞，使用懸浮細(xì)胞用培養(yǎng)基(safcbiosciences公司的ex-cell325-pf)，對(duì)于粘附性cho-k1細(xì)胞，使用添加有10％血清的α-mem培養(yǎng)基(invitrogen公司)。將各細(xì)胞在co2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)3天，從電穿孔4天后的培養(yǎng)基更換開(kāi)始，在3μg/ml的放線菌酮存在下培養(yǎng)3周。此時(shí)，每周進(jìn)行培養(yǎng)基更換。對(duì)于懸浮性cho-k1細(xì)胞，將1×106個(gè)的細(xì)胞接種到6孔板上，在co2孵育箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)3天，使用培養(yǎng)上清，通過(guò)hplc測(cè)定抗人流感m2抗體的蛋白質(zhì)量。對(duì)于粘附性cho-k1細(xì)胞，在6孔板中達(dá)到匯合成片后(2×106個(gè))進(jìn)行培養(yǎng)基更換，靜置培養(yǎng)3天后，使用培養(yǎng)上清，通過(guò)hplc測(cè)定抗體蛋白質(zhì)量。培養(yǎng)上清中的抗體濃度的測(cè)定通過(guò)femsyeastres.,7,(2007),1307-1316中記載的方法進(jìn)行。將結(jié)果示于圖4。如圖4a所示，對(duì)于在懸浮培養(yǎng)中馴化后的cho-k1細(xì)胞而言，多數(shù)得到顯示出極高的抗體表達(dá)量的細(xì)胞。另一方面，如圖4b所示，對(duì)于粘附性的cho-k1細(xì)胞而言，僅得到顯示出hplc的檢測(cè)限(5μg/ml)以下的表達(dá)量的細(xì)胞。由這些結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于使用轉(zhuǎn)座子載體來(lái)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)，因此，能夠在使用懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的情況下高表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。另外，由實(shí)施例1～3的結(jié)果可知，本發(fā)明的方法可以作為使用在懸浮培養(yǎng)中馴化后的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)高效地制作高表達(dá)外源基因的生產(chǎn)細(xì)胞、生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的新方法利用。[實(shí)施例4]利用tol1轉(zhuǎn)座子的抗體表達(dá)細(xì)胞的制作以及抗體制造(1)抗人流感m2抗體表達(dá)tol1轉(zhuǎn)座子載體的制作與實(shí)施例1同樣，蛋白質(zhì)表達(dá)用質(zhì)粒載體使用包含含有插入在一對(duì)tol1轉(zhuǎn)座子序列之間的任意的人抗體基因和藥劑選擇標(biāo)記基因的、哺乳動(dòng)物細(xì)胞用基因表達(dá)盒的質(zhì)粒。所使用的基因的dna通過(guò)基于已知的序列信息進(jìn)行人工化學(xué)合成或者制作其兩端序列的引物并以適當(dāng)?shù)膁na源為模板進(jìn)行pcr來(lái)獲得。為了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。轉(zhuǎn)座子序列使用由序列表的序列號(hào)13表示的非自主性tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列(國(guó)際公開(kāi)第2008/072540號(hào))中第1位至第200位的堿基序列(tol1-l序列)(序列號(hào)14)和第1351位至第1855位的堿基序列(tol1-r序列)(序列號(hào)15)。通過(guò)如下方法分別制作包含一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列的合成dna片段。制作包含在tol1-r序列的5’末端和3’末端這兩個(gè)末端都連接有限制性內(nèi)切酶nrui的識(shí)別序列的堿基序列的dna片段。另外，制作包含在tol1-l序列的5’末端連接有限制性內(nèi)切酶fsei的識(shí)別序列且在3’末端連接有限制性內(nèi)切酶asci的識(shí)別序列的堿基序列的dna片段。接著，將制作的包含tol1-r序列和tol1-l序列的dna片段插入到n5lg1_m2_z3載體中。在n5lg1_m2_z3載體的、包含抗體基因表達(dá)盒和選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒的基因片段的5’末端側(cè)存在的限制性內(nèi)切酶nrui位點(diǎn)上插入包含tol1-r序列的dna片段，在3’末端側(cè)存在的限制性內(nèi)切酶fsei和asci位點(diǎn)上插入包含tol1-l序列的dna片段。另外，在cmv增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控下，將連接有抗放線菌酮基因(人核糖體蛋白質(zhì)l36a的54位的脯氨酸突變?yōu)楣劝滨０返幕?(序列號(hào)7)的抗放線菌酮基因表達(dá)盒插入到連接有tol1轉(zhuǎn)座子序列的n5lg1_m2_z3載體的fsei識(shí)別位點(diǎn)，構(gòu)建抗人流感m2抗體tol1轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體(圖5)。(2)tol1轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體的制作轉(zhuǎn)座酶使用與目標(biāo)抗體的表達(dá)載體獨(dú)立的表達(dá)載體來(lái)表達(dá)。即，在cmv增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控下，將連接有由序列號(hào)16表示的堿基序列構(gòu)成的編碼來(lái)源于青鳉的tol1轉(zhuǎn)座酶(序列號(hào)17)的dna片段的tol1轉(zhuǎn)座酶基因表達(dá)盒插入到pbluescriptiisk(+)(stratagene公司制造)中，作為tol1轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體ptol1ase利用(圖6)。(3)生產(chǎn)抗體的cho細(xì)胞的制作使用上述(1)～(3)中制作的表達(dá)載體，通過(guò)與實(shí)施例3同樣的方法對(duì)利用tol1轉(zhuǎn)座子的表達(dá)載體的導(dǎo)入效果進(jìn)行研究。將該結(jié)果示于表3。表3如表3所示，在懸浮性cho-k1細(xì)胞中導(dǎo)入抗人流感m2抗體表達(dá)tol1轉(zhuǎn)座子載體時(shí)，與導(dǎo)入有抗人流感m2抗體表達(dá)tol2轉(zhuǎn)座子載體的實(shí)施例3同樣地，以高頻率得到放線菌酮抗性的轉(zhuǎn)化株。由該結(jié)果可知，在懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，即使使用來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列即轉(zhuǎn)座子序列，也會(huì)將插入在兩個(gè)轉(zhuǎn)座子序列之間的抗體基因和抗放線菌酮基因高效地導(dǎo)入宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)。(4)懸浮性cho細(xì)胞中的抗體生產(chǎn)的研究使用tol1轉(zhuǎn)座子，與實(shí)施例3的(3)同樣地對(duì)懸浮性cho細(xì)胞中的抗體生產(chǎn)效率進(jìn)行研究。培養(yǎng)上清中的抗體濃度的測(cè)定通過(guò)femsyeastres.,7,(2007),1307-1316中記載的方法進(jìn)行。將結(jié)果示于圖7。如圖7所示，在使用來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列即轉(zhuǎn)座子序列的情況下，與tol2同樣地，多數(shù)也得到顯示出極高的抗體表達(dá)量的細(xì)胞。由該結(jié)果可知，在使用來(lái)源于tol1轉(zhuǎn)座子的堿基序列作為轉(zhuǎn)座子序列的情況下，與使用來(lái)源于tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列時(shí)同樣地得到高表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞。[實(shí)施例5]抗人cd98抗體的制作(1)抗人cd98抗體重鏈表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體和抗人cd98抗體輕鏈表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作為了制作具有由序列號(hào)20和23的氨基酸序列表示的可變區(qū)h鏈和l鏈的抗人cd98抗體，在各抗體可變區(qū)連接人igg1抗體恒定區(qū)的氨基酸序列，制作h鏈和l鏈的氨基酸序列。連接有信號(hào)序列的抗人cd98抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的基因序列(序列號(hào)18、21)使用日本專利第4324637號(hào)公報(bào)中公開(kāi)的重組到(n5kg1-valc2igg1ns/i117l載體)中的序列，轉(zhuǎn)座子序列、啟動(dòng)子等使用與實(shí)施例1同樣的轉(zhuǎn)座子序列、啟動(dòng)子，分別構(gòu)建抗人cd98抗體重鏈表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(簡(jiǎn)記為cd98h載體)和抗人cd98抗體輕鏈表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(簡(jiǎn)記為cd98l載體)(圖8、9)。所使用的dna片段通過(guò)基于已知的序列進(jìn)行人工化學(xué)合成或者制作其兩端序列的引物并以適當(dāng)?shù)膁na源為模板進(jìn)行pcr來(lái)獲得。為了之后的重組操作，在引物的端部附加限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。(2)抗放線菌酮基因表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作在實(shí)施例1中記載的cmv增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控下連接編碼抗放線菌酮基因的序列(序列號(hào)7)，在該抗放線菌酮基因表達(dá)盒的兩端插入一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列(tol-2l、tol2-r)，構(gòu)建抗放線菌酮基因表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(以下，簡(jiǎn)記為chx載體)(圖10)。所使用的dna片段通過(guò)基于已知的序列進(jìn)行人工化學(xué)合成或者制作其兩端序列的引物并以適當(dāng)?shù)膁na源為模板進(jìn)行pcr來(lái)獲得。為了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。(3)生產(chǎn)抗人cd98抗體的cho細(xì)胞的制作將上述(1)和(2)中制作的cd98h載體(圖8)、cd98l載體(圖9)、chx載體(圖10)以及實(shí)施例2中制作的tol2載體(圖3)導(dǎo)入在懸浮培養(yǎng)中馴化后的cho-k1細(xì)胞中，并對(duì)高表達(dá)抗體的細(xì)胞的出現(xiàn)數(shù)進(jìn)行比較。在實(shí)驗(yàn)區(qū)，使4×106個(gè)cho-k1細(xì)胞懸濁于400μl的pbs中，將cd98h載體(10μg)、cd98l載體(10μg)、chx載體(10μg)和tol2載體(10μg)通過(guò)電穿孔法以環(huán)狀dna的狀態(tài)進(jìn)行共導(dǎo)入。tol2載體使tol2轉(zhuǎn)座酶暫時(shí)性地表達(dá)，因此，為了防止重組到宿主染色體中而以環(huán)狀dna的狀態(tài)導(dǎo)入。電穿孔使用電穿孔儀(genepulserxceiisystem(bio-rad公司制造))，在電壓300v、靜電容量500μf、室溫的條件下使用間隙寬度為4mm的小池(bio-rad公司制造)進(jìn)行。另外，在對(duì)照區(qū)，將cd98h載體(10μg)、cd98l載體(10μg)和chx載體(10μg)分別利用限制性內(nèi)切酶pcii(寶生物公司)形成為直鏈狀后，與上述同樣地進(jìn)行電穿孔。通過(guò)電穿孔導(dǎo)入基因后，將各小池的細(xì)胞懸濁于添加有0.5％大豆水解物的cdopticho培養(yǎng)基(invitrogen公司)(以下記作0.5cd培養(yǎng)基)中，接種到1塊96孔板上，在co2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)4天。接著，從基因?qū)牒?天后的培養(yǎng)基更換開(kāi)始，使用添加有3μg/ml的放線菌酮(sigma-aldrich公司，c4859)的0.5cd培養(yǎng)基，在放線菌酮存在下進(jìn)行培養(yǎng)，每周進(jìn)行培養(yǎng)基更換，并培養(yǎng)4周。培養(yǎng)4周后，通過(guò)利用fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的夾心法(lencetm、パーキンエルマー公司)對(duì)抗體的表達(dá)進(jìn)行定量。關(guān)于抗體高表達(dá)細(xì)胞，將培養(yǎng)上清中的抗體濃度為5.0μg/ml以上的表達(dá)的克隆作為抗體表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量，將其結(jié)果示于表4。表4如表4所示，將tol2載體與抗人cd98抗體重鏈表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體、抗人cd98抗體輕鏈表達(dá)載體和抗放線菌酮基因載體一起共導(dǎo)入到懸浮性cho-k1細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)區(qū)中，觀察到大量抗人cd98抗體表達(dá)細(xì)胞，但在沒(méi)有共導(dǎo)入tol2載體的對(duì)照區(qū)中，盡管使載體形成線狀，也沒(méi)有觀察到抗人cd98抗體表達(dá)細(xì)胞。[實(shí)施例6]抗人cd98抗體的制造(1)包含抗人cd98抗體重鏈基因片段、抗人cd98抗體輕鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作在實(shí)施例5(1)中制作的抗人cd98抗體重鏈表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體中分別連接該實(shí)施例5(1)中制作的抗人cd98抗體輕鏈表達(dá)基因盒和實(shí)施例5(2)中制作的抗放線菌酮基因盒，與上述同樣地使用合成dna、pcr法，構(gòu)建包含抗人cd98抗體重鏈基因片段、抗人cd98抗體輕鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(以下，簡(jiǎn)記為cd98-chx串聯(lián)載體)。(2)包含抗人cd98抗體重鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作在實(shí)施例5(1)中制作的抗人cd98抗體重鏈表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體中分別連接實(shí)施例5(2)中所示的抗放線菌酮基因盒，與上述同樣地使用合成dna、pcr法，構(gòu)建包含抗人cd98抗體重鏈和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(簡(jiǎn)記為cd98h-chx表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體)。(3)生產(chǎn)抗人cd98抗體的cho細(xì)胞的制作使用上述實(shí)施例5(1)和(2)以及上述實(shí)施例6(1)和(2)中制作的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體，對(duì)將抗人cd98抗體的h鏈和l鏈利用同一表達(dá)載體進(jìn)行基因?qū)氲那闆r(對(duì)照區(qū))、將抗人cd98抗體的h鏈、l鏈或抗放線菌酮基因分別利用不同的表達(dá)載體進(jìn)行基因?qū)氲那闆r(實(shí)驗(yàn)區(qū)1)、以及將h鏈或l鏈利用不同的表達(dá)載體進(jìn)行基因?qū)氲那闆r(實(shí)驗(yàn)區(qū)2)下的、高表達(dá)抗cd98抗體的細(xì)胞的出現(xiàn)數(shù)進(jìn)行比較。在實(shí)驗(yàn)區(qū)1，使4×106個(gè)cho-k1細(xì)胞懸濁于400μl的pbs中，將cd98h載體(10μg)、cd98l載體(10μg)、chx載體(10μg)和tol2載體(10μg)通過(guò)電穿孔法以環(huán)狀dna的狀態(tài)進(jìn)行共導(dǎo)入。在實(shí)驗(yàn)區(qū)2，使4×106個(gè)cho-k1細(xì)胞懸濁于400μl的pbs中，將cd98h-chx載體(10μg)、cd98l載體(10μg)和tol2載體(10μg)通過(guò)電穿孔法以環(huán)狀dna的狀態(tài)進(jìn)行共導(dǎo)入。在對(duì)照區(qū)，使4×106個(gè)cho-k1細(xì)胞懸濁于400μl的pbs中，將cd98-chx串聯(lián)載體(10μg)、tol2載體(20μg)通過(guò)電穿孔法以環(huán)狀dna的狀態(tài)進(jìn)行共導(dǎo)入。另外，在全部實(shí)驗(yàn)中，為了暫時(shí)性地表達(dá)tol2轉(zhuǎn)座酶，并且為了防止重組到宿主染色體中，將tol2載體以環(huán)狀dna的狀態(tài)導(dǎo)入。以下的方法中，通過(guò)與實(shí)施例5(3)同樣的方法，進(jìn)行抗體生產(chǎn)細(xì)胞的出現(xiàn)率的確認(rèn)。對(duì)于抗體表達(dá)細(xì)胞，將培養(yǎng)上清中的抗體濃度為3.0μg/ml以上的克隆作為抗體表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。將其結(jié)果示于表5。表5在導(dǎo)入有cd98h載體、cd98l載體和chx載體的實(shí)驗(yàn)區(qū)1、以及導(dǎo)入有cd98h載體和cd98l載體的實(shí)驗(yàn)區(qū)2，高表達(dá)抗人cd98抗體的細(xì)胞的出現(xiàn)率大幅增加。以上的結(jié)果表明，與將抗體重鏈基因與抗體輕鏈基因重組到同一表達(dá)載體中而得到的表達(dá)載體導(dǎo)入懸浮性cho細(xì)胞中時(shí)相比，在將抗體重鏈基因和抗體輕鏈基因分別插入在不同的轉(zhuǎn)座子序列之間的表達(dá)載體共導(dǎo)入到懸浮性cho細(xì)胞中的情況下，能夠更容易地獲得以及制造抗體高生產(chǎn)株。另外，由實(shí)驗(yàn)區(qū)1和實(shí)驗(yàn)區(qū)2的結(jié)果可知，即使在導(dǎo)入的載體為多個(gè)的情況下，抗藥性基因(選擇標(biāo)記基因)為至少一個(gè)即足夠。另外可知，抗藥性基因可以位于重組有抗體重鏈基因的表達(dá)載體上，也可以位于分別獨(dú)立的載體上。以上的結(jié)果表明，作為以往困難的向懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將配置在兩個(gè)以上載體上的基因同時(shí)高效地導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，轉(zhuǎn)座子載體是有效的。另外表明，為了高生產(chǎn)由多個(gè)多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)和多個(gè)蛋白質(zhì)，有效的是將各多肽或蛋白質(zhì)利用不同的轉(zhuǎn)座子載體導(dǎo)入細(xì)胞中。(4)生產(chǎn)抗人cd98抗體的cho細(xì)胞的培養(yǎng)分別由上述實(shí)施例6(3)中得到的導(dǎo)入有cd98-chx串聯(lián)載體的細(xì)胞以及導(dǎo)入有cd98h-chx載體和cd98l載體的細(xì)胞，對(duì)抗體表達(dá)量高的前3株比較抗體表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)如下所示。將實(shí)施例6(3)中得到的利用放線菌酮抗性選擇且表達(dá)抗人cd98抗體的cho-k1細(xì)胞依次在96孔板、24孔板、6孔板(康寧公司)中放大培養(yǎng)。在放大培養(yǎng)后，測(cè)定培養(yǎng)上清中的抗體濃度，選擇出高表達(dá)抗人cd98抗體的cho細(xì)胞的前3株。接著，將選擇出的3株以分別達(dá)到2×105個(gè)/ml的方式懸濁于0.5％cd培養(yǎng)基(invitrogen公司)0.5cd培養(yǎng)基3ml中，使用6孔板，在37℃、5％co2的氣氛中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5天。通過(guò)hplc(waters公司)對(duì)培養(yǎng)5天后的培養(yǎng)基中的抗體量進(jìn)行定量。將其結(jié)果示于表6。表6如表6所示可知，共導(dǎo)入有cd98h載體和cd98l載體的cho-k1細(xì)胞與導(dǎo)入有cd98-chx串聯(lián)載體的cho-k1細(xì)胞相比，抗體生產(chǎn)量更高。以上的結(jié)果表明，通過(guò)將抗體重鏈基因與抗體輕鏈基因分別插入在不同的一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的表達(dá)載體共導(dǎo)入到懸浮性cho細(xì)胞中，不僅能夠容易地獲得以及制造抗體高生產(chǎn)株，而且所得到的細(xì)胞具有高抗體生產(chǎn)率。[實(shí)施例7]抗人腫瘤壞死因子-α(tnfα)抗體的制造(1)包含抗人tnfα抗體重鏈基因片段、抗人tnfα抗體輕鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作為了制作具有序列號(hào)26和29的氨基酸序列的抗人tnfα抗體，將實(shí)施例6(1)中制作的包含抗人cd98抗體重鏈基因片段、輕鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(cd98-chx串聯(lián)載體)的vh和vl基因片段分別取代成來(lái)源于抗人tnfα抗體的vh和vl，構(gòu)建抗人tnfα抗體重鏈基因片段、抗人tnfα抗體輕鏈基因片段和抗放線菌酮基因表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(以下，簡(jiǎn)記為tnfα-chx串聯(lián)載體)。關(guān)于抗人tnfα抗體重鏈基因和輕鏈基因的序列，制作在ヒュミラ(r)皮下注40mg審查報(bào)告書(shū)(獨(dú)立行政法人藥品醫(yī)療器械綜合機(jī)構(gòu)，2008年2月14日)圖2和圖1中記載的阿達(dá)木單抗(基因重組)的重鏈可變區(qū)亞單位或輕鏈可變區(qū)亞單位的氨基酸序列(序列號(hào)25、28)上連接有信號(hào)序列的氨基酸序列(序列號(hào)26、29)，以氨基酸序列不發(fā)生改變的方式確定堿基序列，使用合成dna制作抗人tnfα抗體重鏈基因和輕鏈基因的序列(序列號(hào)24、27)。為了之后的基因操作，在人工序列的端部附加限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。(2)包含抗人tnfα抗體重鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作將實(shí)施例6(2)中制作的包含抗人cd98抗體重鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(cd98h-chx載體)的vh基因片段位點(diǎn)改變成抗人tnfα抗體vh基因片段，構(gòu)建包含抗人tnfα抗體重鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(以下，簡(jiǎn)記為tnfαh-chx載體)?？谷藅nfα抗體重鏈基因使用與本項(xiàng)(1)所示的序列相同的序列。(3)抗人tnfα抗體輕鏈基因表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作將實(shí)施例6(1)中制作的抗人cd98抗體輕鏈基因表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(cd98l載體)的輕鏈基因位點(diǎn)改變成抗人tnfα抗體輕鏈，構(gòu)建抗人tnfα抗體輕鏈基因表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(以下，簡(jiǎn)記為tnfαl載體)。抗人tnfα抗體vl基因使用與本項(xiàng)(1)所示的序列相同的序列。(4)生產(chǎn)抗人tnfα抗體的cho細(xì)胞的制作為了制作生產(chǎn)抗人tnfα抗體的cho-k1細(xì)胞，將上述(1)中制作的tnfα-chx串聯(lián)載體(20μg)與實(shí)施例2中制作的tol2轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體(tol2載體)(10μg)導(dǎo)入實(shí)施例3(1)中制作的在懸浮培養(yǎng)中馴化而得到的cho-k1細(xì)胞中(對(duì)照區(qū))。同樣地，將上述(2)和(3)中制作的tnfαh-chx載體(10μg)、tnfαl載體(10μg)、tol2載體(10μg)分別以環(huán)狀dna的狀態(tài)進(jìn)行共導(dǎo)入(實(shí)驗(yàn)區(qū))。用5塊96孔板進(jìn)行基因?qū)爰?xì)胞的培養(yǎng)，除此以外，與實(shí)施例6同樣地進(jìn)行基因?qū)?、?xì)胞培養(yǎng)等，對(duì)高表達(dá)抗體的細(xì)胞的出現(xiàn)數(shù)進(jìn)行比較。關(guān)于抗體高表達(dá)細(xì)胞，將培養(yǎng)上清中的抗體濃度為3.0μg/ml以上的克隆作為抗體表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。將該結(jié)果示于表7。表7如表7所示，與實(shí)施例6中進(jìn)行的抗人cd98抗體的生產(chǎn)細(xì)胞同樣地共導(dǎo)入有tnfαh-chx載體和tnfαl載體的cho-k1細(xì)胞與導(dǎo)入有tnfα-chx串聯(lián)載體的cho-k1細(xì)胞相比，高表達(dá)抗人tnfα抗體的細(xì)胞的出現(xiàn)率高約4倍。該結(jié)果表明，不論是何種抗體，通過(guò)將分別重組在不同的表達(dá)載體中的插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的抗體重鏈基因和抗體輕鏈基因共導(dǎo)入到懸浮性cho細(xì)胞中，都能夠容易地獲得以及制造抗體高生產(chǎn)株。(5)生產(chǎn)抗人tnfα抗體的cho細(xì)胞的培養(yǎng)從上述(4)中得到的導(dǎo)入有tnfα-chx串聯(lián)載體的細(xì)胞以及共導(dǎo)入有tnfαh-chx載體和tnfαl載體的細(xì)胞中選擇出利用放線菌酮抗性進(jìn)行篩選且表達(dá)抗人tnfα抗體的細(xì)胞，依次在96孔板、24孔板、之后在6孔板上進(jìn)行放大培養(yǎng)。對(duì)于成功進(jìn)行放大培養(yǎng)后的導(dǎo)入有tnfα-chx串聯(lián)載體的4株細(xì)胞以及共導(dǎo)入有tnfαh-chx載體和tnfαl載體的52株細(xì)胞，除了使培養(yǎng)期間為7天以外，與實(shí)施例6(4)同樣地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)量抗體表達(dá)量。將結(jié)果示于圖11。結(jié)果，共導(dǎo)入有tnfαh-chx載體和tnfαl載體的cho-k1細(xì)胞與導(dǎo)入有tnfα-chx串聯(lián)載體的cho-k1細(xì)胞相比，顯示出高約2.4倍的抗體生產(chǎn)量。結(jié)果，與實(shí)施例6(4)同樣地，通過(guò)將抗體重鏈基因和抗體輕鏈基因分別重組在不同的一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的表達(dá)載體共導(dǎo)入到懸浮性cho細(xì)胞中，不僅能夠容易地獲得以及制造抗體高生產(chǎn)株，而且所得到的細(xì)胞具有高抗體生產(chǎn)率。[實(shí)施例8]抗人cd20抗體的制造(1)包含抗人cd20抗體重鏈基因片段、抗人cd20抗體輕鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作為了制作包含由序列號(hào)32和35的氨基酸序列表示的vh和vl的抗人cd20抗體，將實(shí)施例6(1)中制作的cd98-chx串聯(lián)載體的抗體vh或vl基因位點(diǎn)分別取代成來(lái)源于抗人cd20抗體的vh或vl，構(gòu)建包含抗人cd20抗體重鏈基因片段、抗人cd20抗體輕鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(以下，簡(jiǎn)記為cd20-chx串聯(lián)載體)。關(guān)于抗人cd20抗體vh區(qū)和vl區(qū)的基因序列，制作genbank登錄號(hào)ar000013中記載的堿基序列以及リツキサン(r)注10mg/ml審查報(bào)告書(shū)(衛(wèi)研發(fā)第3395號(hào)，2003年8月28日)附件中記載的利妥昔單抗的vh和vl的氨基酸序列(序列號(hào)32、35)上連接有信號(hào)序列的氨基酸序列(序列號(hào)31、34)，以氨基酸序列不發(fā)生改變的方式確定堿基序列，使用合成dna制作抗人cd20抗體vh區(qū)和vl區(qū)的基因序列(序列號(hào)30、33)。為了之后的基因操作，在人工序列的端部附加限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。(2)包含抗人cd20抗體重鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作將實(shí)施例6(2)中制作的cd98h-chx載體抗體vh基因位點(diǎn)改變?yōu)閬?lái)源于抗人cd20抗體的vh，構(gòu)建包含抗人cd20抗體重鏈基因片段和抗放線菌酮基因的表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(以下，簡(jiǎn)記為cd20h-chx載體)?？谷薱d20抗體重鏈基因使用與上述(1)所示的序列相同的序列。(3)抗人cd20抗體輕鏈基因表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作將實(shí)施例6(1)中制作的cd98l載體抗體vl基因位點(diǎn)改變?yōu)閬?lái)源于抗人cd20抗體的vl，構(gòu)建抗人cd20抗體輕鏈基因表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(以下，稱為cd20l載體)。抗人cd20抗體重輕基因使用與上述(1)所示的序列相同的序列。(4)生產(chǎn)抗人cd20抗體的cho細(xì)胞的制作為了制作生產(chǎn)抗人cd20抗體的cho-k1細(xì)胞，將上述(1)中制作的cd20-chx串聯(lián)載體和實(shí)施例2中制作的tol2轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體(tol2載體)導(dǎo)入實(shí)施例3(1)中制作的在懸浮培養(yǎng)中馴化而得到的cho-k1細(xì)胞中(對(duì)照區(qū))。同樣地，將上述(2)和(3)中制作的cd20h-chx載體(10μg)、cd20l載體(10μg)與tol2載體(10μg)一起共導(dǎo)入到cho-k1細(xì)胞中(實(shí)驗(yàn)區(qū))。用5塊96孔板進(jìn)行基因?qū)爰?xì)胞的培養(yǎng)，除此以外，與實(shí)施例6同樣地進(jìn)行基因?qū)?、?xì)胞培養(yǎng)等，對(duì)高表達(dá)抗體的細(xì)胞的出現(xiàn)數(shù)進(jìn)行比較。另外，將抗體濃度為3.0μg/ml以上的孔作為表達(dá)抗體的孔進(jìn)行測(cè)量。將其結(jié)果示于表8。表8結(jié)果，共導(dǎo)入有cd20h-chx載體和cd20l載體的cho-k1細(xì)胞與導(dǎo)入有cd20-chx串聯(lián)載體的cho-k1細(xì)胞相比，高表達(dá)抗人cd20抗體的細(xì)胞的出現(xiàn)率高約3倍。結(jié)果表明，得到與實(shí)施例6(3)或?qū)嵤├?(3)中實(shí)施的抗人cd98抗體、抗人tnfα抗體同樣的結(jié)果，不論是何種抗體，通過(guò)將抗體重鏈基因和抗體輕鏈基因分別重組在不同的轉(zhuǎn)座子序列之間的表達(dá)載體共導(dǎo)入到懸浮性cho細(xì)胞中，都能夠容易地獲得以及制造抗體高生產(chǎn)株。(5)生產(chǎn)抗人cd20抗體的cho細(xì)胞的培養(yǎng)從上述(3)中得到的導(dǎo)入有cd20-chx串聯(lián)載體的細(xì)胞以及共導(dǎo)入有cd20h-chx載體和cd20l載體的細(xì)胞中選擇出利用放線菌酮抗性進(jìn)行篩選且表達(dá)抗人cd20抗體的細(xì)胞，依次在96孔板、24孔板、之后在6孔板上進(jìn)行放大培養(yǎng)。對(duì)于成功進(jìn)行放大培養(yǎng)后的4株對(duì)照區(qū)細(xì)胞以及50株實(shí)驗(yàn)區(qū)細(xì)胞，除了使培養(yǎng)期間為7天以外，與實(shí)施例6(4)同樣地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)量抗體表達(dá)量。將結(jié)果示于圖12。如圖12所示可知，共導(dǎo)入有cd20h-chx載體和cd20l載體的cho-k1細(xì)胞與導(dǎo)入有cd20-chx串聯(lián)載體的cho-k1細(xì)胞相比，具有高約1.6倍的抗體生產(chǎn)率。結(jié)果，得到與實(shí)施例6(4)、實(shí)施例7(5)中實(shí)施的抗人cd98抗體、抗人tnfα抗體的生產(chǎn)率同樣的結(jié)果，通過(guò)將抗體重鏈基因和抗體輕鏈基因分別重組在不同的轉(zhuǎn)座子序列之間的表達(dá)載體共導(dǎo)入到懸浮性cho細(xì)胞中，不僅能夠容易地獲得以及制造抗體高生產(chǎn)株，而且所得到的細(xì)胞具有高抗體生產(chǎn)率。[實(shí)施例9]表達(dá)抗新霉素基因和抗人cd98表達(dá)抗體的轉(zhuǎn)座子載體的制作(1)野生型抗新霉素基因和抗人cd98表達(dá)抗體的轉(zhuǎn)座子載體的制作蛋白質(zhì)表達(dá)用質(zhì)粒載體使用包含含有插入在一對(duì)來(lái)源于tol2的堿基序列之間的任意的人抗體基因和抗藥性標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用基因表達(dá)盒的質(zhì)粒。所使用的基因的dna通過(guò)基于已知的堿基序列進(jìn)行人工化學(xué)合成或者制作其兩端序列的引物并以適當(dāng)?shù)膁na源為模板進(jìn)行pcr來(lái)獲得。為了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。轉(zhuǎn)座子序列使用由日本特開(kāi)2003-235575號(hào)公報(bào)公開(kāi)的非自主性tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列(序列號(hào)1)中第1位至第200位的堿基序列(tol2-l序列)(序列號(hào)2)和第2285位至第2788位的堿基序列(tol2-r序列)(序列號(hào)3)的堿基序列。分別合成包含tol2-r序列或tol2-l序列的dna片段來(lái)使用。作為抗體重鏈基因表達(dá)盒，制備基于抗人cd98抗體n5kg1-valc2igg1ns/i117l載體(日本專利第4324637號(hào)公報(bào))擴(kuò)增得到的、含有在cmv啟動(dòng)子調(diào)控下編碼抗體h鏈的堿基序列(序列號(hào)18)的dna片段，作為抗體輕鏈基因表達(dá)盒，制備基于抗人cd98抗體n5kg1-valc2igg1ns/i117l載體擴(kuò)增得到的、含有在sv40啟動(dòng)子調(diào)控下編碼抗體輕鏈的堿基序列(序列號(hào)21)的dna片段。作為抗新霉素基因表達(dá)盒，制備具有由在sv40啟動(dòng)子調(diào)控下編碼抗新霉素基因的堿基序列構(gòu)成的dna(由序列號(hào)36和genbank登錄號(hào)u47120.2表示的堿基序列構(gòu)成的編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的dna)的dna片段。將上述的抗體重鏈基因表達(dá)盒、抗體輕鏈基因表達(dá)盒和抗新霉素基因表達(dá)盒連接，再在其兩端連接含有tol2-r序列的dna片段和含有tol2-l序列的dna片段，制作抗人cd98抗體表達(dá)載體a(圖13)。(2)具有改變型抗新霉素基因1的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作將(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體a的抗新霉素基因取代成由序列號(hào)37表示的堿基序列構(gòu)成的改變型抗新霉素基因1，制作抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體b。改變型抗新霉素基因1與野生型抗新霉素基因編碼相同的氨基酸序列且對(duì)相當(dāng)于整體的22％的167個(gè)堿基進(jìn)行了改變。具體而言，以使全部32個(gè)亮氨酸殘基中的25個(gè)亮氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子變?yōu)閠ta的方式進(jìn)行了改變。(3)具有改變型抗新霉素基因2的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作將(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體a的抗新霉素基因取代成由序列號(hào)38表示的堿基序列構(gòu)成的改變型抗新霉素基因2，制作抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體c。改變型抗新霉素基因2與野生型抗新霉素基因編碼相同的氨基酸序列且對(duì)相當(dāng)于整體的23％的180個(gè)堿基進(jìn)行了改變。具體而言，以使全部32個(gè)亮氨酸殘基中的28個(gè)亮氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子變?yōu)閠ta的方式進(jìn)行了改變。(4)具有改變型抗新霉素基因3的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作將(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體a的抗新霉素基因取代成由序列號(hào)39表示的堿基序列構(gòu)成的改變型抗新霉素基因3，制作抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體d。改變型抗新霉素基因3與野生型抗新霉素基因編碼相同的氨基酸序列且對(duì)相當(dāng)于整體的26％的203個(gè)堿基進(jìn)行了改變。具體而言，以使全部32個(gè)亮氨酸殘基中的30個(gè)亮氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子變?yōu)閠ta的方式進(jìn)行了改變。[實(shí)施例10]利用表達(dá)改變型抗新霉素基因的抗體生產(chǎn)cho細(xì)胞的抗體生產(chǎn)將實(shí)施例9(1)～(4)中制作的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體a～d與表達(dá)由序列號(hào)40表示的氨基酸序列構(gòu)成的tol2轉(zhuǎn)座酶的載體pcaggs-t2tp[kawakamik&nodat.genetics.166,895-899(2004)]一起分別導(dǎo)入懸浮化cho-k1細(xì)胞中，制作抗體生產(chǎn)細(xì)胞a～d。載體向懸浮cho細(xì)胞中的導(dǎo)入通過(guò)如下方法進(jìn)行：將cho細(xì)胞(4×106個(gè))懸濁于400μl的pbs緩沖液中，通過(guò)電穿孔法將保持環(huán)狀dna狀態(tài)的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(10μg)和tol2轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pcaggs-t2tp(20μg)進(jìn)行共導(dǎo)入。在此，為了暫時(shí)性地表達(dá)tol2轉(zhuǎn)座酶，將tol2轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體也以環(huán)狀dna的狀態(tài)導(dǎo)入。另外，作為不使用tol2轉(zhuǎn)座酶的對(duì)照，利用限制性內(nèi)切酶pcii(寶生物公司)使實(shí)施例19(4)的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體d(10μg)形成直鏈狀后，通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入懸浮化cho-k1細(xì)胞中。電穿孔使用電穿孔儀[genepulserxceiisystem(bio-rad公司制造)]，在電壓300v、靜電容量500μf、室溫的條件下使用間隙寬度為4mm的小池(bio-rad公司制造)進(jìn)行。通過(guò)電穿孔導(dǎo)入基因后，將各小池的細(xì)胞接種到1塊96孔板中，使用添加有5％大豆水解物的cdopticho培養(yǎng)基(invitrogen公司)在co2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)3天。接著，從基因?qū)?天后的培養(yǎng)基更換開(kāi)始，添加g418(geneticin(r)，invitrogen公司)使終濃度為500μg/ml，在g418存在下進(jìn)行培養(yǎng)，每周進(jìn)行培養(yǎng)基更換，并培養(yǎng)3周。培養(yǎng)后，通過(guò)利用fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的夾心法使用lance(r)分析試劑(パーキンエルマー公司)對(duì)抗體的表達(dá)進(jìn)行定量。將其結(jié)果示于表9。表9如表9所示，表達(dá)改變型抗新霉素基因的細(xì)胞b～d中，與表達(dá)野生型抗新霉素基因的細(xì)胞a相比，抗人cd98抗體的表達(dá)量更高。特別是，對(duì)于表達(dá)改變型抗新霉素基因3的抗人cd98抗體生產(chǎn)細(xì)胞d而言，得到了顯示出表達(dá)野生型抗新霉素基因的抗人cd98抗體生產(chǎn)細(xì)胞a的10倍的表達(dá)的細(xì)胞株。另外，對(duì)于即使使用改變型抗新霉素基因3但未共導(dǎo)入tol2轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體的對(duì)照細(xì)胞而言，盡管已使載體形成線狀，但仍未能得到抗人cd98抗體表達(dá)細(xì)胞。[實(shí)施例11]表達(dá)抗嘌呤霉素基因和抗人cd98抗體的轉(zhuǎn)座子載體的制作(1)具有改變型抗嘌呤霉素基因1的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作將實(shí)施例9(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體a的抗新霉素基因取代成由序列號(hào)41表示的堿基序列構(gòu)成的改變型抗嘌呤霉素基因1，制作抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體e。改變型抗嘌呤霉素基因1與由序列號(hào)42表示的堿基序列構(gòu)成的野生型抗嘌呤霉素基因(嘌呤霉素-n-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，由genbank登錄號(hào)u07648.1中公開(kāi)的堿基序列構(gòu)成)編碼相同的氨基酸序列且對(duì)相當(dāng)于整體的3％的17個(gè)堿基進(jìn)行了改變。具體而言，通過(guò)改變使抗嘌呤霉素基因中含有的全部28個(gè)丙氨酸殘基中的17個(gè)丙氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子成為gcg，與野生型中已為gcg的密碼子合并，使全部丙氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子均為gcg。(2)具有改變型抗嘌呤霉素基因2的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體的制作將實(shí)施例9(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體a的抗新霉素基因取代成由序列號(hào)43表示的堿基序列構(gòu)成的改變型抗嘌呤霉素基因2，制作抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體f。改變型抗嘌呤霉素基因2與野生型抗嘌呤霉素基因編碼相同的氨基酸序列且對(duì)相當(dāng)于整體的14％的79個(gè)堿基進(jìn)行了改變。具體而言，在改變型抗嘌呤霉素基因1的丙氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子改變的基礎(chǔ)上，使亮氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子為tta、使纈氨酸殘基所對(duì)應(yīng)的密碼子為gta、使絲氨酸的密碼子為tcg。[實(shí)施例12]利用表達(dá)改變型抗嘌呤霉素基因的抗體生產(chǎn)cho細(xì)胞生產(chǎn)抗體之1將實(shí)施例11(1)的具有改變型抗嘌呤霉素基因1的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體e、實(shí)施例11(2)的具有改變型抗嘌呤霉素基因2的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體f、tol2轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pcaggs-t2tp導(dǎo)入懸浮化的cho-k1細(xì)胞中，制作抗體生產(chǎn)細(xì)胞e和f。載體向懸浮性cho細(xì)胞中的導(dǎo)入通過(guò)如下方法進(jìn)行：將懸浮化cho細(xì)胞(4×106個(gè))懸濁于400μl的pbs緩沖液中，通過(guò)電穿孔法將保持環(huán)狀dna狀態(tài)的具有改變型抗嘌呤霉素基因的抗人cd98抗體表達(dá)轉(zhuǎn)座子載體(10μg)和pcaggs-t2tp(20μg)進(jìn)行共導(dǎo)入。在此，為了暫時(shí)性地表達(dá)tol2轉(zhuǎn)座酶，將tol2轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pcaggs-t2tp也以環(huán)狀dna的狀態(tài)導(dǎo)入。電穿孔使用電穿孔儀[genepulserxceiisystem(bio-rad公司制造)]，在電壓300v、靜電容量500μf、室溫的條件下使用間隙寬度為4mm的小池(bio-rad公司制造)進(jìn)行。通過(guò)電穿孔導(dǎo)入基因后，將各小池的細(xì)胞接種到1塊96孔板中，使用添加有5％大豆水解物的cdopticho培養(yǎng)基(invitrogen公司)在co2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)3天。接著，從基因?qū)?天后的培養(yǎng)基更換開(kāi)始，添加嘌呤霉素(p9620，sigma-aldrich公司)使終濃度為5μg/ml，每周用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，并培養(yǎng)4周。培養(yǎng)后，通過(guò)利用fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的夾心法使用lance(r)分析試劑(パーキンエルマー公司)對(duì)抗體的表達(dá)進(jìn)行定量。將其結(jié)果示于表2。表10由表10所示，表達(dá)改變型抗嘌呤霉素基因2的抗體生產(chǎn)細(xì)胞f顯示出表達(dá)改變型抗嘌呤霉素基因1的抗體生產(chǎn)細(xì)胞e的2倍以上的抗體生產(chǎn)量。[實(shí)施例13]利用表達(dá)改變型抗嘌呤霉素基因的抗體生產(chǎn)cho細(xì)胞的生產(chǎn)抗體之2將實(shí)施例12中得到的表達(dá)改變型抗嘌呤霉素基因2的抗體生產(chǎn)細(xì)胞f在三角燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，生產(chǎn)抗人cd98抗體。具體而言，將抗體生產(chǎn)細(xì)胞f依次在96孔板、24孔板、之后在6孔板中進(jìn)行放大培養(yǎng)。選出細(xì)胞數(shù)充分增加后的抗體生產(chǎn)細(xì)胞f2株(細(xì)胞株1和細(xì)胞株2)，分別以2×105個(gè)/ml懸濁于35ml添加有5％大豆水解物的cdopticho培養(yǎng)基(invitrogen公司)中，使用容量為125ml的三角燒瓶(帶通氣孔蓋，康寧公司)，在37℃、5％co2的氣氛中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)1周，生產(chǎn)抗人cd98抗體。使用hplc(waters公司)對(duì)培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中的抗體量進(jìn)行定量。將其結(jié)果示于表11。表11細(xì)胞株1細(xì)胞株2抗體表達(dá)量(mg/l)15.614.8以上的結(jié)果顯示，懸浮性cho細(xì)胞中，插入在一對(duì)轉(zhuǎn)座子序列之間的抗體基因和改變型抗藥性基因被高效地導(dǎo)入宿主的染色體內(nèi)，而且對(duì)高表達(dá)細(xì)胞的篩選有效。另外可知，所得到的細(xì)胞能夠進(jìn)行放大培養(yǎng)，在懸浮培養(yǎng)條件下能夠進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。參考特定的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，在不脫離本發(fā)明的意圖和范圍的情況下可以進(jìn)行各種變更和變形。本申請(qǐng)基于2010年12月15日提出的日本專利申請(qǐng)2010-279849，其內(nèi)容作為參考并入本說(shuō)明書(shū)中。產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，能夠使用懸浮性哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效地生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)。本發(fā)明的細(xì)胞能夠作為用于生產(chǎn)基因重組蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)細(xì)胞使用。序列表自由文本序列號(hào)1-人工序列的說(shuō)明；非自主性tol2轉(zhuǎn)座子的堿基序列序列號(hào)2-人工序列的說(shuō)明；tol2-l序列序列號(hào)3-人工序列的說(shuō)明；tol2-r序列序列號(hào)7-人工序列的說(shuō)明；抗放線菌酮基因的堿基序列序列號(hào)8-人工序列的說(shuō)明；抗放線菌酮基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列序列號(hào)9-人工序列的說(shuō)明；編碼m2z3抗體h鏈的堿基序列序列號(hào)10-人工序列的說(shuō)明；m2z3抗體h鏈的氨基酸序列序列號(hào)11-人工序列的說(shuō)明；編碼m2z3抗體l鏈的堿基序列序列號(hào)12-人工序列的說(shuō)明；m2z3抗體l鏈的氨基酸序列序列號(hào)13-人工序列的說(shuō)明；非自主性tol1的堿基序列序列號(hào)14-人工序列的說(shuō)明；tol1-l序列序列號(hào)15-人工序列的說(shuō)明；tol1-r序列序列號(hào)18-人工序列的說(shuō)明；編碼cd98抗體重鏈可變區(qū)的堿基序列序列號(hào)19-人工序列的說(shuō)明；cd98抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)20-人工序列的說(shuō)明；cd98抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)21-人工序列的說(shuō)明；編碼cd98抗體輕鏈可變區(qū)的堿基序列序列號(hào)22-人工序列的說(shuō)明；cd98抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)23-人工序列的說(shuō)明；cd98抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)24-人工序列的說(shuō)明；編碼抗人tnfα抗體重鏈可變區(qū)的堿基序列序列號(hào)25-人工序列的說(shuō)明；抗人tnfα抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)26-人工序列的說(shuō)明；抗人tnfα抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)27-人工序列的說(shuō)明；編碼抗人tnfα抗體輕鏈可變區(qū)的堿基序列序列號(hào)28-人工序列的說(shuō)明；抗人tnfα抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)29-人工序列的說(shuō)明；抗人tnfα抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)30-人工序列的說(shuō)明；編碼抗人cd20抗體重鏈可變區(qū)的堿基序列序列號(hào)31-人工序列的說(shuō)明；抗人cd20抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)32-人工序列的說(shuō)明；抗人cd20抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)33-人工序列的說(shuō)明；編碼抗人cd20抗體輕鏈可變區(qū)的堿基序列序列號(hào)34-人工序列的說(shuō)明；抗人cd20抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)35-人工序列的說(shuō)明；抗人cd20抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列序列號(hào)36-人工序列的說(shuō)明；野生型抗新霉素基因的堿基序列序列號(hào)37-人工序列的說(shuō)明；改變型抗新霉素基因的堿基序列序列號(hào)38-人工序列的說(shuō)明；改變型抗新霉素基因的堿基序列序列號(hào)39-人工序列的說(shuō)明；改變型抗新霉素基因的堿基序列序列號(hào)41-人工序列的說(shuō)明；改變型抗嘌呤霉素基因的堿基序列序列號(hào)42-人工序列的說(shuō)明；野生型抗嘌呤霉素基因的堿基序列序列號(hào)43-人工序列的說(shuō)明；改變型抗嘌呤霉素基因的堿基序列序列號(hào)44-人工序列的說(shuō)明；改變型抗嘌呤霉素基因的堿基序列序列號(hào)45-人工序列的說(shuō)明；改變型抗博萊霉素基因的堿基序列序列號(hào)46-人工序列的說(shuō)明；改變型抗博萊霉素基因的堿基序列序列號(hào)47-人工序列的說(shuō)明；改變型抗潮霉素基因的堿基序列序列號(hào)48-人工序列的說(shuō)明；改變型抗潮霉素基因的堿基序列序列表<110>大學(xué)共同利用機(jī)關(guān)法人情報(bào)·系統(tǒng)研究機(jī)構(gòu)（inter-universityresearchinstitutecorporationresearchorganizationofinformationandsystems）協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社（kyowahakkokirinco.,ltd.）<120>蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法（proteinproductionmethod）<130>spi171689-31<150>jp2010-279849<151>2010-12-15<160>60<170>patentinversion3.3<210>1<211>2788<212>dna<213>artificial<220><223>descriptionofartificialsequence;nonautologustol2transposon<400>1cagaggtgtaaagtacttgagtaattttacttgattactgtacttaagtattatttttgg60ggatttttactttacttgagtacaattaaaaatcaatacttttacttttacttaattaca120tttttttagaaaaaaaagtactttttactccttacaattttatttacagtcaaaaagtac180ttattttttggagatcacttcattctattttcccttgctattaccaaaccaattgaattg240cgctgatgcccagtttaatttaaatgttatttattc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