本發(fā)明涉及一種抑制蕓苔屬植物花柱nadph氧化酶基因表達(dá)的方法，涉及互補(bǔ)核苷酸鏈的設(shè)計(jì)與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

nadph氧化酶基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄翻譯以后形成nadph氧化酶。nadph氧化酶位于質(zhì)膜上，是一類以生成活性氧類物質(zhì)為主要功能的酶類。它可以將電子轉(zhuǎn)移給氧氣分子，使其形成轉(zhuǎn)變成超氧陰離子，進(jìn)一步形成羥基自由基、過氧化氫自由基等一類活性氧族。由于細(xì)胞存在的氧化應(yīng)激反應(yīng)，活性氧族濃度的高低可以調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡。

目前，已知沉默基因表達(dá)的方式主要是rna干擾、基因敲除、激活目的基因的抑制基因等。但是這些方法的實(shí)驗(yàn)成本比較高，周期比較長，對(duì)技術(shù)的要求高，部分方式的靶向性比較差，實(shí)驗(yàn)效果不能盡如人意。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種抑制蕓苔屬植物花柱nadph氧化酶基因表達(dá)的方法，利用互補(bǔ)核苷酸鏈抑制nadph氧化酶基因表達(dá)，nadph氧化酶基因(genbank登陸號(hào)：xm_009114548.2)。

通過提取經(jīng)互補(bǔ)核苷酸鏈處理過的蕓苔屬植物柱頭的rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna后，利用熒光定量pcr測(cè)定其nadph氧化酶的表達(dá)量。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種抑制蕓苔屬植物花柱nadph氧化酶基因表達(dá)的方法，包含以下步驟：

1)互補(bǔ)核苷酸鏈和引物合成：根據(jù)目的基因的序列，設(shè)計(jì)熒光定量pcr引物；并根據(jù)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，在其莖環(huán)處設(shè)計(jì)一段互補(bǔ)核苷酸鏈；所述目的基因?yàn)閚adph氧化酶基因；

2)培養(yǎng)基配置：10％ms培養(yǎng)基、1.0％瓊脂糖、80mm蔗糖，加入互補(bǔ)核苷酸鏈，使其終濃度達(dá)到400μm；

3)花柱培養(yǎng)：將蕓苔屬植物花柱切下，放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4小時(shí)后，提取其花柱rna，并反轉(zhuǎn)錄成cdna。

4)基因表達(dá)量測(cè)定：將反轉(zhuǎn)錄的cdna作為模板，通過熒光定量pcr測(cè)定其nadph氧化酶基因表達(dá)量。

進(jìn)一步地，所述互補(bǔ)核苷酸鏈?zhǔn)窃谒瞿康幕虬l(fā)卡環(huán)、內(nèi)部環(huán)、膨脹環(huán)和多分枝環(huán)等可能的結(jié)合位點(diǎn)上，設(shè)計(jì)出互補(bǔ)核苷酸鏈，并進(jìn)行硫代硫酸酯修飾和hplc純化。

更進(jìn)一步地，所述互補(bǔ)核苷酸鏈(5’-3’)為：attcttgtccactatgtc。

進(jìn)一步地，基因表達(dá)量測(cè)定中根據(jù)nadph氧化酶基因(登陸號(hào)：xm_009114548.2)的基因序列設(shè)計(jì)：引物序列(5’-3’)為：正向：gaacagcacaggaagcaaca；反向：agctctgccacttcgttcat。

更進(jìn)一步地，反應(yīng)體系為：正向、反向引物(10μm)各1μl；模板1μl；ssofastevagreensupermix(熒光定量pcr測(cè)定的試劑盒名字)10μl；無酶水7μl。

本發(fā)明的有益效果：

1)本方法能夠快速、高效抑制nadph氧化酶基因在蕓苔屬植物花柱的表達(dá)；

2)本方法具有準(zhǔn)確度高特點(diǎn)，可以用于目標(biāo)基因的功能特性鑒定，具有良好的前景。

3)本方法耗時(shí)較短、成本較低，而且對(duì)于目標(biāo)基因的功能特性鑒定有重要的意義。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所述方法的實(shí)驗(yàn)流程圖。

圖2是本發(fā)明花柱培養(yǎng)示意圖。

圖3是本發(fā)明nadph氧化酶基因表達(dá)量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體方案實(shí)施例，進(jìn)一步闡釋本發(fā)明的步驟與方法，不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

本實(shí)例以甘藍(lán)為實(shí)驗(yàn)材料，操作如下，可參考圖1：

1)從genebank上獲得nadph氧化酶基因序列(登陸號(hào)為：xm_009114548.2)，在其發(fā)卡環(huán)、內(nèi)部環(huán)、膨脹環(huán)和多分枝環(huán)等可能的結(jié)合位點(diǎn)上，設(shè)計(jì)出互補(bǔ)核苷酸鏈，并進(jìn)行硫代硫酸酯修飾和hplc純化。

所述互補(bǔ)核苷酸鏈(5’-3’)：attcttgtccactatgtc

2)培養(yǎng)基配置：10％ms培養(yǎng)基、1.0％瓊脂糖、80mm蔗糖。加入互補(bǔ)核苷酸鏈，使其終濃度達(dá)到400μm。

3)將蕓苔屬花柱切下，插入含有400μm的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并設(shè)置空白對(duì)照組(ck)(圖2)。4小時(shí)后，提取其花柱rna，并反轉(zhuǎn)錄成cdna。

4)以轉(zhuǎn)錄的cdna為模板，進(jìn)行熒光定量pcr。反應(yīng)體系為：正向、反向引物(10μm)各1μl；模板1μl；ssofastevagreensupermix10μl；無酶水7μl。

5)引物序列(5’-3’)為：

正向：gaacagcacaggaagcaaca；

反向：agctctgccacttcgttcat

6)經(jīng)整理分析得出：經(jīng)過處理后的nadph氧化酶基因的表達(dá)量顯著減少(圖3，ck是未作處理的空白試驗(yàn))。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種抑制蕓苔屬植物花柱NADPH氧化酶基因表達(dá)的方法。利用已知的NADPH氧化酶基因(Genbank登陸號(hào)：XM_009114548.2)在其二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能結(jié)合位點(diǎn)處設(shè)計(jì)出互補(bǔ)核苷酸鏈，添加至培養(yǎng)基中。將蕓苔屬植物花柱放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí)，讓其充分吸收互補(bǔ)核苷酸鏈。提取花柱RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，通過熒光定量PCR檢測(cè)出花柱中NADPH氧化酶基因表達(dá)量顯著減少，證明該互補(bǔ)核苷酸鏈可以抑制該基因表達(dá)。

技術(shù)研發(fā)人員：王春雷;黃旭;宋平平;孫婭;劉正陽;張盼盼
受保護(hù)的技術(shù)使用者：揚(yáng)州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.04.07
技術(shù)公布日：2017.10.20