1技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品安全性檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種多重pcr技術(shù)檢測微生態(tài)活菌制劑中是否食源性致病菌超標的方法。

2

背景技術(shù)：

食源性疾病是指通過攝食而進入人體的有毒有害物質(zhì)(包括生物性病原體)等致病因子所造成的疾病。一般可分為感染性和中毒性,包括常見的食物中毒、腸道傳染病、人畜共患傳染病、寄生蟲病以及化學(xué)性有毒有害物質(zhì)所引起的疾病。食源性致病菌能引起食源性疾病或者食物中毒，甚至?xí)绊懭祟惖娜松戆踩斐芍卮蠼?jīng)濟財產(chǎn)損失，降低人們的生活質(zhì)量。

據(jù)世界衛(wèi)生組織(worldhealthorganization,who)報道,全球每年發(fā)生腹瀉病的病例數(shù)高達1.5億，其中70％病例與各種致病性微生物污染的食品有關(guān)。我國的研究資料也顯示，微生物是食源性疾病的主要病原，占46.4％。食品中的生物性污染無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家都是影響食品安全的最主要原因。食品安全是全球性的重大公共衛(wèi)生問題。致病微生物污染帶來的食品安全事故也不斷的被報道，如英國的瘋牛病、法國的李斯特氏菌病、日本的腸出血性大腸桿菌o157:h7和雪印牛奶的葡萄球菌腸毒素中毒事件、我國安徽阜陽劣質(zhì)嬰幼兒配方粉事件等。

國家依據(jù)“食源性疾病監(jiān)控技術(shù)的研究”建立了全國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò),對食品中沙門菌、單核細胞增生李斯特菌、大腸埃希菌o157:h7等目前國際公認的食源性致病菌進行了監(jiān)測和預(yù)警,以期為有針對性地預(yù)防和控制食源性疾病的發(fā)生提供參考。

目前食源性致病菌的檢測方法過主要是通過化學(xué)、微生物學(xué)、生物物理學(xué)、免疫學(xué)以及血分子生物學(xué)技術(shù)對食源性致病菌進行檢測。最早的傳統(tǒng)生化鑒定試驗，主要包括食源性致病菌檢測步驟為：增菌培養(yǎng)、分離純化、革蘭氏染色、生化試驗及血清學(xué)試驗等一系列步驟，過程周期長，操縱復(fù)雜。隨著生物技術(shù)的發(fā)展與分子生物學(xué)的進展，發(fā)明了多聚酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction，pcr)，pcr技術(shù)檢測周期較短，靈敏度高，特異性強等特點。根據(jù)pcr技術(shù)發(fā)展，可直接用菌液進行食源性致病菌的檢測，包括多重pcr，熒光定量pcr等技術(shù)。實時熒光定量pcr是指在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個pcr進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。所采用的熒光物質(zhì)分為熒光染料和熒光探針，sybrgreeni熒光染料和taqman探針法較為常見。該方法廣泛應(yīng)用于食品中單核增生李斯特、大腸桿菌o157:h7和沙門氏菌等病原致病菌的檢測。多重pcr原理跟常規(guī)pcr相同，只是在同一反應(yīng)體系中加入多對引物同時擴增多條目的dna片段，采用該方法可同時檢測多種病原微生物，多重pcr技術(shù)有成本低，靈敏度高，周期短等特點。免疫學(xué)的方法主要有乳膠凝集反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)、免疫膠體金技術(shù)等。乳膠凝集反應(yīng)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，加上具有良好吸附性的大分子的乳膠顆粒作為載體吸附可溶性抗原于其表面，當(dāng)特異性抗體與之結(jié)合后，產(chǎn)生凝集反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)技術(shù)是1971年，engvall建立了elisa方法是一種固相免疫分析方法它將受檢標本吸附于固相載體表面的抗原或抗體，在載體上進行免疫酶染色，底物顯色后，通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量來確定樣品中待測物質(zhì)含量。目前該方法已被廣泛應(yīng)用于多種細菌檢測，如食品中大腸桿菌o157、單增李斯特菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌等。

微生態(tài)制劑，是在微生態(tài)學(xué)理論指導(dǎo)下，調(diào)整微生態(tài)失調(diào)，保持微生態(tài)平衡，提高宿主健康水平的正常菌群及其代謝產(chǎn)物和選擇性促進宿主正常菌群生長的物質(zhì)制劑總稱。微生態(tài)活菌制劑中含有大量的微生物活體，多則能達到10¹⁰cfu/ml。目前多以乳酸菌為主，涉及到革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，有時還會添加進酵母菌等。

市場上生肉樣品、生奶樣品、水產(chǎn)品類、生禽肉類、熟肉制品、蔬菜沙拉、速凍熟制米面、剩飯、嬰幼兒食品、乳制品等常會出現(xiàn)不同程度的食品污染。目前食源性致病菌的檢測方法過主要是通過化學(xué)、微生物學(xué)、生物物理學(xué)、免疫學(xué)以及血分子生物學(xué)技術(shù)對食源性致病菌進行檢測。由于這些傳統(tǒng)的檢測方法工序煩瑣，耗時長。而微生態(tài)活菌制劑中本身含有大量不同種屬的微生物，就使傳統(tǒng)的檢測方法更加復(fù)雜，準確度也明顯降低。本發(fā)明主要以多重pcr為基礎(chǔ)，可以快速準確地檢測乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉，以期對各種食品尤其是微生態(tài)制劑中食源性致病菌的控制、監(jiān)督和檢測提供借鑒。

3

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種快速高效檢測食源性致病菌的方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種多重pcr技術(shù)檢測食源性致病菌的方法，所述方法為：設(shè)計了七種食源性致病菌的特異性引物，能夠同時檢測七種食源性致病菌。

前述方法具體技術(shù)方案包括以下步驟：

(1)菌種培養(yǎng)：接種環(huán)接種于無菌培養(yǎng)基，28℃，180r/min搖床培養(yǎng)過夜10h(黑曲霉菌培養(yǎng)的時間為3d(張曉利等.4種黑曲霉基因組dna提取方法的比較))，分別用基因組提取試劑盒提取基因組：北京全式金公司的easypuregenomicdnakit試劑盒和omega公司的e.z.n.a.^tmhpfungaldnakit試劑盒(用于提取黑曲霉菌基因組)。

①乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的增菌培養(yǎng)基是：液體lb培養(yǎng)基：酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、氯化鈉10g/l(ph＝6.9，115℃滅菌25min)。

②黑曲霉菌的增菌培養(yǎng)基是：液體改良馬丁培養(yǎng)基：葡萄糖20g/l，蛋白胨5.0g/l，酵母提取物2.0g/l，磷酸氫二鉀1.0g/l，硫酸鎂0.5g/l(ph＝6.4±0.2，115℃滅菌25min)。

(2)引物設(shè)計：先查找這七種食源性致病菌的特異性基因，然后在ncbi上搜索該基因的序列，再用軟件primerpremier5設(shè)計引物，選用評分較高的引物。

(3)引物的特異性檢測：檢測軟件設(shè)計的引物的特異性，用到兩種方法：

1、引物的序列比對，在ncbi網(wǎng)站上進行blast序列比對；

2、多重pcr引物與引物兩兩之間的特異性擴增檢驗。

(4)七重pcr檢測：在反應(yīng)體系中同時添加七種菌的模板和引物進行擴增。

(5)檢測限的確定：設(shè)計模板的不同濃度梯度：10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl，再根據(jù)一個堿基對的平均質(zhì)量為650道爾頓，然后換算檢測限的菌數(shù)。

較優(yōu)地，所述步驟(1)中，基因組提取的結(jié)果：

較優(yōu)地，所述步驟(2)中，七種菌的特異性基因分別是乙型副傷寒沙門氏菌為mgtc(沙門氏菌毒力島mgtc基因)、大腸埃希氏菌為uida(β-葡糖苷酶基因)、金黃色葡萄球菌nuc(耐熱核酸酶基因)、短小芽孢桿菌gyrb(促旋酶的a亞單位基因)、枯草芽孢桿菌rpoa(dna指導(dǎo)的rna聚合酶α亞基)、銅綠假單胞菌oprl(外膜脂蛋白基因)、黑曲霉fum8(α-oxoaminesynthase)。

如下表(1)進行的雙重pcr檢測本實驗設(shè)計的引物兩兩之間特異性的反應(yīng)條件是：

表1進行的雙重pcr檢測本實驗設(shè)計的引物兩兩之間特異性的反應(yīng)條件

如下表(2)進行的雙重pcr檢測本實驗設(shè)計的引物兩兩之間特異性的反應(yīng)體系是：

表2進行的雙重pcr檢測本實驗設(shè)計的引物兩兩之間特異性的反應(yīng)體系

較優(yōu)地，所屬步驟(3)中，設(shè)計出特異性強的引物并在吉林省庫美生物科技有限公司進行引物合成，如下表(3)本實驗設(shè)計的引物及其所在的基因信息：

表3本實驗設(shè)計的引物及其所在的基因信息

較優(yōu)地，所述步驟4中，

如下表(4)進行七重pcr的反應(yīng)條件為：

表4進行七重pcr的反應(yīng)條件

表(5)進行七重pcr的反應(yīng)體系為：taqpremix購于中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司。

表5進行七重pcr的反應(yīng)體系

較優(yōu)地，所述步驟(5)中，檢測限達到200fg/μl，能達到食品檢驗的標準。

本發(fā)明以食源性致病菌的特異性基因設(shè)計出特異性的引物，先進行了引物的特異性檢驗，結(jié)果表明引物之間的特異性良好，然后進行了七重pcr的檢測，檢測了引物的檢測限，結(jié)果表明本實驗設(shè)計的引物能達到較低的檢測限度為200fg/μl，其對應(yīng)的菌數(shù)為120cfu/ml，能達到食品安全的標準，一般致病菌達到1000cfu/ml才能引起致病作用。

4附圖說明

圖1是常見食源性致病菌種類別和特點。本實驗七種食源性致病菌的菌種編號與特點

圖2是引物之間的特異性檢測。m(marker：8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。line1、2、3、4、5、6；從上到下依次為黑曲霉、沙門氏菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌的目的條帶，引物濃度從左到右梯度減小。

圖3是一款微生態(tài)制劑用七重pcr致病菌檢測。m(marker：8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。line1：從上到下依次為黑曲霉、沙門氏菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌的引物和微生態(tài)活菌制劑進行七重pcr擴增，line2:從上到下依次為黑曲霉、沙門氏菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌的引物和陰性對照(無菌水)進行七重pcr擴增，引物濃度都為10ng/μl。結(jié)果微生態(tài)活菌制劑和無菌水都無擴增條帶。

5具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

1)一款固體微生態(tài)制劑的再水化：準確稱取固體微生態(tài)制劑(包括固體顆粒、菌粉等形式)0.05g，于ep管中，加入0.95ml滅菌pbs緩沖液，37℃搖床100rpm緩慢搖晃30min。

2)基因組提取：將步驟(1)制備得到的發(fā)酵溶液取出1ml，12000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄上清。先用500μl70％乙醇將菌體重懸，冰浴20min，加入溶菌酶重懸，37℃孵育60min，加入蛋白酶，55℃孵育15min，加入rnasea靜置2min，加入bindingbuffer400μl混勻，加入到離心柱中，棄掉流出液，先后用washbuffer和cleanbuffer洗滌兩次，用elutionbuffer洗脫dna。提取的基因組用1％瓊脂糖凝膠測電泳檢。

3)引物合成：所設(shè)計的各種常見致病菌的引物對如表3所述，根據(jù)表3提供的引物對的堿基信息由引物合成公司合成。

4)用多重pcr致病菌檢測：將處理后的微生態(tài)制劑為模板，同時加入乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的特異性引物為引物進行多重pcr擴增。七重pcr的反應(yīng)條件、反應(yīng)體系如上述表4，表5所示。

5)核酸電泳檢測：上述pcr產(chǎn)物加于2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否存在致病菌條帶。

雖然，上文中己經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。