本發(fā)明屬于生物高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種利用光引發(fā)raft聚合原位誘導(dǎo)自組裝制備蛋白質(zhì)基納米粒子的方法。

背景技術(shù)：

分子自組裝是一種在生物系統(tǒng)中普遍存在的現(xiàn)象，是生命科學(xué)中最重要的內(nèi)容之一，通過分子自組裝形成各種復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu)，如dna合成、rna轉(zhuǎn)錄。近些年來，通過設(shè)計(jì)合成不同結(jié)構(gòu)及不同親疏水比例的聚合物，采用超分子自組裝的策略制備了具有不同形貌的納米材料，也展現(xiàn)了其在食品、化妝品工業(yè)、催化劑及生物醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用。但是這種經(jīng)典的自組裝方法，對聚合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)有很強(qiáng)的依賴性，部分特定結(jié)構(gòu)聚合物的合成較為復(fù)雜，一定程度上限定了其大規(guī)模制備應(yīng)用。近而，科研人員提出了一種聚合誘導(dǎo)自組裝的新方法來解決上述問題，選擇水溶性的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑和水溶性單體(聚合物為非水溶性)在高聚合物濃度條件下原位自組裝成不同形貌的納米材料。但是目前，所有不同形貌的納米材料主要基于不同功能的聚合物進(jìn)行設(shè)計(jì)構(gòu)筑。然而考慮到其潛在應(yīng)用于藥物傳輸系統(tǒng)、生物成像及分子治療等方面，其自身缺少生物相容性和降解性在一定程度上限制了該構(gòu)筑納米材料的使用。因此直接利用天然大分子材料，如碳水化合物，多肽和蛋白質(zhì)等進(jìn)行不同組裝體形貌的構(gòu)筑引起了研究者們極大的興趣。其中，蛋白質(zhì)因其具有好的生物降解性、免疫原性、穩(wěn)定性、低毒性和易于功能化，成為一種極具吸引力的材料來制備納米粒子。目前，利用紫杉醇和白蛋白在無溶劑條件下制備的納米粒子，已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于乳腺癌治療。發(fā)展的制備蛋白質(zhì)納米粒子技術(shù)主要有：乳化法、熱凝膠法、去溶劑化法、噴霧干燥法和在膠束中自組裝法。然而上述所有方法都是將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分解或變性來制備納米粒子。因此如何實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)納米粒子構(gòu)筑的同時(shí)又保持了構(gòu)筑基元蛋白質(zhì)的催化活性是該領(lǐng)域面臨的又一科學(xué)挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有方法無法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)納米粒子構(gòu)筑的同時(shí)又保持了構(gòu)筑基元蛋白質(zhì)的催化活性的問題，而提供了一種利用光引發(fā)raft聚合原位誘導(dǎo)自組裝制備蛋白質(zhì)基納米粒子的方法。

一種利用光引發(fā)raft聚合原位誘導(dǎo)自組裝制備蛋白質(zhì)基納米粒子的方法具體是按以下步驟進(jìn)行的：

一、pbs緩沖溶液的配制：將nah2po4和na2hpo4混合溶解在去離子水中配制成pbs緩沖溶液；所述nah2po4與na2hpo4的質(zhì)量比為1:(10～12.5)；所述pbs緩沖溶液的濃度為45mmol/l～55mmol/l，ph值為7.4～7.6；

二、制備蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑：將牛血清白蛋白溶解在步驟一得到的pbs緩沖溶液中，得到牛血清白蛋白磷酸緩沖液；將α-端巰基噻唑啉酯活化的raft試劑溶于二甲基亞砜中，得到raft溶液；在磁力攪拌條件下將raft溶液逐滴滴加到牛血清白蛋白磷酸緩沖液中，反應(yīng)10h～24h后透析2d，冷凍干燥，得到蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末；所述牛血清白蛋白磷酸緩沖液的濃度為1.5mg/ml～2.4mg/ml；所述α-端巰基噻唑啉酯活化的raft試劑的質(zhì)量與二甲基亞砜的體積比為1mg:(0.4～5)ml；

三、光引發(fā)raft水相聚合誘導(dǎo)蛋白質(zhì)原位自組裝：將步驟二得到的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末配置成濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液，向濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中依次加入甲基丙烯酸羥丙酯單體和濃度為1mg/ml的氯化三(2,2’-聯(lián)吡啶)釕水溶液，然后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中，除去反應(yīng)器中的氧氣，在可見光led燈的照射下進(jìn)行聚合反應(yīng)1h～12h，得到蛋白質(zhì)基納米粒子；所述甲基丙烯酸羥丙酯單體與濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量比為1:(0.02～0.2)；所述濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量與濃度為1mg/ml的氯化三(2,2’-聯(lián)吡啶)釕水溶液的體積比為1mg:(0.001～0.02)ml。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明采用光引發(fā)raft水相聚合的方法，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)原位自組裝，提供了一種操作簡單、反應(yīng)條件溫和、不破壞蛋白質(zhì)催化活性、適用范圍廣和高效率的蛋白質(zhì)納米粒子的制備方法，該方法適用于多種可以進(jìn)行raft試劑修飾的蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白，人血清白蛋白，溶菌酶，堿性磷酸酶，葡萄糖氧化酶等。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一步驟二得到的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末的紫外光譜圖；

圖2為實(shí)施例一步驟三得到的蛋白質(zhì)基納米粒子的微觀形貌圖；

圖3為實(shí)施例一步驟三得到的蛋白質(zhì)基納米粒子的粒徑分布圖；

圖4為牛血清白蛋白、實(shí)施例四中未進(jìn)行聚合反應(yīng)的蛋白質(zhì)基納米粒子、實(shí)施例四中聚合反應(yīng)2h的蛋白質(zhì)基納米粒子和實(shí)施例四中聚合反應(yīng)6h的蛋白質(zhì)基納米粒子活性測試柱狀對比圖，其中1為牛血清白蛋白，2為實(shí)施例四步驟二得到的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末，3為實(shí)施例四中聚合反應(yīng)2h的蛋白質(zhì)基納米粒子，4為實(shí)施例四中聚合反應(yīng)6h的蛋白質(zhì)基納米粒子；

圖5為實(shí)施例六步驟三得到的蛋白質(zhì)基納米粒子的微觀形貌圖。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一種利用光引發(fā)raft聚合原位誘導(dǎo)自組裝制備蛋白質(zhì)基納米粒子的方法具體是按以下步驟進(jìn)行的：

一、pbs緩沖溶液的配制：將nah2po4和na2hpo4混合溶解在去離子水中配制成pbs緩沖溶液；所述nah2po4與na2hpo4的質(zhì)量比為1:(10～12.5)；所述pbs緩沖溶液的濃度為45mmol/l～55mmol/l，ph值為7.4～7.6；

二、制備蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑：將牛血清白蛋白溶解在步驟一得到的pbs緩沖溶液中，得到牛血清白蛋白磷酸緩沖液；將α-端巰基噻唑啉酯活化的raft試劑溶于二甲基亞砜中，得到raft溶液；在磁力攪拌條件下將raft溶液逐滴滴加到牛血清白蛋白磷酸緩沖液中，反應(yīng)10h～24h后透析2d，冷凍干燥，得到蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末；所述牛血清白蛋白磷酸緩沖液的濃度為1.5mg/ml～2.4mg/ml；所述α-端巰基噻唑啉酯活化的raft試劑的質(zhì)量與二甲基亞砜的體積比為1mg:(0.4～5)ml；

三、光引發(fā)raft水相聚合誘導(dǎo)蛋白質(zhì)原位自組裝：將步驟二得到的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末配置成濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液，向濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中依次加入甲基丙烯酸羥丙酯單體和濃度為1mg/ml的氯化三(2,2’-聯(lián)吡啶)釕水溶液，然后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中，除去反應(yīng)器中的氧氣，在可見光led燈的照射下進(jìn)行聚合反應(yīng)1h～12h，得到蛋白質(zhì)基納米粒子；所述甲基丙烯酸羥丙酯單體與濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量比為1:(0.02～0.2)；所述濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量與濃度為1mg/ml的氯化三(2,2’-聯(lián)吡啶)釕水溶液的體積比為1mg:(0.001～0.02)ml。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟一中所述nah2po4與na2hpo4的質(zhì)量比為1:12。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是：步驟一中所述所述pbs緩沖溶液的濃度為50mmol/l。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一或二相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是：步驟二中所述牛血清白蛋白磷酸緩沖液的濃度為2mg/ml。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至三之一相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是：步驟二中所述所述α-端巰基噻唑啉酯活化的raft試劑的質(zhì)量與二甲基亞砜的體積比為1mg:1ml。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至四之一相同。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是：步驟三中將步驟二得到的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末配置成濃度為5mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至五之一相同。

具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至六之一不同的是：步驟三中所述甲基丙烯酸羥丙酯單體與濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量比為1:0.01。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至六之一相同。

具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至七之一不同的是：步驟三中所述甲基丙烯酸羥丙酯單體與濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量比為1:0.1。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至七之一相同。

具體實(shí)施方式九：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至八之一不同的是：步驟三中所述濃度為2mg/ml～10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量與濃度為1mg/ml的氯化三(2,2’-聯(lián)吡啶)釕水溶液的體積比為1mg:0.01ml。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至八之一相同。

具體實(shí)施方式十：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至九之一不同的是：步驟三中在可見光led燈的照射下進(jìn)行聚合反應(yīng)6h。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至九之一相同。

通過以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果

實(shí)施例一：一種利用光引發(fā)raft聚合原位誘導(dǎo)自組裝制備蛋白質(zhì)基納米粒子的方法具體是按以下步驟進(jìn)行的：

一、pbs緩沖溶液的配制：將0.06242gnah2po4和0.75222gna2hpo4混合溶解在50ml去離子水中配制成pbs緩沖溶液；ph值為7.5；

二、制備蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑：將50mg牛血清白蛋白溶解在步驟一得到的pbs緩沖溶液中，得到30ml牛血清白蛋白磷酸緩沖液；將3mgα-端巰基噻唑啉酯活化的raft試劑溶于3ml二甲基亞砜中，得到raft溶液；在磁力攪拌條件下將raft溶液逐滴滴加到牛血清白蛋白磷酸緩沖液中，反應(yīng)20h后透析2d，冷凍干燥，得到蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末；

三、光引發(fā)raft水相聚合誘導(dǎo)蛋白質(zhì)原位自組裝：將10mg步驟二得到的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末配置成濃度為10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液，向濃度為10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中依次加入50mg甲基丙烯酸羥丙酯單體和40μl濃度為1mg/ml的氯化三(2,2’-聯(lián)吡啶)釕水溶液，然后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中，除去反應(yīng)器中的氧氣，在可見光led燈的照射下進(jìn)行聚合反應(yīng)12h，得到蛋白質(zhì)基納米粒子；并通過dls、tem和sem對實(shí)驗(yàn)結(jié)果表征。

實(shí)施例二：本實(shí)施例與實(shí)施例一的不同之處在于：步驟三中將2mg步驟二得到的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末配置成濃度為2mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液。其他與實(shí)施例一相同。

實(shí)施例三：本實(shí)施例與實(shí)施例一的不同之處在于：步驟三中在可見光led燈的照射下進(jìn)行聚合反應(yīng)1h。其他與實(shí)施例一相同。

實(shí)施例四：本實(shí)施例與實(shí)施例一的不同之處在于：步驟三中在可見光led燈的照射下進(jìn)行聚合反應(yīng)6h。其他與實(shí)施例一相同。

實(shí)施例五：本實(shí)施例與實(shí)施例一的不同之處在于：步驟三中向濃度為10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中依次加入100mg甲基丙烯酸羥丙酯單體和40μl濃度為1mg/ml的氯化三(2,2’-聯(lián)吡啶)釕水溶液。其他與實(shí)施例一相同。

實(shí)施例六：本實(shí)施例與實(shí)施例一的不同之處在于：步驟三中向濃度為10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中依次加入150mg甲基丙烯酸羥丙酯單體和40μl濃度為1mg/ml的氯化三(2,2’-聯(lián)吡啶)釕水溶液。其他與實(shí)施例一相同。

實(shí)施例七：本實(shí)施例與實(shí)施例一的不同之處在于：步驟二中將1.5mgα-端巰基噻唑啉酯活化的raft試劑溶于3ml二甲基亞砜中；步驟三中向濃度為10mg/ml的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑水溶液中依次加入50mg甲基丙烯酸羥丙酯單體和20μl濃度為1mg/ml的氯化三(2,2’-聯(lián)吡啶)釕水溶液。其他與實(shí)施例一相同。

上述實(shí)施例中采用法國吉爾森移液槍進(jìn)行溶劑的量取。采用梅特勒-托利多萬分之一精密天平用于藥品的稱取。采用梅特勒-托利多sevencompact系列ph計(jì)用于ph的測量。采用寧波新芝生物科技超聲波清洗機(jī)用于溶質(zhì)的溶解。采用美國珀金埃爾默lambda750s型紫外分光光度計(jì)用于蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的表征。采用日本日本電子jem-1400型透射電子顯微鏡對蛋白質(zhì)納米粒子進(jìn)行形貌觀察。采用日本日立fe-semsu8000型掃描電子顯微鏡對蛋白質(zhì)納米粒子進(jìn)行表征。采用英國馬爾文zetasizernanozsp型動態(tài)光散射系統(tǒng)對蛋白質(zhì)納米粒子尺寸進(jìn)行表征。

圖1為實(shí)施例一步驟二得到的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末的紫外光譜圖；從圖中可以看出raft試劑成功修飾到蛋白質(zhì)表面。設(shè)備為美國珀金埃爾默lambda750s型紫外分光光度計(jì)。

圖2為實(shí)施例一步驟三得到的蛋白質(zhì)基納米粒子的微觀形貌圖；從圖中可以看出蛋白質(zhì)納米粒子的形貌。設(shè)備為在日本電子jem-1400型透射電子顯微鏡。

圖3為實(shí)施例一步驟三得到的蛋白質(zhì)基納米粒子的粒徑分布圖；從圖中可以看出蛋白質(zhì)納米粒子的粒徑為255nm。設(shè)備為英國馬爾文zetasizernanozsp型動態(tài)光散射系統(tǒng)。

圖4為牛血清白蛋白、實(shí)施例四中未進(jìn)行聚合反應(yīng)的蛋白質(zhì)基納米粒子、實(shí)施例四中聚合反應(yīng)2h的蛋白質(zhì)基納米粒子和實(shí)施例四中聚合反應(yīng)6h的蛋白質(zhì)基納米粒子活性測試柱狀對比圖，其中1為牛血清白蛋白，2為實(shí)施例四步驟二得到的蛋白質(zhì)大分子鏈轉(zhuǎn)移劑固體粉末，3為實(shí)施例四中聚合反應(yīng)2h的蛋白質(zhì)基納米粒子，4為實(shí)施例四中聚合反應(yīng)6h的蛋白質(zhì)基納米粒子；從圖中可以看出蛋白質(zhì)納米粒子在聚合之后依然保持了其催化活性。

圖5為實(shí)施例六步驟三得到的蛋白質(zhì)基納米粒子的微觀形貌圖。從圖中可以看出蛋白質(zhì)納米粒子的形貌。設(shè)備為日本日立fe-semsu8000型掃描電子顯微鏡。