本發(fā)明涉及一種l-半胱氨酸熒光探針制備方法，屬于探針的制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

l-半胱氨酸是一種具有生理功能，在自然界中廣泛存在的重要物質(zhì)，它在動植物體內(nèi)是各組織細胞用來防御有害物質(zhì)和增加活力的一種氨基酸，也是組成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸之一，并且是唯一具有活性巰基（-sh）的氨基酸。l-半胱氨酸是乙酰輔酶、牛磺酸和還原谷胱甘肽的前體，同時還能與鐵離子形成硫鐵化合物。目前，研究表明，人體中半胱氨酸濃度的升高是引起心血管疾病及中風的重要因素，還會導致認知功能障礙，嚴重的會導致阿爾茨海默氏病。因此，發(fā)明一種能方便檢測生理環(huán)境中l(wèi)-半胱氨酸的方法具有重要的現(xiàn)實意義。

目前常用的l-半胱氨酸的方法主要有以下幾種，如：電化學檢測法、高效液相色譜法，分光光度法、電化學檢測法，這些方法只能檢測l-半胱氨酸的總量，并且樣品需求量大、檢測時間長，而且會對樣品造成破壞，因此并不適于生物環(huán)境的l-半胱氨酸的檢測。因此，探索方便廉價、能夠定性定量檢測l-半胱氨酸，并且可以對生物樣品進行實時檢測的方法非常重要。當有機熒光探針與特定目標物發(fā)生變化后，其熒光信號會發(fā)生變化，以達到檢測的目的。熒光分析法具有出限低、靈敏度高、選擇性好、取樣量少、方法簡潔快速等特征，并且可以對細胞內(nèi)目標分子進行非侵入性成像檢測可以實時在線，形象具體地觀察到信號變化。所以，發(fā)明能快速檢測、易觀查信號變化的l-半胱氨酸熒光探針是非常有必要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種能快速檢測l-半胱氨酸的比值型熒光探針，簡稱探針4；本發(fā)明進一步提供了探針4的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種l-半胱氨酸熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如下：

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本發(fā)明的l-半胱氨酸熒光探針，能抗丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、溴離子、醋酸根、銅離子、谷氨酸、還原谷胱甘肽、硫化氫、高半胱氨酸、組氨酸、異亮氨酸、鈉離子、硝酸根、苯丙氨酸、磷酸根、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、單線態(tài)氧、過氧化叔丁醇、過氧化叔丁基、抗壞血酸的干擾，特異性好。

上述的l-半胱氨酸熒光探針的合成路線如下：

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化合物4即為l-半胱氨酸熒光探針。

上述的l-半胱氨酸熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

1）將二乙胺基香豆素置于圓底燒瓶中，隨后加入1-boc哌嗪，1-羥基苯并三唑（hobt），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（edci），用二氯甲烷溶解，在常溫下攪拌4小時，然后除去反應液中的二氯甲烷得到化合物2。

2）將化合物1用體積比為1:1的二氯甲烷與三氟乙酸的混合溶液溶解，常溫下攪拌0.5小時，然后除去反應液中的二氯甲烷和三氟乙酸得到化合物3。

3）將化合物2和nbd-磺酰氯置于圓底燒瓶中，用二氯甲烷溶解，隨后滴加一滴三乙胺，在常溫下攪拌1小時，然后除去反應液中的二氯甲烷，得到探針4。

上述制備方法，優(yōu)選的，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去反應液中的二氯甲烷；步驟2在使用化合物1之前，可以用硅膠層析柱進一步純化；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去反應液中的二氯甲烷和三氟乙酸；所得化合物2，可以用硅膠層析柱進一步純化；三乙胺的加入方式為滴加；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去反應液中的二氯甲烷；所得探針4，可以用硅膠層析柱進一步純化。

本發(fā)明的上述l-半胱氨酸熒光探針用于檢測l-半胱氨酸。包括用于檢測水環(huán)境中的l-半胱氨酸和生物樣品的l-半胱氨酸。

上述應用，具體的，包括：

觀察加入l-半胱氨酸熒光探針前后待測水環(huán)境的熒光光譜的變化；熒光激發(fā)波長為450nm；或者，在365nm光源照射下，用肉眼觀察加入l-半胱氨酸熒光探針前后待測水環(huán)境的熒光變化；或者，觀察加入l-半胱氨酸熒光探針前后待測生物環(huán)境的熒光成像圖的變化。

所述生物環(huán)境，可以是活細胞。

所述熒光光譜的變化是指：熒光光譜中，580nm處和481nm處的熒光峰值的變化；如果580nm處峰值升高，481nm處峰值降低，則說明含有l(wèi)-半胱氨酸。優(yōu)選的，采用熒光光譜儀觀察熒光光譜。

所述熒光變化是指：在365nm光源照射下，熒光明顯增強。

所述熒光成像圖的變化是指：將探針母液加入到生物樣品中，用共聚焦顯微鏡，使用激發(fā)波長為405nm的光源激發(fā)，收集藍色和綠色通道的熒光；觀察到藍色通道熒光減弱，同時綠色通道熒光增強，則說明含有l(wèi)-半胱氨酸。優(yōu)選的，采用共聚焦顯微鏡。

上述應用，具體的，包括以下步驟：

（1）將探針4溶于dmf，制成探針母液；

（2）將探針母液加入到待測液中；

用熒光光譜儀測試待測液的熒光光譜，在580nm處和481nm處的熒光峰值的變化，如果580nm處峰值變大，481nm處峰值降低，則說明含有l(wèi)-半胱氨酸；其中，熒光光譜儀激發(fā)波長為450nm；或者，在365nm光源照射下，待測液的熒光由藍色變?yōu)榫G色，則說明含有l(wèi)-半胱氨酸；

（3）將探針母液加入到生物樣品中，用共聚焦顯微鏡，使用激發(fā)波長為405nm的光源激發(fā)，收集藍色和綠色通道的熒光；觀察到藍色通道熒光減弱，同時綠色通道熒光增強，則說明含有l(wèi)-半胱氨酸。

首先，水溶液中的l-半胱氨酸可以引起熒光探針的熒光光譜變化，因此，可以通過觀察熒光光譜儀中光譜的變化程度判斷溶液中的l-半胱氨酸含量，從而定量檢測；其檢測下限為1.4×10^-6mol/l。其次，通過共聚焦顯微鏡對孵育了熒光探針4和l-半胱氨酸的活細胞進行熒光成像，觀察藍色和綠色通道熒光信號的變化以達到比值檢測生物環(huán)境中的l-半胱氨酸的目的。

本發(fā)明的優(yōu)點：（1）探針合成簡單，并且產(chǎn)率較高；（2）本發(fā)明實現(xiàn)了水溶液中l(wèi)-半胱氨酸的特異性和快速檢測；（3）本發(fā)明實現(xiàn)了活細胞水平中l(wèi)-半胱氨酸的檢測。

附圖說明

圖1是實施例1中探針4的¹hnmr圖譜；

圖2是實施例1中探針4的¹³cnmr圖譜；

圖3是實施例2中探針4隨不同量l-半胱氨酸的加入熒光譜圖的變化情況；圖中，從下至上，l-半胱氨酸濃度依次為0、10、20、30、50、70、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800和1000μmol/l的熒光光譜；

圖4是肉眼觀察到探針4（10μmol/l）在pbs緩沖溶液（濃度25mmol/l，ph7.4，含20%dmf）與100當量l-半胱氨酸在便攜式紫外燈365nm光源照射條件下的變化。

圖5是實施例3中探針4與l-半胱氨酸隨時間變化的481nm和580nm處熒光強度值變化圖；

圖6是實施例4中探針4對不同干擾分析物的選擇性柱狀熒光數(shù)據(jù)圖；圖中，1，空白2，丙氨酸3，精氨酸,4，天冬氨酸5，溴離子6，醋酸根7，銅離子8，谷氨酸9，還原谷胱甘肽10，硫化氫11，高半胱氨酸12，組氨酸13，異亮氨酸14，鈉離子15，硝酸根16，苯丙氨酸17，磷酸根18，絲氨酸19，蘇氨酸20，纈氨酸21，單線態(tài)氧22，過氧化叔丁醇23，過氧化叔丁基24，抗壞血酸。

圖7是實施例5中探針4與hela細胞中l(wèi)-半胱氨酸響應的熒光成像圖；圖中，(a)是加入探針4孵育45分鐘后的成像，(b-d)是先分別加入50、100和250μmol/l孵育30分鐘，隨后加入探針4繼續(xù)培育45分鐘后的成像。第一列為明場成像和藍色與綠色通道熒光成像的重疊圖；第二列為藍色通道成像；第三列為綠色通道成像；第四列綠色通道成像與藍色通道成像的比率圖；激發(fā)波長為405nm；標尺為20微米。

具體實施方式

實施例1化合物2的合成：

取二乙胺基香豆素酸370mg(1.4mmol)置于圓底燒瓶，加入408mg（2.1mmol）1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽(edci)，479mg（3.5mmol）1-羥基苯并三唑（hobt），264mg（1.4mmol）t-boc哌嗪，用二氯甲烷溶解，在常溫下攪拌4小時，反應完畢。反應完畢后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾將溶劑（二氯甲烷）除去得到粗產(chǎn)品。以體積比為1:3的乙酸乙酯與石油醚為洗脫劑，用硅膠（200-300目）層析柱進行純化，得到487mg淡黃色色固體（產(chǎn)率為81.1%）。

化合物3的合成：

稱取86mg（0.2mmol）化合物2,用體積比為1:1的二氯甲烷和三氟乙酸溶解，在常溫下攪拌0.5小時，反應完畢。反應完畢后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾將溶劑（二氯甲烷與三氟乙酸）除去得到化合物3，無需純化。

探針4的合成

取33mg(0.1mmol)化合物3置于圓底燒瓶中，加入25mg（0.1mmol）nbd-磺酰氯，用二氯甲烷溶解，滴加一滴三乙胺，在常溫下攪拌1小時，反應完畢。反應完畢后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾將溶劑（二氯甲烷）除去得到探針4。最后以體積比為70:1的二氯甲烷與甲醇為洗脫劑，用硅膠（200-300目）層析柱進行純化，得到40mg黃色固體（產(chǎn)率73.2%）。圖1是其¹hnmr圖譜；圖2是其¹³cnmr圖譜；¹hnmr(400mhz,cdcl3),(ppm):1.21-1.24(t,j=6.8hz,6h),3.41-3.49(m,10h),3.84(2h),6.47(s,1),6.61-6.63(d,j=7.2hz,1h),7.28-7.31(d,j=8.8hz,1h),7.56-7.58(d,j=7.2hz,1h),7.86(s,1h),7.95-7.97(d,j=7.2hz,1h);¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ(ppm):42.16,45.11,45.84,46.15,47.30,96.99,107.82,109.68,115.02,125.88,128.33,129.14,130.08,134.54,145.53,146.17,148.87,151.89,157.37,159.24,165.22。

實施例2

探針4與不同當量l-半胱氨酸反應的熒光光譜變化

取實施例1制備的探針4溶于dmf中，制成濃度為1mmol/l探針母液（探針4的濃度為1mmol/l）；將l-半胱氨酸用蒸餾水配制成100mm、50mm、10mm、1mm的溶液。從探針母液中取出30μl加入到5ml的離心管當中，加入不同當量（0-60eq）的l-半胱氨酸母液（所述當量是指l-半胱氨酸母液中l(wèi)-半胱氨酸的摩爾數(shù)相對于探針母液中探針的摩爾數(shù)的倍數(shù)），用0.570mldmf和不同體積的pbs水溶液（濃度25mmol/l，ph7.4）稀釋至3ml，配置成探針濃度為10μmol/l，含20%dmf的測試溶液。用熒光光譜儀測試探針與不同當量l-半胱氨酸反應液的熒光光譜變化（激發(fā)波長為450nm），熒光光譜變化情況如圖3所示。由圖3可見，隨著加入當量的l-半胱氨酸逐漸增加，探針4溶液在580nm處的熒光峰值逐漸增強，481nm處的熒光峰值逐漸降低。如圖4所示，在便攜式紫外燈照射下（356nm光源）熒光由藍色變?yōu)辄S色。

實施例3

探針4與l-半胱氨酸隨時間變化的熒光變化

從實施例2中熒光探針母液中取出30μl加入到5ml的離心管當中，加入30μl濃度為1mmol/l的l-半胱氨酸母液，再0.570mldmf和2.400ml的pbs水溶液（濃度25mmol/l，ph7.4）稀釋至3ml，配制成探針濃度為10μmol/l，l-半胱氨酸濃度為0.6mmol/l，含20%dmf的測試溶液。用450nm的激發(fā)波長，測試其隨時間變化的熒光光譜。由圖5可見，隨著時間增加，580nm處熒光強度增加，481nm處熒光強度減弱。

實施例4

探針4對不同干擾分析物的選擇性研究

從實施例2中熒光探針母液中取出30μl加入到5ml的離心管當中，分別加入濃度為100mm的分析物：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、溴離子、醋酸根、銅離子、谷氨酸、還原谷胱甘肽、硫化氫、高半胱氨酸、組氨酸、異亮氨酸、鈉離子、硝酸根、苯丙氨酸、磷酸根、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、單線態(tài)氧、過氧化叔丁醇、過氧化叔丁基、抗壞血酸,用0.570mldmf和2.400ml的pbs水溶液（濃度25mmol/l，ph7.4）稀釋至3ml，配置成探針濃度為10μmol/l，含20%dmf的測試溶液。反應5分鐘后檢測測試液的熒光光譜變化。由圖6可以發(fā)現(xiàn)，相對于空白測試液，各種分析物的測試液熒光強度均沒有明顯變化。然而，加入l-半胱氨酸的測試液的熒光強度發(fā)生了顯著增強。實驗結(jié)果說明探針4對l-半胱氨酸具有良好的選擇性。

實施例5

探針4與細胞中l(wèi)-半胱氨酸的熒光成像研究

從實施例2中熒光探針母液中取出5μl加入到育有hela細胞的培養(yǎng)皿（含1mlpbs培養(yǎng)基）中，探針濃度為5μmol/l，孵育20分鐘，作為控制組；在其中一組控制組樣品中分別加入50，100，250μmol/l的l-半胱氨酸，繼續(xù)孵育60分鐘，作為實驗組。隨后分別用共聚焦顯微鏡對控制組和實驗組進行熒光成像，使用激發(fā)波長為405nm的光源激發(fā)，分別收集藍色和綠色通道的熒光，結(jié)果如圖7所示。在控制組的熒光成像中，只能觀察到藍色通道熒光和非常微弱的綠色熒光；然而，在實驗組中，隨著加入l-半胱氨酸濃度的增加，可以觀察到明顯的藍色通道熒光逐漸減弱，同時綠色通道熒光顯著增強。實驗結(jié)果說明探針4可以通過共聚焦顯微鏡檢測細胞環(huán)境中的l-半胱氨酸，具有潛在的實際應用價值。