本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一個煙草液泡膜水通道蛋白及其編碼基因的專利申請。

背景技術：

液泡(vacuole)是細胞質中的泡狀結構，由單層膜與其內的細胞液組成。液泡主要存在于植物細胞中，具有一個大的中央液泡是成熟的植物生活細胞的顯著特征，也是植物細胞與動物細胞在結構上的明顯區(qū)別之一。液泡中有細胞液，其功能主要是調節(jié)細胞滲透壓，維持細胞內水分平衡，積累和貯存養(yǎng)料及多種代謝產物。液泡膜具有特殊的選擇透性，使液泡具有高滲性質，引起水分向液泡內運動，對調節(jié)細胞滲透壓、維持膨壓有很大關系，并且能使多種物質在液泡內貯存和積累。貯存和積累在液泡中的物質包括糖、蛋白質、磷脂、單寧、有機酸、植物堿、色素和鹽類等。具體情況因植物種類、器官組織部位、成熟程度等的不同而異。研究表明，液泡是一個很重要的細胞器，在植物細胞生命活動中具多方面作用。胞質中過剩的中間產物被液泡吸收和貯存，可保證胞質ph值的穩(wěn)定，解除部分有毒物質的毒害；當胞質中需要某些物質時，又能及時提供，對保持細胞生物合成原料的穩(wěn)定供應有一定意義。液泡是匯集和輸出無機離子的場所，也是一個磷酸鹽庫。液泡膜上的atp酶起著離子泵的作用。液泡中所含的酸性磷酸酶等水解酶，參與物質貯存、分解以及細胞分化等重要生命活動。

水通道蛋白（aquaproins）是植物體內水跨膜運動的主要通道。水孔蛋白(aquaporin，aqp)是生物體內水分快速跨膜運輸?shù)哪仍诘鞍?，屬于mip(majorintrinsicprotein)超家族。已有研究表明，aqp幾乎存在于植物各個器官和組織中，并發(fā)現(xiàn)aqp優(yōu)先在維管束組織、導管、木質部薄壁細胞等涉及水分運輸?shù)南嚓P細胞和組織中表達。已有研究顯示aqp在植物體內水分運輸中具有重要作用。大量研究還表明，aqp在種子萌發(fā)、細胞伸長、氣孔運動及逆境應答等許多植物生長發(fā)育過程中也起著關鍵作用。另外，植物aqp的表達受到環(huán)境條件和植物激素的調節(jié)。已知干旱、高溫、低溫、高鹽和營養(yǎng)虧缺等環(huán)境脅迫及脫落酸、赤霉素、乙烯等植物激素均可調控aqp的表達。植物aqp主要位于質膜和液泡膜上，并分別稱之為質膜內在蛋白(plasmamembraneintrinsicproteins，pips)和液泡膜內在蛋白(tonoplastintrinsicproteins，tips)，而pips和tips又可分為不同的亞類。不過，迄今有關植物aqp的研究主要集中在pips上。但有研究表明，tips的導水性能是pips的上千倍，更利于水分的快速轉移，因而其在細胞滲透壓及植物水分代謝的快速調節(jié)中可能起著更為重要的作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一個煙草液泡水通道蛋白及其編碼基因（ntab0179880），利用該蛋白與pff19載體所構建的pff19-nttip1.1-gfp重組載體，可為煙草液泡的研究奠定應用基礎。

本申請所采取的技術方案詳述如下。

一個煙草液泡水通道蛋白，屬于一個液泡特異的水通道蛋白，包括251個氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

編碼所述煙草液泡水通道蛋白的煙草液泡水通道蛋白編碼基因（ntab0179880），其堿基序列如seqidno.2所示，對其序列進行分析，結果表明該基因屬于tip基因家族，命名為nttip1.1。

利用煙草液泡水通道蛋白編碼基因所構建的重組載體，命名為pff19-nttip1.1-gfp，該載體中包含有標記熒光蛋白gfp基因，表達后可以用于標記煙草液泡水通道蛋白，從而便于煙草液泡水通道蛋白的定位和作用機理研究。

所述重組載體pff19-nttip1.1-gfp在在煙草液泡研究中的應用，利用peg介導的煙草原生質體轉化法轉化煙草原生質體，瞬時表達后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察懸浮細胞，可看到表達后液泡水通道蛋白定位于植物液泡中；由于該重組載體可特異性表達和定位于植物的液泡膜上，可以作為煙草液泡的共定位表達載體。

所述重組載體pff19-nttip1.1-gfp的構建方法，具體包括如下步驟：

（1）pcr擴增獲得nttip1.1基因，具體過程為：

以紅花大金元煙草品種為材料，提取其基因組rna，反轉錄得cdna；

設計nttip1.1f/nttip1.1r引物對，以上述cdna為模板，進行pcr擴增，具體引物序列設計如下：

nttip1.1-f：cggggtaccatgccgatccaccaaatcaccatcg，其中ggtacc部分堿基序列為kpni酶切位點，

nttip1.1-r：cgcggatccattatactcagcagtaggcac，其中ggatcc部分堿基序列為bamhi酶切位點；

對pcr擴增產物進行電泳并回收擴增產物；

（2）酶切，并連接；具體過程為：

將步驟（1）中所回收pcr擴增產物采用kpni和bamhi進行雙酶切，并回收酶切產物；

同時采用kpni和bamhi酶對pff19-gfp質粒進行雙酶切，并回收酶切產物；

雙酶切時，50μl雙酶切體系設計參考如下：

bufferk，2.5μl；

bamhi，2.5μl；

sphi，2.5μl；

步驟（1）中的nttip1.1基因的擴增產物（或pff19-gfp質粒），20μl；

滅菌水加至50μl；

采用t4dna連接酶將上述nttip1.1基因的酶切產物的粘性末端與pff19-gfp質粒的雙酶切產物的粘性末端進行連接，10μl連接體系參考設置如下：

nttip1.1基因酶切產物，1μl；

pff19-gfp載體酶切產物，1μl；

t4dna連接酶，1μl；

ddh2o加至10μl；

16℃連接過夜；

（3）轉化，篩選，具體為：

將步驟（2）中的連接產物轉化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞，進行抗性篩選，并挑取陽性菌落進行測序驗證，對于驗證正確的菌株進行擴大培養(yǎng)，并提取質粒備用；此質粒即為含有nttip1.1基因和熒光標記蛋白gfp基因的瞬時表達載體，將此質粒載體命名為pff19-nttip1.1-gfp。

本發(fā)明利用煙草液泡水通道蛋白編碼基因nttip1.1構建了一個重組瞬時表達載體pff19-nttip1.1-gfp，該載體轉化煙草細胞后，可利用熒光標記蛋白對煙草液泡水通道蛋白進行標記并進行共表達，進而通過激光共聚焦顯微鏡檢測融合蛋白的位置而液泡水通道蛋白進行定位和研究?？傮w而言，這種方式是一種簡便而又準確的在活細胞中進行定位的方法，可為研究煙草細胞液泡相關功能基因的分子機理提供參考依據，便于對于液泡進行可視化顯示和活體研究。

附圖說明

圖1為重組載體nttip1.1pff19-gfp的酶切驗證圖，其中m為dl2000，1為nttip1.1pff19-yfp質粒酶切圖；

圖2為重組載體nttip1.1pff19-gfp在煙草懸浮細胞中轉化表達后，激光共聚焦定位觀察圖，其中“tag”為熒光標簽通道，“chi”為葉綠素通道，“dic”為明場通道，“merge”為通道疊加。

具體實施方式

下面結合實施例對本申請做進一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中涉及部分生物材料、實驗試劑及實驗設備，簡要介紹說明如下。

生物材料：

煙草紅花大金元，購自于云南省煙草農業(yè)科學研究院中國煙草育種研究南方中心；實驗過程中，栽培于中國煙草總公司鄭州煙草研究院基因中心光照培養(yǎng)間內，制備基因組樣品時，取大十字期的煙草幼嫩葉片進行相關操作；

引物合成及測序公司均有生工生物工程（上海）股份有限公司完成；

pff19-gfp載體，為現(xiàn)有生物材料；

實驗試劑：

pcr反應試劑盒，北京全式金生物技術有限公司產品；

反轉錄試劑盒，smartmmlv反轉錄酶、kpni、bamhi酶、t4dna連接酶（solutioni連接酶）等，均為takara生物技術有限公司產品；

實驗設備：

激光共聚焦顯微鏡，德國leicasp5stedcw。

實施例1

前期研究工作中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一個煙草液泡水通道蛋白，該蛋白與水分通透、液泡內滲透壓調節(jié)等有關，屬于一個液泡特異的水通道蛋白，包括251個氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

編碼所述煙草液泡水通道蛋白的煙草液泡水通道蛋白編碼基因（ntab0179880），其堿基序列如seqidno.2所示，對其序列進行分析，結果表明該基因屬于tip基因家族，命名為nttip1.1。

為進一步研究該液泡水通道蛋白的功能，發(fā)明人利用煙草液泡水通道蛋白編碼基因構建了一個重組載體pff19-nttip1.1-gfp，該載體中包含有標記熒光蛋白yfp基因，表達后可以用于標記煙草液泡水通道蛋白，從而便于煙草液泡水通道蛋白的定位和作用機理研究。

所述重組載體pff19-nttip1.1-gfp的構建過程，簡要介紹如下。

（1）pcr擴增獲得nttip1.1基因，具體過程為：

以紅花大金元煙草品種為材料，提取其基因組rna，反轉錄得cdna；

使用dnaman6.0，結合煙草tip1.1基因編碼序列，設計引物對序列如下：

nttip1.1f：cggggtaccatgccgatccaccaaatcaccatcg，其中ggtacc部分堿基序列為kpni酶切位點，

nttip1.1r：cgcggatccattatactcagcagtaggcac，其中ggatcc部分堿基序列為bamhi酶切位點。

將人工合成的引物分別使用tris-edta（ph=8.0）溶液稀釋至工作濃度10μm，以上述cdna為模板，進行pcr擴增，50μl反應體系設計如下：

10×iibuffer，5μl；

cdna，2μl；

ntcat1-f，2.5μl；

ntcat1-r，2.5μl；

transtaqhifidna聚合酶，0.3μl；

dntp，4μl；

滅菌水加至50μl；

pcr擴增反應條件設置為：94℃預變性5min；94℃、30s，62℃、30s，72℃、40s，35個循環(huán)；再72℃、10min，16℃、10min，

將pcr擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收，所回收產物4℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M行后續(xù)操作實驗。

（2）酶切，并連接；具體過程為：

將步驟（1）中所回收pcr擴增產物采用kpni和bamhi進行雙酶切，并回收酶切產物；

同時，采用kpni和bamhi對pff19-gfp質粒進行雙酶切，并回收酶切產物。

雙酶切時，50μl雙酶切體系設計參考如下：

bufferk，2.5μl；

bamhi，2.5μl；

sphi，2.5μl；

步驟（1）中的nttip1.1基因的擴增產物（或pff19-gfp質粒），20μl；

滅菌水加至50μl；

采用t4dna連接酶（solutioni連接酶）將上述nttip1.1基因的酶切產物的粘性末端與pff19-gfp質粒的雙酶切產物的粘性末端進行連接，10μl連接體系參考設置如下：

nttip1.1基因酶切產物，1μl；

pff19-gfp載體酶切產物，1μl；

t4dna連接酶，1μl；

ddh2o加至10μl；

16℃連接過夜。

（3）轉化，篩選，具體為：

將步驟（2）中的連接產物以熱激法轉化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞，在含有amp(氨芐青霉素，50μg/ml)的lb培養(yǎng)基上進行抗性篩選，并挑取陽性菌落提取質粒進行酶切驗證，酶切驗證結果如圖1所示，表示質粒重組正確；進一步對酶切驗證正確重組質粒進行測序驗證，確保重組質粒構建無誤。

對于驗證正確的菌株進行擴大培養(yǎng)，并提取質粒備用；此質粒即為含有nttip1.1基因和熒光標記蛋白gfp基因的瞬時表達載體，將此質粒載體命名為pff19-nttip1.1-gfp。

實施例2

將實施例1中所制備pff19-nttip1.1-gfp質粒載體通過peg介導的煙草原生質體轉化法轉化煙草原生質體，進一步通過激光共聚焦顯微鏡觀察，即可較為直觀的定位煙草液泡水通道蛋白nttip1.1，從而為相關基因研究奠定研究基礎和應用基礎，相關實驗簡要介紹如下。

（一）制備煙草原生質體，具體操作為：

1、稱取0.2gcellulaser-10（solarbio）、0.08gmacerozymer-10（solarbio），加入到20ml酶儲液中，55℃水浴10min，冷卻后加入200ul的1mcacl2（10mm），0.02gbsa（0.1%），0.45μm微孔過濾，制成酶解液，移入100ml小燒杯中備用；

2、取生長4周的煙草葉片（紅花大金元，健康、生長狀況良好的肥厚葉片），每個轉化約10片，去除葉前緣和葉柄，用刀片切成1mm寬長條，置于步驟1的酶解液中，錫箔紙包裹避光，23℃、40~50rpm酶解2.5~3h；

3、將步驟2的酶解液用100~200目篩子過濾，將濾液置于50ml離心管中，4℃、60g、brake=4離心15min；

4、棄上清，沉淀用4ml冰浴的w5溶液輕輕吹散洗滌。4℃、100g、brake=4離心3min；

5、棄上清，沉淀再次用4ml冰浴的w5溶液重懸，冰上放置30min；

6、23℃、100g、brake=4離心1min，棄上清，沉淀用mmg溶液重懸，每一個轉化加100μlmmg。

（二）peg介導的煙草原生質體轉化，具體操作為：

7、取10~20μg質粒（實施例1所制備pff19-nttip1.1-gfp質粒）于1.5mlep管中，加入100μl步驟6中的原生質體，輕柔混勻；

8、加入110μl的peg-ca溶液，輕柔混勻，放置20~30min；

9、加入440μl的w5溶液，輕柔混勻，23℃、100g、brake=4離心1min；

10、棄上清，加入500μl的w5溶液，輕柔混勻，移入清洗干凈且用w5溶液潤洗過的六孔板中，用w5溶液補足1ml，稍微混勻；

23℃，錫箔紙包裹避光培養(yǎng)6~18h；然后進行激光共聚焦顯微鏡觀察。

（三）激光共聚焦顯微鏡觀察，具體操作過程為：

首先吸取適量原生質體懸浮液滴于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片；最后通過激光共聚焦顯微鏡進行觀察；

觀察時，將載玻片倒置放于載物臺上，用明視野進行調焦，視野清晰后用暗視野尋找發(fā)出亮綠色熒光的細胞；設定激光共聚焦的z軸對細胞進行拍照。

結果如圖2所示。對圖2分析可以看出，圖2中的熒光位置在細胞內特異性分布，形態(tài)大小結構與植物細胞的液泡相符，因此，可利用此載體作為細胞過氧化物酶體的基因共定位載體，利用這一定位結果，進而可用于分析植物細胞自噬分子機理的研究。

需要解釋的是，上述操作過程中，部分試劑配制情況簡介如下：

200mmmes（3.904g/100ml），koh調整ph=5.7（非常重要的母液，ph務必準確）；

1m甘露醇（18.218g/100ml）；

1mcacl2（11.1g/100ml）；

酶儲液（200ml），包括：

a，0.4m甘露醇（80ml、1m甘露醇）；

b，20mmmes（20ml、200mmmes）；

c，20mmkcl（0.2982gkcl）；

mmg（10ml），包括：

a，0.4m甘露醇（4ml1m甘露醇）；

b，4mmmes（200ul200mmmes）；

c，15mmmgcl2（0.03049g無水mgcl2或0.065gmgcl2·6h2o）；

w5（100ml），包括：

154mmnacl（0.8999gnacl）；

125mmcacl2（12.5ml1mcacl2）；

5mmkcl（0.037275gkcl）；

2mmmes（1ml200mmmes）；

peg(40%)-ca（1ml），包括：

peg4000(sigma)，0.4g；

h2o，0.3ml；

1m甘露醇，0.2ml；

1mcacl2，0.1ml。

sequencelisting

<110>中國煙草總公司鄭州煙草研究院

<120>一個煙草液泡膜水通道蛋白及其編碼基因

<130>none

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<213>nicotianatabacum

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