本發(fā)明公開了一種珍珠母蛋白n16的制備方法。

背景技術：

骨質(zhì)疏松癥是指以骨量低及組織微結構退行病變?yōu)樘卣鳌⒐谴嘈栽黾雍凸钦畚ｋU度升高的一種全身骨代謝障礙的疾病。該病在中老年人群中尤為常見。目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，主要分為骨吸收抑制劑和骨形成促進劑兩類。常用骨吸收抑制劑有雙磷酸鹽、降鈣素等，具有抑制破骨細胞的成熟與功能的活性，但只能減緩骨量流失，不能從根本上治療骨質(zhì)疏松癥。雖然骨形成促進劑能增加骨量，相對于骨吸收抑制劑有明顯優(yōu)勢，但目前市場上骨形成促進劑只有teriparatide、preotact等少類藥物，價格昂貴，長期使用有可能刺激骨吸收，并增加患者產(chǎn)生骨肉瘤的風險，安全性低。而可雙向調(diào)節(jié)骨重建平衡能力的抗骨質(zhì)疏松癥藥物同時具備促進骨形成和抑制骨吸收的作用，具有明顯的優(yōu)勢，但只有雷尼酸鍶一種藥物可供患者選擇。

研究報道，珍珠母的水溶性蛋白具有促進成骨活性，能促進骨損傷修復，顯著提高去卵巢大鼠的骨密度，提高新生鼠顱骨的原代培養(yǎng)細胞和mrc-5(人類胎兒成纖維細胞系)細胞的堿性磷酸酶活性，刺激成骨細胞的分化和產(chǎn)生礦化結節(jié)，促進骨形成。珍珠母蛋白具有良好的生物相容性，安全性高。在國內(nèi)外，珍珠母粉被認為是一種良好的骨組織替代材料。珍珠母移植或透皮注射到動物體內(nèi)無免疫排斥反應或明顯毒副作用。

珍珠母蛋白n16屬于非水溶性珍珠母蛋白，分子量為16kda，在1999年由samata等人在珍珠母不溶于水的組分中發(fā)現(xiàn)，并認為n16能影響碳酸鈣結晶的形狀。而且，在2015年由馬結儀等人報道了n16蛋白的細胞學生物活性和其在治療骨質(zhì)疏松方面潛在的藥用價值。因為n16蛋白具有良好的藥理活性，所以開發(fā)一種合適的n16蛋白發(fā)酵表達的工藝是非常必要的。

目前，徐禎彥等人已公開發(fā)表n16的生物工程制備方法(徐禎彥，歐嘉儀，黃家樂等.具有抗骨質(zhì)疏松作用的n16蛋白的生物工程制備工藝研究.中山大學學報(自然科學版).2016，may，55(3)：135-138，144)。該制備工藝將n16基因插入prhismbp質(zhì)粒，轉化入bl21(de3)工程菌，以lb作為培養(yǎng)基進行n16蛋白的表達。該表達工藝已能在搖瓶水平表達n16蛋白，但仍存在產(chǎn)量、產(chǎn)品純度不理想，工藝復雜，工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)可行性低等缺陷。

技術實現(xiàn)要素：

為克服以上缺陷，本發(fā)明對現(xiàn)有技術進行優(yōu)化：改進表達體系，使之更可控、產(chǎn)量更高；改進發(fā)酵方法，以發(fā)酵罐替代搖瓶，實現(xiàn)可控式高密度發(fā)酵；簡化純化步驟，使純化更簡便同時減少樣品損失。

本發(fā)明方法包括以下步驟：

1、利用pcr法擴增n16基因，擴增所得n16基因連接到表達載體pet32a上，并導入大腸桿菌bl21(de3)plyse，涂布于平板并挑取表達效力高的單克隆，用于表達n16蛋白；

2、挑取上述單克隆，接種至基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為種子培養(yǎng)基；

3、再將種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵體系基礎培養(yǎng)基，待大腸桿菌bl21(de3)plyse生長到對數(shù)期，加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，誘導n16表達，收集表達菌體；

4、分離純化步驟：將表達菌體在ph6.5～8.5的條件下進行包涵體分離，經(jīng)凝膠排阻層析純化得珍珠母蛋白n16。

其中，步驟3發(fā)酵體系控制種子生長條件優(yōu)選：ph5.0～9.0，25～37℃，初始溶氧50％～150％，并以乳糖作為補料碳源，待大腸桿菌bl21(de3)plyse生長到對數(shù)期，加入0.1～1mm異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，誘導n16的表達6～16h，收集表達菌體；

最優(yōu)選生長條件是：ph7.0，溫度為37℃，初始溶氧濃度100％，待大腸桿菌bl21(de3)plyse生長到對數(shù)期，加入0.4mm異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷。

步驟3所述發(fā)酵體系的乳糖溶液配方建議為：1l乳糖溶液中含乳糖10～200g，mgso4·7h2o1～10g。

步驟3所述的發(fā)酵體系基礎培養(yǎng)基配方建議為：1l基礎培養(yǎng)基含酵母粉1～10g，nz胺1～10g，nacl1～10g，mgso4·7h2o1～10g，酸水解酪蛋白1～10g，乳糖1～10g，kh2po40.1～10g。

最優(yōu)選發(fā)酵體系基礎培養(yǎng)基配方為：1l基礎培養(yǎng)基含酵母粉5.0g，nz胺10.0g，nacl5.0g，mgso4·7h2o2.0g，酸水解酪蛋白1.0g，乳糖5.0，kh2po40.75g。

步驟3所述種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵體系基礎培養(yǎng)基的接種比例為：種子培養(yǎng)基按0.1～10％(v/v)比例接種于1～10l基礎培養(yǎng)基。

步驟1所述pcr法擴增n16基因的反應程序建議為：90～100℃下反應0.5～2分鐘，45～60℃下反應20～60秒，72℃下反應0.5～2分鐘，共20～40個循環(huán)；最后65～75℃下反應5～15分鐘。

步驟2所述的種子培養(yǎng)基的制備方法為：挑取單克隆至基礎培養(yǎng)基，25～37℃搖床培養(yǎng)，使其生長至od600為0.1～1.0；所述的基礎培養(yǎng)基為nz培養(yǎng)基，其配方為：1l的nz培養(yǎng)基含酵母粉1～10g，nz胺1～10g，nacl1～10g，mgso4·7h2o1～10g，酸水解酪蛋白1～10g。

步驟4所述的分離純化步驟具體為：以0.01～1mtris-hcl作為分散液將表達菌體分散，超聲破碎，離心，棄上清液，收集不溶物a以洗滌緩沖液超聲溶解，離心，收集不溶物b，再以溶解緩沖液溶解不溶物b，離心，取上清液，濾膜過濾，以凝膠排阻層析柱分離純化得目標產(chǎn)品n16；其中，所述洗滌緩沖液由1～3m尿素,0.01～1mtris配制，ph為6.5～8.5；所述的溶解緩沖液由7～8m尿素,0.01～1mtris,和5～40mmβ-巰基乙醇配制，ph為6.5～8.5；所述凝膠排阻層析柱分離的流動相由7～8m尿素,0.01～1mtris,5～40mmβ-巰基乙醇配制,ph為6.5～8.5。

相對于現(xiàn)有技術本發(fā)明的制備方法具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明利用分子克隆技術重組n16蛋白的表達體系，使表達體系更穩(wěn)定、產(chǎn)量更高；

2、本發(fā)明將基礎培養(yǎng)基更換為nz培養(yǎng)基，提高了表達產(chǎn)量，并降低了雜質(zhì)蛋白的表達；

3、本發(fā)明構建了完整的發(fā)酵表達體系，適用于工業(yè)生產(chǎn)；

4、本發(fā)明改進了純化工藝，使得純化步驟更為簡便，蛋白純度更高。

附圖說明

圖1為實施例1中樣品對比電泳圖。

圖2為實施例2中樣品對比電泳圖。

圖3為實施例3中樣品15％sds-page電泳圖。

圖4為實施例4中樣品對比電泳圖。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明的方法改進及有益效果作進一步說明。

實施例1：n16的表達體系改良

實驗方法：

1、實驗組樣品制備：利用pcr法擴增n16基因，反應程序設為95℃1分鐘，50℃20秒，72℃1分鐘，共25個循環(huán)，最后72℃10分鐘。擴增所得n16基因連接到表達載體pet32a上，并導入大腸桿菌bl21(de3)plyse。挑取單菌落接種至lb培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至od600為0.6，加入iptg使其濃度為0.4mm誘導n16蛋白表達，16h后收集菌體。作為實驗組樣品。

2、對照組樣品制備：按背景技術所述徐禎彥等人發(fā)表的《具有抗骨質(zhì)疏松作用的n16蛋白的生物工程制備工藝研究>>記載的方法制備對照組樣品。具體方法為：利用pcr法擴增n16基因，反應程序設為95℃1分鐘，50℃20秒，72℃1分鐘，共25個循環(huán)，最后72℃10分鐘。擴增所得n16基因連接到表達載體pet3a上，并導入大腸桿菌bl21(de3)plyss。挑取單菌落接種至lb培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至od600為0.6，加入iptg使其濃度為0.4mm誘導n16蛋白表達，16h后收集菌體。作為對照組樣品。

將實驗組與對照組樣品超聲破碎后，取等體積量進行15％sds-page電泳檢驗。

實驗結果：

如附圖1中所示，“m”為蛋白marker，“1”為實驗組樣品，“2”為對照組樣品。結果顯示，實驗組與對照組相比，目標蛋白(n16)表達量明顯提高，且雜質(zhì)蛋白表達明顯降低。

按上述方法將反應程序分別設為：

1、90℃反應2分鐘，60℃下反應40秒，72℃下反應0.5分鐘，共20個循環(huán)；最后65℃下反應5分鐘；25℃培養(yǎng)至od600為0.1。

2、100℃下反應0.5分鐘，45℃下反應20秒，72℃下反應2分鐘，共40個循環(huán)；最后75℃下反應15分鐘，32℃培養(yǎng)至od600為1.0。

實驗結果顯示，上述兩組參數(shù)反應程序的實驗組與對照組相比，目標蛋白(n16)表達量明顯提高，且雜質(zhì)蛋白表達也明顯有所降低。

實施例2：n16的基礎培養(yǎng)基改良

實驗方法：

1、實驗組樣品制備：利用pcr法擴增n16基因，反應程序設為95℃1分鐘，50℃20秒，72℃1分鐘，共25個循環(huán)，最后72℃10分鐘。擴增所得n16基因連接到表達載體pet32a上，并導入大腸桿菌bl21(de3)plyse。挑取單菌落接種至nz培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至od600為0.6，加入iptg使其濃度為0.4mm誘導n16蛋白表達，16h后收集菌體。作為實驗組樣品。

2、對照組樣品制備：利用pcr法擴增n16基因，反應程序設為95℃1分鐘，50℃20秒，72℃1分鐘，共25個循環(huán)，最后72℃10分鐘。擴增所得n16基因連接到表達載體pet32a上，并導入大腸桿菌bl21(de3)plyse。挑取單菌落接種至lb培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至od600為0.6，加入iptg使其濃度為0.4mm誘導n16蛋白表達，16h后收集菌體。作為對照組樣品。

將實驗組與對照組樣品超聲破碎后，取等體積量進行15％sds-page電泳檢驗。

實驗結果：

如附圖2中所示，“m”為蛋白marker，“1”為實驗組樣品，“2”為對照組樣品。結果顯示，實驗組與對照組相比，目標蛋白(n16)表達量有明顯的提高。

實施例3：n16的發(fā)酵體系建立

實驗方法：

1、實驗組樣品1制備：將種子培養(yǎng)基按5.0％(v/v)比例接種于3l基礎培養(yǎng)基；控制發(fā)酵條件為溫度37℃，ph7.0，初始溶氧100％，發(fā)酵轉速為350rpm；以乳糖溶液作為補料碳源；待發(fā)酵至對數(shù)生長末期，加入0.4mm異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，誘導n16的表達16h，收集表達菌體。其中發(fā)酵基礎培養(yǎng)基的配方(1l)為：酵母粉5.0g，nz胺10.0g，nacl5.0g，mgso4·7h2o2.0g，酸水解酪蛋白1.0g，乳糖5.0g，kh2po40.75g；補料乳糖溶液的配方(1l)為：乳糖150g，mgso4·7h2o8.0g。

2、對照組樣品制備：為未經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基樣品

收集發(fā)酵后的菌體，將菌濃稀釋至與種子培養(yǎng)基相同；取等體積菌液，超聲破碎后進行sds-page電泳檢驗。

實驗結果：

如附圖3所示，“m”為蛋白marker，“1”為種子培養(yǎng)基樣品，“2”為發(fā)酵組樣品。結果顯示，本例實施的發(fā)酵工藝可成功表達n16蛋白，且與種子培養(yǎng)基相比，菌體表達n16蛋白的效力保持一致。

2、實驗組樣品2的制備：將種子培養(yǎng)基按0.10％(v/v)比例接種于1l基礎培養(yǎng)基；控制發(fā)酵條件為溫度25℃，ph9.0，初始溶氧50％，發(fā)酵轉速為200rpm；以乳糖溶液作為補料碳源；待發(fā)酵至對數(shù)生長末期，加入0.1mm異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，誘導n16的表達16h，收集表達菌體。其中發(fā)酵基礎培養(yǎng)基的配方(1l)為：酵母粉1.0g，nz胺5.0g，nacl1.0g，mgso4·7h2o5.0g，酸水解酪蛋白5.0g，乳糖1.0g，khp2o45g；補料乳糖溶液的配方(1l)為：乳糖10g，mgso·47h2o5g。

3、實驗組樣品3的制備：將種子培養(yǎng)基按10％(v/v)比例接種于10l基礎培養(yǎng)基；控制發(fā)酵條件為溫度30℃，ph5.0，初始溶氧150％，發(fā)酵轉速為800rpm；以乳糖溶液作為補料碳源；待發(fā)酵至對數(shù)生長末期，加入1mm異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，誘導n16的表達16h，收集表達菌體。其中發(fā)酵基礎培養(yǎng)基的配方(1l)為：酵母粉10.0g，nz胺1.0g，nacl10.0g，mgso4·7h2o10.0g，酸水解酪蛋白10.0g，乳糖10.0g，khp2o410g；補料乳糖溶液的配方(1l)為：乳糖80g，mgso·47h2o1g。

將實驗組樣品2和3和種子培養(yǎng)基樣品比較，結果顯示，兩樣品的發(fā)酵工藝均可成功表達n16蛋白，且與種子培養(yǎng)基相比，菌體表達n16蛋白的效力保持一致。

實施例4：n16的純化方法改良

實驗方法：

1、實驗組樣品1制備方法：將表達菌體分散在20mmtris-hcl(ph7.4)中，超聲破碎，離心，棄上清。不溶物以洗滌緩沖液(2m尿素,20mmtris,ph7.4)超聲溶解。離心，收集不溶物。再以溶解緩沖液(8m尿素,20mmtris,40mmβ-巰基乙醇,ph7.4)混懸不溶物，超聲溶解，室溫搖洗過夜。離心，取上清液，0.45μm濾膜過濾。以凝膠排阻層析柱對n16進行純化以及濃縮，其中，上樣緩沖液為8m尿素,20mmtris,40mmβ-巰基乙醇,ph7.4，洗脫液為8m尿素,20mmtris,40mmβ-巰基乙醇，ph7.4。15％sds-page檢測n16。收集含n16的洗脫液，超濾濃縮。15％sds-page檢測n16的純度。樣品作為實驗組1樣品。

2、對照組樣品1制備方法：“如<<具有抗骨質(zhì)疏松作用的n16蛋白的生物工程制備工藝研究>>所述。將表達菌體分散在20mmtris-hcl(ph7.4)中，超聲破碎，離心，棄上清；重復上述步驟一次。不溶物以洗滌緩沖液(2m尿素,20mmtris,ph7.4)超聲溶解，離心，收集不溶物；重復上述步驟一次。再以溶解緩沖液(8m尿素,20mmtris,40mmβ-巰基乙醇,ph7.4)混懸不溶物，超聲溶解，室溫搖洗過夜。離心，取上清液，0.45μm濾膜過濾。以凝膠排阻層析柱對n16進行純化以及濃縮，其中，上樣緩沖液為8m尿素,20mmtris,40mmβ-巰基乙醇,ph7.4，洗脫液為8m尿素,20mmtris,40mmβ-巰基乙醇，ph7.4。15％sds-page檢測n16。收集含n16的洗脫液，超濾濃縮。15％sds-page檢測n16的純度。樣品作為對照組1樣品。

實驗結果：

如附圖4所示，改進的工藝所得n16得率更高，并且純度與原工藝一致，電泳條帶清晰單一。與原有工藝相比，改進后的工藝清洗步驟更加簡化，n16蛋白的損失減少。

3、實驗組樣品2制備方法：將表達菌體分散在500mmtris-hcl(ph6.5)中，超聲破碎，離心，棄上清。不溶物以洗滌緩沖液(1m尿素,500mmtris,ph6.5)超聲溶解。離心，收集不溶物。再以溶解緩沖液(7m尿素,1mtris,5mmβ-巰基乙醇,ph6.5)混懸不溶物，超聲溶解，室溫搖洗過夜。離心，取上清液，0.2μm濾膜過濾。以凝膠排阻層析柱對n16進行純化以及濃縮，其中，上樣緩沖液為8m尿素,500mmtris,5mmβ-巰基乙醇,ph6.5，洗脫液為8m尿素,500mmtris,5mmβ-巰基乙醇，ph6.5。15％sds-page檢測n16。收集含n16的洗脫液，超濾濃縮。15％sds-page檢測n16的純度。樣品作為實驗組2樣品。

參照實驗組樣品2制備方法參數(shù)，按對照組樣品1制備方法制備對照組樣品2。

實驗結果：與附圖4相似，改進的工藝所得n16(實驗組樣品2)得率更高，并且純度與原工藝(對照組樣品2)一致，電泳條帶清晰單一。與原有工藝相比，改進后的工藝清洗步驟更加簡化，n16蛋白的損失減少。

4、實驗組樣品3制備方法：將表達菌體分散在1mtris-hcl(ph8.5)中，超聲破碎，離心，棄上清。不溶物以洗滌緩沖液(3m尿素,1mtris,ph8.5)超聲溶解。離心，收集不溶物。再以溶解緩沖液(7.5m尿素,500mtris,25mmβ-巰基乙醇,ph8.5)混懸不溶物，超聲溶解，室溫搖洗過夜。離心，取上清液，0.3μm濾膜過濾。以凝膠排阻層析柱對n16進行純化以及濃縮，其中，上樣緩沖液為7.5m尿素,1mtris,25mmβ-巰基乙醇,ph8.5，洗脫液為7.5m尿素,1mtris,25mmβ-巰基乙醇，ph8.5。15％sds-page檢測n16。收集含n16的洗脫液，超濾濃縮。15％sds-page檢測n16的純度。樣品作為實驗組3樣品。

參照實驗組樣品3制備方法參數(shù)，按對照組樣品1制備方法制備對照組樣品3。

實驗結果：與附圖4相似，改進的工藝所得n16(實驗組樣品3)得率更高，并且純度與原工藝(對照組樣品3)一致，電泳條帶清晰單一。與原有工藝相比，改進后的工藝清洗步驟更加簡化，n16蛋白的損失減少。