本發(fā)明涉及抗高血壓藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞離子通道復(fù)合體trpv4-kca2.3空間耦聯(lián)度的化合物在抑制高血壓中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)發(fā)布的《2014-2019年中國抗高血壓藥物市場運(yùn)營監(jiān)測與發(fā)展前景研究報告》指出：高血壓是一個終身疾病，一般病人需要終身每天服藥。高血壓藥物發(fā)展經(jīng)歷了幾個時代，60年代推出利尿劑，70年代推出β-受體阻滯劑，80年代推出鈣通道拮抗劑和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(acei)等，90年代又開發(fā)出更具有特異性的血管緊張素ii受體拮抗劑(沙坦類)，之后相繼有多個單方和復(fù)方制劑獲美國fda批準(zhǔn)上市，成為高血壓治療的一線藥物。

抗高血壓單藥發(fā)展相對成熟，根據(jù)機(jī)理大致可分為五類：

(1)利尿劑：如氫氯噻嗪、布美他尼、吲達(dá)帕胺及利尿劑類復(fù)方制劑等；

(2)鈣離子通道拮抗劑：如硝苯地平、氨氯地平、地爾硫卓、維拉帕米等；

(3)β受體阻滯劑：如普萘洛爾、阿替洛爾、美托洛爾、拉貝洛爾等；

(4)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑：如卡托普利、依那普利、貝那普利、賴諾普利等；

(5)血管緊張素ii受體拮抗劑：如氯沙坦、纈沙坦、替米沙坦、奧美沙坦等。

不同機(jī)制的高血壓藥品因?yàn)槠渥饔冒悬c(diǎn)的差異，均有各自的優(yōu)劣勢，在高血壓治療中需要選擇適合病人的藥品，大部分患者在一種藥物達(dá)不到治療效果后，往往采取聯(lián)合治療的方式。

瞬時感受器電位離子通道香草素受體家族4(ransientreceptorpotentialvanilloid4，trpv4)是trp通道香草素受體亞家族的成員，是一種非選擇性陽離子通道。trpv4通道具有六個跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域，分別為s1-s6，在s5和s6之間有一個調(diào)控離子通過的孔環(huán)區(qū)域，其n末端和c末端均在細(xì)胞內(nèi)。trpv4通道在信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用必須形成功能性的同聚或異聚四聚體方可發(fā)揮作用。trpv4通道的n末端包含至少三個錨蛋白結(jié)合部位，錨蛋白可以與trpv4通道相互作用，可以抑制ip3受體從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ca²⁺的釋放。trpv4通道具有非常高的ca2⁺通透性，大量表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，其作為ca²⁺通道，參與內(nèi)皮細(xì)胞的信號傳導(dǎo)。

小電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道skca分為三類kca2.1、kca2.2、kca2.3，其中kca2.3主要表達(dá)分布在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞其中，kca2.3在人體的生理活動中起重要的作用，尤其是在平滑肌的松弛過程中。kca2.3的持續(xù)激活導(dǎo)致了血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜電位持續(xù)超級化，然后連接到附近的平滑肌。阻斷或抑制kca2.3會大大增加血管阻力，產(chǎn)生血管外周阻力，增加血壓。

研究表明trpv4和kca2.3在血管內(nèi)皮細(xì)胞上存在物理相互作用，ca²⁺通過trp通道進(jìn)入細(xì)胞激活這些鉀離子通道，然后引起血管的舒張。但是，其具體的相互作用位點(diǎn)仍未研究清楚，通過尋找其相互作用位點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)作用于其位點(diǎn)的化合物對于高血壓藥物的研發(fā)具有重大的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請人提供了一種增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞離子通道復(fù)合體trpv4-kca2.3空間耦聯(lián)度的化合物抑制高血壓的應(yīng)用。本發(fā)明通過尋找內(nèi)皮細(xì)胞離子通道復(fù)合體trpv4-kca2.3的相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域，制備了能同時作用于這兩個作用位點(diǎn)的特異性化合物，發(fā)現(xiàn)該化合物能增強(qiáng)trpv4-kca2.3復(fù)合體的空間耦聯(lián)度，并對高血壓藥物的研發(fā)具有重大的意義。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本申請人提供了一種增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞離子通道復(fù)合體trpv4-kca2.3空間耦聯(lián)度的化合物，所述內(nèi)皮細(xì)胞離子通道復(fù)合體trpv4-kca2.3的相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域?yàn)閠rpv4蛋白的ar2結(jié)構(gòu)域及kca2.3蛋白的17c結(jié)構(gòu)域，所述化合物為通式(1)所示化合物，該化合物編號為jnc-440：

所述的增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞離子通道復(fù)合體trpv4-kca2.3空間耦聯(lián)度的化合物的制備方法具體步驟如下：

(1)丙二胺首先經(jīng)叔丁氧羰基保護(hù)單個氨基：

(2)將另一裸露的氨基與二苯基乙酰氯成酰胺：

(3)酰胺產(chǎn)物在酸性條件下脫除叔丁氧羰基保護(hù)：

(4)脫除氨基保護(hù)的化合物再與4-喹唑啉酮-2-甲酸乙酯發(fā)生胺酯交換得到目的化合物：

本申請人還提供了所述的化合物的應(yīng)用，所述化合物能作用于trpv4和kca2.3相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域，從而增強(qiáng)復(fù)合體trpv4-kca2.3的空間耦聯(lián)度。

本申請人還提供了另一種所述的化合物的應(yīng)用，所述化合物能抑制高血壓。

本申請人還提供了所述的內(nèi)皮細(xì)胞離子通道復(fù)合體trpv4-kca2.3的相互作用位點(diǎn)的trpv4蛋白的ar2結(jié)構(gòu)域及kca2.3蛋白的17c結(jié)構(gòu)域在抑制高血壓中的應(yīng)用。

本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：

本發(fā)明首先通過結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)突變的方法尋找trpv4蛋白和kca2.3蛋白的相互作用位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域，然后篩選能增強(qiáng)trpv4-kca2.3復(fù)合體空間耦聯(lián)度的化合物，并研發(fā)新的制備該化合物的方法，最后將該化合物作用于高血壓小鼠模型，檢測其對高血壓的療效。

經(jīng)本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，trpv4的結(jié)構(gòu)域ar2和kca2.3的結(jié)構(gòu)域17c是其相互作用的作用位點(diǎn)，制備同時作用于這兩個作用位點(diǎn)的化合物，通過作用高血壓小鼠模型發(fā)現(xiàn)該化合物通過增強(qiáng)trpv4-kca2.3復(fù)合體空間耦聯(lián)度從而起到抑制高血壓的效果。本發(fā)明對于高血壓藥物的研發(fā)具有重大的意義。

附圖說明

圖1為trpv4蛋白和kca2.3蛋白的三維結(jié)構(gòu)及其功能區(qū)域簡圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)尋找trpv4蛋白和kca2.3蛋白相互作用位點(diǎn)的結(jié)果圖；

圖3為實(shí)施例1制備的化合物的雙靶點(diǎn)免疫共沉淀結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)檢測實(shí)施例1制備的化合物作用于高血壓小鼠模型后trpv4-kca2.3復(fù)合體耦聯(lián)度變化的結(jié)果圖；

圖5為實(shí)施例1制備的化合物作用于三種高血壓小鼠模型后，檢測其血壓變化的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

以下實(shí)施例所使用實(shí)驗(yàn)材料如下：

細(xì)胞系：hek293細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

實(shí)驗(yàn)動物：8周齡c57bl/6j雄性小鼠，spf級，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

質(zhì)粒和引物：含cfp-trpv4全基因或yfp-kca2.3全基因的質(zhì)粒模板由香港中文大學(xué)羅桂祥生物醫(yī)學(xué)院贈送；引物均購自上海生工生物工程有限公司

短肽：

ar2：ygrkkrrqrrrtgktclpkallnlsngrndtipvlldiaertgnmrefinspfrdiyy；

17c：ygrkkrrqrrrrkleltkaekhvhnfmm均購自上海生工生物工程有限公司。

試劑：一抗goatanti-trpv4(sc-47527),購自santacruz公司；一抗rabbitanti-kca2.3(apc-025),購自alomone公司；二抗alexafluor647和alexafluor488購自invitrogen公司。

點(diǎn)突變試劑盒quickchangetm購自stratagene公司；dna產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；dh5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生化科技有限公司；

生物素化jnc-440合成步驟如下：

(1)化合物jnc-440在三氯氧磷的作用下得到羰基的氯化產(chǎn)物：

(2)氯代產(chǎn)物與5-氨基-1-戊醇發(fā)生親核取代反應(yīng)：

(3)生物素與上一步的產(chǎn)物發(fā)生酯化反應(yīng)得到生物素化的jnc-440：

8％高鹽飼料(tp6032-s8)購自南通特洛菲飼料科技有限公司；l-name(nitro-l-arginine)(n5501-5g)購自sigma公司；血管緊張素2(ang-2)(a107852)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

其它所有化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：大小鼠血壓測量儀(bp98a)，購自sinsi公司；osmoticpumps(植入式膠囊滲透壓泵)購自alzet公司；凝膠成像系統(tǒng)購自gene公司；激光共聚焦顯微鏡購自leica公司；

實(shí)施例1：化合物的制備方法

(1)將化合物1-丙烯二胺(30g,405mmol,1eq)溶解于150ml二氯甲烷中，冰浴攪拌；將2-叔丁基碳酸氫鈉(16.1g,73mmol,0.18eq)溶解并稀釋于50ml二氯甲烷中；將混合物緩慢倒入燒瓶中，室溫攪拌3小時；反應(yīng)完全后用薄層色譜法(tlc)檢測，用50ml二氯甲烷稀釋并用水洗滌數(shù)次，再用飽和nacl溶液洗滌，之后用無水na2so4進(jìn)行干燥，濃縮后獲得化合物2(19g,27％)；

(2)化合物2(10g,57mmol,1eq)和三乙胺(tea)(8.7g，86mmol,1.5eq)溶解于100ml二氯甲烷并于冰浴攪拌；二苯基乙酰氯(13.1g,57mmol,1eq)溶解于30ml二氯甲烷中，并緩慢倒入燒瓶內(nèi)，室溫攪拌2.5小時；反應(yīng)完全后使用tlc檢測，進(jìn)行粗制品濃縮；柱層析法分離(20:1二氯甲烷/甲醇)獲得化合物3(13.2g,63％)；

(3)化合物3(8g,22mmol,1eq)溶解于混合溶劑中(40ml：二氯甲烷：三氟乙酸＝4:1)，混合物油浴加熱至35℃，1小時；完全反應(yīng)后使用tlc檢測，用氨水調(diào)節(jié)體系ph至8-9，直至產(chǎn)生固體沉淀；過濾干燥后獲得化合物4(5.3g,90％)；

(4)將化合物4(2g,7mmol,2eq)和4-喹唑啉酮-2-甲酸乙酯(0.8g,3.5mmol,1eq)溶解于6ml乙醇中，置于微波反應(yīng)器中100℃反應(yīng)45分鐘；完全反應(yīng)后tlc檢測，自然冷卻溶液獲得白色固體沉淀，過濾干燥后獲得化合物5。該化合物5即本發(fā)明所述的作用于高血壓的化合物。

實(shí)施例2：尋找trpv4蛋白和kca2.3蛋白相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域

實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)trpv4蛋白和kca2.3蛋白的三維結(jié)構(gòu)及其功能特點(diǎn)選擇可能的結(jié)合位點(diǎn)(如圖1所示)，所選擇的結(jié)構(gòu)域均主要用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，是蛋白質(zhì)交互的平臺。突變所選擇的結(jié)合位點(diǎn)，使結(jié)合位點(diǎn)缺失，所用引物如表1所示。

表1

所用pcr反應(yīng)體系為：模板(cfp-trpv4全基因或yfp-kca2.3全基因)0.5μl，primstarhs25μl，上下游引物各0.5μl，加h2o補(bǔ)足至50μl。pcr反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃2min，變性95℃30s，退火55℃30s，延伸68℃5min，循環(huán)30次，充分延伸68℃10min。pcr結(jié)束后用pcr產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，純化后產(chǎn)物用dpni酶進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為：dpni酶0.4μl,pcr純化產(chǎn)物5μl,10×buffer2μl,ddh2o12.6μl。酶切條件為37℃1h，滅活條件為80℃，20min。將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5a感受態(tài)細(xì)胞，將篩選出的單克隆細(xì)胞擴(kuò)培后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送樣進(jìn)行基因測序。

將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞鋪共聚焦小皿，24小時后通過激光共聚焦顯微鏡的fretab模式檢測突變前后兩種蛋白的耦聯(lián)情況。

按照上述基因突變的方法構(gòu)建trpv4-△ar2h和kca2.3△17c質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞中，24小時后細(xì)胞用含有3％多聚甲醛和0.1％戊二醛的pbs溶液固定，然后用pbs稀釋的0.1％硼氫化鈉清洗。細(xì)胞在封閉液(在pbs中加入3％bsa和0.2％tritonx-100)中經(jīng)過封閉、滲透化處理，用一抗4度孵育過夜后，清洗三次，然后在室溫下用二抗孵育45分鐘。使用goatanti-trpv4和rabbitanti-kca2.3作為一抗，二抗是alexafluor647和alexafluor488。同時通過隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(storm)將兩種蛋白共定位，從而進(jìn)一步驗(yàn)證fret結(jié)果的準(zhǔn)確性。同上方法制備樣品，在干凈的共聚焦小皿中心處加入大約4μl的成像緩沖液，緩沖液中包含了5％(w/v)葡萄糖，100mm半胱胺酸，0.8mg/ml葡糖氧化酶和40μg/ml過氧化氫酶，溶解在ph為7.5或8的tris-hcl。在該storm成像緩沖液中呈現(xiàn)光譜分辨單分子圖像。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖2a顯示，與其它突變位點(diǎn)相比，突變trpv4的ar2結(jié)構(gòu)域或kca2.3的17c結(jié)構(gòu)域時，fret現(xiàn)象均明顯下降。圖2b的超高清成像實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。表明trpv4的結(jié)構(gòu)域ar2和kca2.3的結(jié)構(gòu)域17c為兩個蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

圖2a中由藍(lán)色-綠色-黃色-紅色，fret效率依次升高。

圖2b中紅色表示trpv4蛋白，綠色表示kca2.3蛋白，黃色表示綠色和紅色重疊。

實(shí)施例3：實(shí)施例1所制備的化合物以trpv4的結(jié)構(gòu)域ar2和kca2.3的結(jié)構(gòu)域17c為靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法：

原代分離c57bl/6j老鼠腸系膜內(nèi)皮細(xì)胞，置于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，加入生物素化jnc-440(10μm/l)或者短肽和生物素化jnc-440(10μm/l)，與細(xì)胞共培養(yǎng)96小時。用ripa裂解得到細(xì)胞蛋白，蛋白上清加入10μl鏈霉親和素化磁珠，4℃孵育過夜。用磁力架吸附孵育后的懸液，得到親和素化磁珠-生物素化jnc-440-蛋白復(fù)合物。用50μl1xloadingbuffer重懸復(fù)合物，沸水浴煮沸5分鐘。樣品通過sds-page進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移蛋白至pvdf膜上，5％bsa室溫封閉4h，一抗4度孵育過夜，二抗室溫孵育2h，加入ecl顯色劑，用蛋白成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3顯示，生物素化jnc-440能結(jié)合trpv4及kca2.3蛋白；當(dāng)加入短肽ar2后，生物素化jnc-440結(jié)合trpv4蛋白能力顯著下降。另一方面，相比對照組，當(dāng)加入短肽17c后，生物素化jnc-440結(jié)合kca2.3蛋白能力顯著下降。結(jié)果提示生物素化jnc-440能結(jié)合trpv4和kca2.3，并且結(jié)合區(qū)域?yàn)閍r2及17c。

實(shí)施例4：實(shí)施例1所制備的化合物能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞離子通道復(fù)合體trpv4-kca2.3的空間耦聯(lián)度

實(shí)驗(yàn)方法：

選用8周齡雄性c57bl/6j小鼠，自由飲食預(yù)適應(yīng)一周后，分四組，分別是8％高鹽組、l-name組、ang-2組和對照組。先對4組小鼠進(jìn)行基礎(chǔ)血壓測量，確定小鼠血壓基線。對照組條件不改變，每天測量血壓；高鹽組飼喂8％高鹽飼料，后每天測量血壓；l-name組飲用5％的l-name溶液，后每天測量血壓；ang-2組先4％水合氯醛進(jìn)行麻醉，通過背部埋泵對小鼠進(jìn)行手術(shù)，每個泵注射2.88mg/mlang-2溶液200ul，埋入后縫合待痊愈，約3天后開始測量血壓持續(xù)測量約4周。高鹽組血壓穩(wěn)定在120mmhg，l-name和ang-2組血壓穩(wěn)定在130mmhg左右，持續(xù)一周左右，血壓不再上升即可認(rèn)為建模成功。

原代分離高血壓模型老鼠的腸系膜內(nèi)皮細(xì)胞，置于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，加入jnc-440(10μm)，與細(xì)胞共培養(yǎng)96小時。根據(jù)實(shí)施例2所述的免疫染色方法進(jìn)行染色，然后通過激光共聚焦顯微鏡的fretab模式檢測突變前后兩種蛋白的耦聯(lián)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖4所示，化合物作用于三種不同的的高血壓小鼠模型的內(nèi)皮細(xì)胞后，trpv4和kca2.3蛋白的空間耦聯(lián)度發(fā)生了明顯的提高。表明此化合物能增強(qiáng)離子通道復(fù)合體trpv4-kca2.3的空間耦聯(lián)度。

實(shí)施例5：實(shí)施例1所制備的化合物對三種高血壓模型小鼠的影響

實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)實(shí)施例4所述的方法構(gòu)建3種高血壓老鼠模型。建模成功后，通過尾靜脈注射jnc-440(1mg/kg)，后對小鼠血壓進(jìn)行測量觀察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖5所示，化合物作用于三種不同的的高血壓小鼠模型后，其血壓發(fā)生了明顯下降，說明該化合物對該高血壓模型有明顯的降壓作用。