本發(fā)明涉及一種流感病毒檢測技術(shù)，尤其涉及一種流感病毒rrt-pcr檢測引物和探針及檢測h7n9亞型流感病毒的方法。

背景技術(shù)：

流感病毒中的a型流感病毒常常以前世界范圍內(nèi)的大流行，根據(jù)流感病毒表面蛋白血凝素(ha)和神經(jīng)氨酸酶(na)可以將a型流感病毒劃分為18個ha亞型和11個na亞型。野生水禽是a型流感病毒的天然宿主，對于任何一個禽流感病毒，要實現(xiàn)由天然宿主一步步跨種傳播感染的過程，受到很多因素的影響，包括病毒、宿主以及環(huán)境因素等。

每年都有偶發(fā)的人感染禽流感病毒病例發(fā)生。2013年我國首次在上海等地不明原因肺炎死亡病例中發(fā)現(xiàn)一種新型重配的h7n9亞型流感病毒是其病原，該病毒是由野鳥中的h7亞型禽流感病毒與鴨中流行的n9亞型禽流感病毒形成h7n9禽流感病毒前體病毒，該前體病毒進一步傳入到雞群中，與雞群中流行的h9n2亞型禽病毒進一步重配，獲得h9n2亞型禽流感病毒的6個內(nèi)部基因形成目前在雞群中流行的新型h7n9亞型禽流感病毒。該病毒每年冬春季都會造成人感染病例的一個流行高峰，截止到2017年2月，該病毒已經(jīng)造成1258人感染，其中477人死亡。人感染該病毒后主要重癥肺炎、多器官衰竭等嚴重臨床癥狀，病死率高達40％，對民眾健康造成重大威脅。因此如何對病例早期診斷對于指導(dǎo)臨床治療至關(guān)重要。發(fā)明人2013年成功研發(fā)了可以檢測h7n9亞型流感病毒的檢測方法，但是2017年2月19日，發(fā)明人同廣東省疾病預(yù)防控制中心共同發(fā)現(xiàn)h7n9亞型流感病毒發(fā)生了新的變異，在其血凝素蛋白的剪切位點插入了4個氨基酸，導(dǎo)致剪切位點處突變?yōu)楹?個堿性氨基酸，表明病毒已經(jīng)從以前對雞不致病變成了對雞高致病的病毒，對人的致病性影響還不清楚。隨后農(nóng)業(yè)部門在雞中發(fā)現(xiàn)了同樣的病毒，表明該病毒已經(jīng)在我國部分地區(qū)的雞群中流行，因此不僅對我國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大威脅，而且會導(dǎo)致人的感染和死亡。因此本專利專門針對該變異高致病性病毒，應(yīng)用特異性高的taqman探針以及pcr引物，能夠快速特異性地檢測血凝素基因突變區(qū)域，可以區(qū)別低致病性h7n9流感病毒，也可鑒別診斷其他亞型流感病毒，可以用于人感染病例的診斷以及禽類產(chǎn)品的檢疫等，應(yīng)用范圍廣。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、應(yīng)用方便的流感病毒rrt-pcr檢測引物和探針及檢測h7n9亞型流感病毒的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明的流感病毒rrt-pcr檢測引物和探針，包括以下一種或多種引物和探針：

針對新型高致病性h7n9亞型禽流感病毒ha基因裂解位點及附近相對保守區(qū)域設(shè)計的兩組引物探針，兩組引物的正向引物和探針相同，反向引物不同，即共計有正向引物一條，反向引物兩條，探針一條。

本發(fā)明的應(yīng)用上述的流感病毒rrt-pcr檢測引物和探針檢測h7n9亞型流感病毒的方法，包括步驟：

首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取h7n9亞型流感病毒rna；

然后，利用一步法rrt-pcr試劑盒加入所述引物和探針進行核酸擴增；

之后，根據(jù)ct值判斷rrt-pcr檢測結(jié)果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。

由上述本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明所述的流感病毒rrt-pcr檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法，由于包括針對新型高致病性h7n9亞型禽流感病毒ha基因相對保守區(qū)引物和探針，可以通過rrt-pcr法檢測新型高致病性h7n9亞型流感病毒，操作簡單、應(yīng)用方便。

具體實施方式

本發(fā)明的新型高致病性h7n9亞型流感病毒rrt-pcr檢測引物和探針，其較佳的具體實施方式是，包括以下一種或多種引物和探針：

針對新型高致病性h7n9亞型流感病毒ha基因相對保守區(qū)域設(shè)計的兩組引物探針，正向引物一條，反向引物兩條，探針一條。

所述引物和探針可以包括長度為22～23bp的寡核苷酸片段；

其中針對新型高致病性h7n9亞型流感病毒ha基因正向引物與新型高致病性h7n9亞型流感病毒ha基因的正鏈堿基序列一致，反向引物與負鏈的堿基序列一致，而探針與目的基因負鏈的堿基序列一致。

所述兩組新型高致病性h7n9亞型流感病毒特異性引物和探針包括以下一條正向引物序列，兩條反向引物序列和一條探針序列：

第一組引物序列：5’-cagttggaaaatgtccgagatat-3’；

5’-gaaacccgctatagcaccaaata-3’；

探針序列：5’fam-aggcctctcgcagtccgttttc-bhq13’；

第二組引物序列：5’-cagttggaaaatgtccgagatat-3’；

5’-gccttcccatccattttcaatga-3’；

探針序列：5’fam-aggcctctcgcagtccgttttc-bhq13’。

上述探針序列兩端的標記為fam、bhq1熒光素標記。

本發(fā)明應(yīng)用上述的新型高致病性h7n9亞型流感病毒rrt-pcr檢測引物和探針檢測新型高致病性h7n9亞型流感病毒的方法，其較佳的具體實施方式是，包括步驟：

首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒rna；

然后，利用一步法rrt-pcr試劑盒加入所述引物和探針進行核酸擴增；

所述流感病毒包括新型高致病性h7n9亞型流感病毒。

本發(fā)明中的引物和探針序列(5’→3’)及其檢測的靶片段如下：

具體實施例：

包括了寡核苷酸引物的設(shè)計、taqman探針的設(shè)計、待檢樣本的處理、檢測和分析。為進一步說明流感病毒rrt-pcr檢測引物及應(yīng)用方法，參照下列實施例進行說明：

實施例一：新型高致病性h7n9亞型流感病毒rrt-pcr寡核苷酸引物的設(shè)計與合成

genbank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/flu/flu.html)中和中國國家流感中心病毒序列數(shù)據(jù)庫中下載h7n9亞型流感病毒及新型高致病性h7n9亞型流感病毒ha基因全序列，mega軟件比對分析所下載基因序列的一致性，選擇在新型高致病性h7n9亞型流感病毒ha基因的切割位點設(shè)計探針，在切割位點上下游相對保守區(qū)設(shè)計引物。引物和探針設(shè)計中允許同一變異位點允許2個及2個以下簡并堿基。將所提取的備選引物滿足以下要求進行篩選：①探針與同鏈引物位置接近，pcr產(chǎn)物大小在100bp到150bp之間。②引物和探針的gc％在25％到75％之間；③引物長度20bp左右，tm值在58℃到60℃之間，探針長度20bp到30bp，tm值比引物高5℃到10℃；④polyn≤4bp；⑤hairpin≤4bp；⑥覆蓋率>90％；⑦進行blast篩選，特異性分數(shù)>l×0.4；⑦探針5’端應(yīng)避免使用堿基g。

實施例二：本發(fā)明檢測未知病毒的應(yīng)用舉例

1.病毒rna的提?。?/p>

取病毒采樣液200μl，加入500μl裂解液，按rneasyminikit(qiagen公司，catalog#74104)說明書提取病毒rna50μl。

2.rrt-pcr反應(yīng)

1)體系配置：使用agpath-idtmone-steprt-pcrreagents(thermofisherscientific公司，catalog#am1005)反應(yīng)液

2)rrt-pcr：將加好上述反應(yīng)體系的反應(yīng)管放于pcr儀進行rrt-pcr，反應(yīng)程序如下

45℃作用10分鐘；

95℃作用10分鐘；

95℃變性15秒；

60℃延伸45秒；

回到第3步，40個循環(huán)。

3.結(jié)果判斷：

陰陽對照結(jié)果成立的情況下判斷結(jié)果，即陰性參照沒有ct值，而陽性參照有ct值。一般情況的下ct值小于38的可以判斷為陽性。

本發(fā)明提供了2套用于甄別新型高致病性h7n9亞型流感流感病毒的特異性寡核苷酸引物及探針序列；并提供了rrt-pcr的檢測體系及其在流感病毒快速檢測中的應(yīng)用。

檢測評價：

特異性評價：共選取國內(nèi)近兩年來流行的新型h7n9亞型流感病毒，新型高致病性h7n9亞型流感病毒及新型高致病性h5n6亞型流感病毒共11株進行檢測,兩套引物和探針均能檢出新型高致病性h7n9亞型流感病毒，而不能檢出新型h7n9亞型流感病毒以及新型高致病性h5n6亞型流感病毒。

靈敏性評價：利用a型流感病毒m基因體外轉(zhuǎn)錄rna標準品，以及新型高致病性h7n9亞型流感病毒a/guangdong/17sf003/2017提取的rna10倍梯度稀釋液對本發(fā)明設(shè)計的兩組引物探針組合的檢測極限進行確定，結(jié)果證明本發(fā)明的兩套引物探針可以檢測低至100個rna拷貝。

本發(fā)明可以將rrt-pcr技術(shù)應(yīng)用于新型高致病性h7n9亞型流感病毒的甄別、檢測體系中。為新型高致病性h7n9亞型流感病毒的實驗室診斷提供了有效的檢測技術(shù)，為新型高致病性h7n9亞型流感病毒病例診斷、禽類產(chǎn)品的檢疫等工作提供技術(shù)手段和檢測依據(jù)。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護范圍為準。