本發(fā)明涉及的是一種生物檢測領域的技術，具體是一種基于氧化石墨烯的核酸結合蛋白提取方法。

背景技術：

核酸結合蛋白包括dna結合蛋白和rna結合蛋白，參與調控多種細胞功能，包括dna復制和轉錄，rna加工和翻譯，基因沉默以及端粒長度的維持等。rna結合蛋白可以與rna形成核糖核蛋白復合物進而調控rna的合成和降解，也可以與非編碼rna比如microrna結合調控信使rna(mrna)的轉錄后加工。dna結合蛋白包括核小體蛋白和轉錄因子，在dna復制，轉錄以及修復的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。核酸結合蛋白表達或功能的缺失會導致許多疾病的發(fā)生，比如癌癥和代謝性疾病。由于核酸結合蛋白重要的生物學功能，使得其在細胞內的蛋白質譜以及在不同生理病理條件下的活化狀態(tài)的研究變得尤為重要。

對核酸結合蛋白研究常用的方法包括染色質免疫沉淀，電泳遷移率實驗，染色體捕獲技術，dna或rna親和層析，并應用質譜對核酸結合蛋白進行鑒定。這些方法或以單個或多個基因為中心，研究與其結合的蛋白，或者是以蛋白為中心，研究與其結合的核酸片段。這些技術的特點是專一性高，但是通量低，不能作為核酸結合蛋白組學研究的方法。近幾年發(fā)展了一些以基因為中心的，可以高通量研究dna結合蛋白或者rna結合蛋白的方法。比如，蛋白微陣列芯片技術，通過人工合成并串聯(lián)上百個已被證明可以和蛋白結合的dna片段從細胞裂解液中篩選出dna結合蛋白(huetal.,2009)。mrna免疫共沉淀技術利用可以特異性結合mrna的抗體，通過富集mrna從而鑒定到rna結合蛋白(castelloetal.,2012)(baltzetal.,2012)。這兩種方法雖然可以鑒定到一定量的核酸結合蛋白，但是由于操作復雜，成本高的原因，在核酸結合蛋白質組學研究中的應用有很大的局限性。直到現(xiàn)在仍然沒有一種通用的提取核酸結合蛋白的方法，因此發(fā)展一種簡單高效的核酸結合蛋白提取方法變得尤為必要。

通常情況下，核酸結合蛋白在細胞中的豐度很低，因此對核酸結合蛋白特異性的富集將有助于對其后續(xù)的分析。由于核酸結合蛋白與核酸結合的特性，因此可以通過富集核酸從而提取到核酸結合蛋白。傳統(tǒng)的核酸提取的方法基于苯酚-氯仿體系，在提取過程中會丟失絕大多數(shù)的核酸結合蛋白，因此需要發(fā)展一種在保證核酸結合蛋白不丟失的前提下富集核酸的新方法。

納米材料比如碳納米管，石墨烯和氧化石墨烯由于其出色的力學，熱力及導電性能被廣泛應用于生物醫(yī)學的研究中，比如生物傳感器，藥物載體等。以往的研究表明，納米材料可以通過π-π堆積的作用力穩(wěn)定的吸附單鏈核酸。2012年zhang等人利用碳納米管吸附核酸的特性，從細胞中提取核酸并利用質譜鑒定到2595個蛋白(zhangetal.,2012)，該方法雖然簡單，但是核酸結合蛋白提取的特異性只有24％。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術只能提取核酸，核酸結合蛋白會在提取過程中全部損失，所以無法用來提取核酸結合蛋白的缺陷，提出一種基于氧化石墨烯的核酸結合蛋白提取方法，該方法成本低，操作簡單，提取過程不到1分鐘，可以簡單高效的提取核酸結合蛋白并有助于疾病發(fā)生發(fā)展相關的核酸結合蛋白的研究。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明通過將待測細胞加入含有氧化石墨烯的細胞裂解液中進行裂解，離心收集裂解后得到的氧化石墨烯-核酸-核酸結合蛋白復合物并將其重懸于蛋白變性液中并超聲處理，然后收集上清液中的核酸結合蛋白即得。

所述的待測細胞為所有類型的動物細胞，優(yōu)選為重懸于緩沖液中并緩慢加入細胞裂解液，進一步優(yōu)選為將待測細胞重懸于pbs中為5x10⁶個細胞重懸于20μlpbs。

所述的細胞裂解液，具體為：每裂解5x10⁶個細胞，溶解500μg氧化石墨烯于500μl250mmsds中。

所述的氧化石墨烯尺寸優(yōu)選為小于500nm。

所述的離心收集是指：用移液器吸頭緩慢攪拌充分裂解細胞，離心收集裂解后得到的氧化石墨烯-核酸-核酸結合蛋白復合物，超純水洗復合物3次。

所述的超純水洗是指：在1.5mlep管中用超純水重懸復合物并上下顛倒清洗，不打散復合物。

所述的蛋白變性液為6～8m尿素，10～100mmtris-hcl，ph7.0～8.0。

所述的重懸于蛋白變性液，具體為：300-500μl蛋白變性液重懸復合物于1.5mlep管中。

所述的超聲處理，優(yōu)選為在200w-400w環(huán)境下超聲6～10s。

所述的核酸結合蛋白，其采用但不限于以下方式鑒定得到：采用本發(fā)明的方法提取293t細胞的核酸結合蛋白，并應用lc-msms的方法對核酸結合蛋白進行鑒定。

技術效果

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明可以快速有效的富集到細胞內的核酸包括dna和rna，通過對核酸的富集從而提取核酸結合蛋白，本發(fā)明操作簡單，成本低，耗時短的優(yōu)點，可用于從各種細胞系中提取核酸結合蛋白。更具體來說，本發(fā)明涉及利用納米材料氧化石墨烯可以吸附核酸的屬性，通過富集核酸進而從細胞中富集到核酸結合蛋白。該方法可用于所有動物細胞核酸結合蛋白的提取，結合定量蛋白質組學技術有助于疾病發(fā)生發(fā)展相關的核酸結合蛋白的發(fā)現(xiàn)和研究。

附圖說明

圖1為本方法的流程示意圖；

圖2為氧化石墨烯-核酸-核酸結合蛋白復合物；

圖中：a為氧化石墨烯-核酸-核酸結合蛋白復合物照片；b為共聚焦熒光顯微鏡分析復合物結果，其中dipa為核酸染料；c為三種納米材料羧基化石墨烯cg為，氧化石墨烯go為，羧基化碳納米管ccnt為rna提取效率的比較；其中方法a為本發(fā)明使用的方法，方法b為文獻中使用的方法；氧化石墨烯提取rna的效率最高；d為三種納米材料dna提取效率的比較；氧化石墨烯提取dna的效率最高；e為五種納米材料石墨烯g為，羧基化石墨烯cg為，氧化石墨烯go為，羧基化碳納米管ccnt為，高羧基化碳納米管hccnt為在rna提取效率中的比較，其中氧化石墨烯的對rna提取效率最高；f為用石墨烯，氧化石墨烯和碳納米管分別從5x10⁶個細胞中提取的核酸結合蛋白的質量；

圖3為sds-page并結合蛋白銀染的結果；

圖中：a為全細胞裂解液；b為提取的核酸結合蛋白；c為陰性對照：從經(jīng)過核酸酶處理過后的全細胞裂解液中提取出的蛋白；

圖4為lc-msms對提取的核酸結合蛋白的鑒定結果；

圖中：a為為打散和不打散的方法清洗復合物分別鑒定到的核酸結合蛋白的數(shù)量；b為為蛋白免疫印跡檢測dna結合蛋白組蛋白h3和rna結合蛋白ptbp1分別在全細胞裂解液，提取的核酸結合蛋白，核酸結合蛋白提取后細胞上清液中的含量。

具體實施方式

如圖1所示，本實施例包括以下步驟：

步驟1、將待測細胞加入含有氧化石墨烯的細胞裂解液中進行裂解：

1.1)配制含有氧化石墨烯的細胞裂解液，細胞裂解液成分為250mmsds，根據(jù)所要裂解的細胞的數(shù)量，取相應量的氧化石墨烯并溶解于細胞裂解液中，使其終濃度為1mg/ml，一般5x10⁶個細胞需要500μg氧化石墨烯。

1.2)將細胞重懸于20μlpbs中后緩慢加入到細胞裂解液中裂解細胞，并用移液器吸頭緩慢攪拌充分裂解細胞。

所述的待測細胞為293t細胞系。

1.3)在4℃、20000g環(huán)境下離心5分鐘，棄上清。

1.4)收集氧化石墨烯-核酸-核酸結合蛋白復合物，如圖2a所示，并用超純水上下顛倒洗復合物3次，不打散復合物。其結果如圖2b所示，核酸被氧化石墨烯所吸附。

到目前為止，仍然沒有通用的核酸結合蛋白提取方法。碳納米管已被報道可以用于核酸結合蛋白的提取(zhangetal.,2012)，與碳納米管相比，氧化石墨烯可以吸附更多的dna和rna，如圖2c-2e所示。相同細胞數(shù)目下提取得到的核酸結合蛋白的量是碳納米管的4倍，如圖2f所示。因此，氧化石墨烯更適于核酸結合蛋白的提取。

步驟2、核酸結合蛋白的提?。?/p>

2.1)復合物水洗后重懸于蛋白變性液中，400w超聲10s使核酸及核酸結合蛋白從氧化石墨烯上脫附。

2.2)在4℃、20000g離心60分鐘，收集上清；

2.3)使用3k超濾管置換蛋白變性液為超純水，并濃縮體積到100μl。

2.4)bca法測蛋白濃度后，取2μg蛋白進行sds-page分析。其結果如圖3所示，表明本發(fā)明提取核酸結合蛋白特異性高。

步驟3、核酸結合蛋白的表征：

3.1)用本發(fā)明的技術從293t細胞中提取核酸結合蛋白，取30μg蛋白進行溶液內酶解。

3.2)采用q-exactiveorbitraplc-msms對所提取到的蛋白進行鑒定，共鑒定到2563個蛋白。

用蛋白免疫印跡技術檢驗了dna結合蛋白組蛋白h3，rna結合蛋白ptbp1能夠被本發(fā)明所發(fā)展的方法特異性的富集。結果如圖4所示，證明了本發(fā)明方法可以從細胞中高效，特異的富集核酸結合蛋白。

上述具體實施可由本領域技術人員在不背離本發(fā)明原理和宗旨的前提下以不同的方式對其進行局部調整，本發(fā)明的保護范圍以權利要求書為準且不由上述具體實施所限，在其范圍內的各個實現(xiàn)方案均受本發(fā)明之約束。