對(duì)序列表的引用本申請(qǐng)包括計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過(guò)引用并入本文。本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的α-淀粉酶變體、編碼變體的多核苷酸、產(chǎn)生變體的方法以及使用變體的方法。
背景技術(shù)：
：：α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(alpha-1,4-glucan-4-glucanohydrolases)，e.c.3.2.1.1)構(gòu)成一組酶，這些酶催化淀粉以及其他直鏈和支鏈1,4-糖苷寡糖和多糖(1,4-gluosidicoligo-andpolysaccharide)的水解。α-淀粉酶在工業(yè)上用于若干種已知應(yīng)用的用途具有悠久歷史，所述應(yīng)用如洗滌劑(detergent)、烘焙(baking)、釀造(brewing)、淀粉液化和糖化，例如在制備高果糖糖漿中或用作從淀粉生產(chǎn)乙醇的一部分。α-淀粉酶的這些應(yīng)用和其他應(yīng)用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特別是細(xì)菌α-淀粉酶。要使用的第一種細(xì)菌α-淀粉酶之一是來(lái)自地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)的α-淀粉酶，還稱作特妙淀粉酶(termamyl)，其已經(jīng)被充分表征并且這種酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定。芽孢桿菌淀粉酶如特妙淀粉酶和sp707形成已經(jīng)在洗滌劑中得到應(yīng)用的特定的一組α-淀粉酶。這些已知的細(xì)菌淀粉酶中的許多已經(jīng)經(jīng)修飾來(lái)改進(jìn)其在具體應(yīng)用中的功能。已經(jīng)完全研究了增加α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性的方法。suzuki等人(1989)公開(kāi)了嵌合α-淀粉酶，其中已經(jīng)用解淀粉芽孢桿菌(b.amyloliquefaciens)α-淀粉酶的規(guī)定區(qū)域替代地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的相應(yīng)區(qū)域。以鑒定負(fù)責(zé)熱穩(wěn)定性的區(qū)域?yàn)槟康?，?gòu)建了嵌合α-淀粉酶。發(fā)現(xiàn)此類區(qū)域包括解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的氨基酸殘基177-186和氨基酸殘基255-270。igarashi等人1998顯示了可以通過(guò)從環(huán)(f178至a184)中缺失兩個(gè)氨基酸殘基，r179-g180(amys編號(hào))增加amys型淀粉酶的熱穩(wěn)定性。然而，shiau等人(2003)顯示了在相同的環(huán)中具有缺失的amys酶對(duì)于在高溫下的玉米淀粉水解比親本酶具有更低的比活性，否定了amys淀粉酶的主要優(yōu)點(diǎn)之一。在wo2014/195356中，描述了α-淀粉酶變體，如芽孢桿菌ts-23α-淀粉酶具有改進(jìn)的穩(wěn)定性。該變體可以具有i)在兩個(gè)或更多個(gè)位置處的缺失和ii)在選自列表的一個(gè)或多個(gè)位置處的改變。出于環(huán)境原因，降低清洗，洗碗(dishwashing)和/或清潔過(guò)程中的溫度已變得越來(lái)越重要。然而，大多數(shù)酶(包括淀粉酶)具有高于低溫清洗中通常使用的溫度的最適溫度。α-淀粉酶是用于洗滌劑組合物的關(guān)鍵酶，并且其使用對(duì)于洗衣清洗或洗碗期間淀粉污漬的去除變得越來(lái)越重要。因此，重要的是找到下述α-淀粉酶變體，其當(dāng)溫度降低時(shí)保持其洗滌性能，去污效果(stainremovaleffect)和/或活性。然而，盡管目前洗滌劑酶組合物的效率，存在許多難以完全除去的污漬。這些問(wèn)題由于不斷使用低(例如，冷水)清洗溫度和較短的清洗循環(huán)而變復(fù)雜。因此，期望具有可在低溫下發(fā)揮功能，同時(shí)保留或增加其它期望的特性如比活性(淀粉分解活性)，穩(wěn)定性和/或清洗性能的淀粉分解酶。因此，本發(fā)明的目的是提供當(dāng)摻入洗滌劑組合物如液體洗滌劑中時(shí)，特別是在螯合劑，表面活性劑，蛋白酶和/或堿性條件的存在下展現(xiàn)出高水平的穩(wěn)定性的α-淀粉酶變體。本發(fā)明提供了α-淀粉酶變體，所述α-淀粉酶變體與其親本和已知的α-淀粉酶變體相比具有改進(jìn)的穩(wěn)定性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及親本α-淀粉酶的變體，該變體具有α-淀粉酶活性并與seqidno:1具有至少89％的序列同一性，其中該變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置處包含氨基酸基序fx1x2k；其中x1是r或s；并且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r時(shí)，則x2不是s，并且其中所述變體與包含基序frsk的淀粉酶相比具有改進(jìn)的殘留活性(residualactivity，ra)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本申請(qǐng)的變體的組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及洗滌劑添加劑，其包含本申請(qǐng)的變體，任選地以無(wú)塵顆粒(non-dustinggranulate)，穩(wěn)定化的液體，或受保護(hù)的酶的形式。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及手動(dòng)或自動(dòng)洗碗洗滌劑組合物，其包含本發(fā)明的變體，和任選地表面活性劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及手動(dòng)或自動(dòng)洗衣洗滌劑組合物，其包含本發(fā)明的變體。在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的變體的用途。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的變體在洗衣、洗碗，如自動(dòng)或手動(dòng)洗碗，硬表面清潔(hardsurfacecleaning)，工業(yè)和機(jī)構(gòu)清潔(industrialandinstitutionalcleaning)，紡織品退漿(textiledesizing)，淀粉改性(starchmodification)，淀粉液化(starchliquefaction)，糖化(saccharification)，飼料(feed)，烘焙或釀造中的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多肽的核酸構(gòu)建體。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多肽的表達(dá)載體。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多肽的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的α-淀粉酶變體的方法，其包括(a)在適合于表達(dá)所述變體的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；并且(b)回收該變體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于獲得α-淀粉酶變體的方法，其包括向親本α-淀粉酶中引入選自對(duì)應(yīng)于seqidno:1的氨基酸序列的r180,s181,t182和g183的位置的兩個(gè)氨基酸的缺失，提供氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；并且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r時(shí)，則x2不是s，所述變體與包含基序frsk的淀粉酶相比具有改進(jìn)的殘留活性(ra)，且其中所述變體具有α-淀粉酶活性；并且回收該變體。定義α-淀粉酶：如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“α-淀粉酶活性”指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(e.c.3.2.1.1)的活性，其構(gòu)成一組催化淀粉以及其他直鏈和支鏈1,4-糖苷寡糖和多糖的水解的酶。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)方法中所述的程序確定α-淀粉酶活性。在一方面，本發(fā)明的α-淀粉酶具有如下列出的seqidno:1，2或3的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性seqidno:1ntapinetmmqyfewdlpndgtlwtkvkneaanlsslgitalwlppaykgtsqsdvgygvydlydlgefnqkgtirtkygtktqyiqaiqaakaagmqvyadvvfnhkagadgtefvdavevdpsnrnqetsgtyqiqawtkfdfpgrgntyssfkwrwyhfdgtdwdesrklnriykfrstgkawdwevdtengnydylmfadldmdhpevvtelknwgtwyvnttnidgfrldavkhikytffpdwltyvrnqtgknlfavgefwsydvnklhnyitktngsmslfdaplhnnfytaskssgyfdmryllnntlmkdqpslavtlvdnhdtqpgqslqswvepwfkplayafiltrqegypcvfygdyygipkynipglkskidplliarrdyaygtqrdyidhqdiigwtregidtkpnsglaalitdgpggskwmyvgkkhagkvfydltgnrsdtvtinadgwgefkvnggsvsiwvakseqidno:2ntapinetmmqyfewdlpndgtlwtkvkneaanlsslgitalwlppaykgtsqsdvgygvydlydlgefnqkgtirtkygtktqyiqaiqaakaagmqvyadvvfnhkagadgtefvdavevdpsnrnqetsgtyqiqawtkfdfpgrgntyssfkwrwyhfdgtdwdesrklnriykfkawdwevdtengnydylmfadldmdhpevvtelknwgtwyvnttnidgfrldavkhikytffpdwltyvrnqtgknlfavgefwsydvnklhnyitktngsmslfdaplhnnfytaskssgyfdmryllnntlmkdqpslavtlvdnhdtqpgqslqswvepwfkplayafiltrqegypcvfygdyygipkynipglkskidplliarrdyaygtqrdyidhqdiigwtregidtkpnsglaalitdgpggskwmyvgkkhagkvfydltgnrsdtvtinadgwgefkvnggsvsiwvakseqidno:3ntapinetmmqyfewdlpndgtlwtkvkneaanlsslgitalwlppaykgtsqsdvgygvydlydlgefnqkgtirtkygtktqyiqaiqaakaagmqvyadvvfnhkagadgtefvdavevdpsnrnqetsgtyqiqawtkfdfpgrgntyssfkwrwyhfdgtdwdesrklnriykfrstgkawdwevdtengnydylmfadldmdhpevvtelknwgtwyvnttnidgfrldavkhikysffpdwltyvrnqtgknlfavgefwsydvnklhnyitktngsmslfdaplhnnfytaskssgyfdmryllnntlmkdqpslavtlvdnhdtqpgqslqswvepwfkplayafiltrqegypcvfygdyygipkynipglkskidplliarrdyaygtqrdyidhqdiigwtregidtkpnsglaalitdgpggskwmyvgkkhagkvfydltgnrsdtvtinadgwgefkvnggsvsiwvaktsnvtftvnnatttsgqnvyvvanipelgnwntanaikmnpssyptwkatialpqgkaiefkfikkdqagnviwestsnrtytvpfsstgsytaswnvpseqidno:4fx1x2kα-淀粉酶活性：如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“α-淀粉酶活性”指α-淀粉酶的活性，其中根據(jù)方法中描述的程序確定該活性。可以根據(jù)使用實(shí)施例1中描述的phadebas的方法確定α-淀粉酶活性?？梢允褂闷渌摩?淀粉酶活性測(cè)定法，例如enzcheck或amylazyme。氨基酸：本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指標(biāo)準(zhǔn)的20個(gè)遺傳編碼的氨基酸及其相應(yīng)的“d”形式的立體異構(gòu)體(與天然的“l(fā)”形式相比)、ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常規(guī)氨基酸(例如α,α-二取代氨基酸，n-烷基氨基酸等)和化學(xué)衍生化的氨基酸。一種或多種氨基酸的化學(xué)衍生物可以通過(guò)與功能側(cè)基反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。此類衍生化的分子包括例如其中游離氨基已被衍生化形成胺鹽酸鹽，對(duì)甲苯磺?；?，羧基苯甲氧基，叔丁氧基羰基，氯乙酰基或甲?；哪切┓肿?。游離羧基可被衍生化形成鹽，甲基和乙基酯或其它類型的酯和酰肼。游離羥基可被衍生化形成o-酰基或o-烷基衍生物。還包括作為化學(xué)衍生物的含有20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如：4-羥基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羥賴氨酸可以取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可以取代組氨酸；高絲氨酸可取代絲氨酸，并且鳥(niǎo)氨酸可取代賴氨酸。衍生物還包括含有一個(gè)或多個(gè)添加或缺失的肽，只要維持必需的活性即可。其他包括的修飾是酰胺化，氨基末端?；?例如乙酰化或巰基乙酸酰胺化)，末端羧基酰胺化(例如用氨或甲胺)和類似的末端修飾。當(dāng)明確列舉氨基酸，如“丙氨酸”或“ala”或“a”時(shí)，除非另有明確說(shuō)明，否則該術(shù)語(yǔ)指l-丙氨酸和d-丙氨酸兩者。其他非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明多肽的合適組分，只要多肽保留期望的功能特性。對(duì)于所示的肽，每個(gè)編碼的氨基酸殘基在適當(dāng)?shù)那闆r下由單字母名稱表示，所述單字母名稱對(duì)應(yīng)于常規(guī)氨基酸的三字母名稱。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含1-氨基酸或由1-氨基酸組成。氨基酸基序：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸基序”或“基序”是指多肽的具體限定的氨基酸區(qū)段。因此，氨基酸基序涉及親本多肽中氨基酸的短序列。根據(jù)本發(fā)明，氨基酸基序?qū)?yīng)于seqidno:4，其對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸位置180至183。cdna：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“cdna”是指可以通過(guò)從真核或原核細(xì)胞獲得的成熟的，剪接的mrna分子的逆轉(zhuǎn)錄制備的dna分子。cdna缺少可能存在于對(duì)應(yīng)的基因組dna中的內(nèi)含子序列。初始的初級(jí)rna轉(zhuǎn)錄物是mrna的前體，其通過(guò)一系列步驟進(jìn)行處理，包括剪接，然后作為成熟的剪接mrna出現(xiàn)。編碼序列：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“編碼序列”是指直接規(guī)定變體的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由可讀框來(lái)確定，其以起始密碼子如atg，gtg或ttg開(kāi)始，并以終止密碼子如taa，tag或tga結(jié)束。編碼序列可以是基因組dna，cdna，合成dna或其組合?？刂菩蛄校喝绫疚闹惺褂玫?，術(shù)語(yǔ)“控制序列”是指對(duì)于編碼本發(fā)明變體的多核苷酸的表達(dá)必需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼變體的多核苷酸可以是天然的(native)(即，來(lái)自相同的基因)或外源的(即，來(lái)自不同的基因)或彼此天然的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列，多聚腺苷酸化序列，前肽序列，啟動(dòng)子，信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。為了引入特定限制性位點(diǎn)，促進(jìn)控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)的連接，可以給控制序列提供接頭。對(duì)應(yīng)于：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于”是指參考特定氨基酸序列，確定序列的特定氨基酸的方式。例如。為了本發(fā)明的目的，當(dāng)參考特定的氨基酸位置時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)⒘硪粋€(gè)氨基酸序列與已經(jīng)參考的所述氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，以確定在所述另一個(gè)氨基酸序列中哪個(gè)特定氨基酸序列可以是感興趣的。已經(jīng)在本文其他地方描述了將另一個(gè)氨基酸序列與例如，如seqidno:1，2或3所示的序列或本文所列的任何其它序列比對(duì)?？梢允褂脗溥x比對(duì)方法，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。洗碗組合物：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“洗碗組合物”是指用于清潔硬表面的所有形式的組合物。本發(fā)明不限于任何特定類型的洗碗組合物或任何特定的洗滌劑。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，洗碗組合物是液體洗碗組合物，粉末洗碗組合物，其中組合物可任選地為單位劑量的形式。酶去垢性益處：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“酶去垢性益處(enzymedetergencybenefit)”是指與不含酶的相同洗滌劑相比，酶可以添加到洗滌劑中的有利效果?？梢杂擅柑峁┑闹匾娜ス感砸嫣幨俏蹪n去除，其中在清洗和/或清潔之后沒(méi)有或很少有可見(jiàn)的垢，防止或減少在清洗過(guò)程中釋放的污垢的再沉積(也稱為抗再沉積(anti-redeposition)的效果)，完全或部分地恢復(fù)原來(lái)是白色但經(jīng)過(guò)反復(fù)使用和洗滌后已經(jīng)獲得了灰色或淡黃色外觀的紡織品的白度(whiteness)(也稱為增白的效果)。紡織品護(hù)理益處(其與催化性污漬去除或防止污垢再沉積無(wú)直接關(guān)系)對(duì)于酶去垢性益處也是重要的。此類紡織品護(hù)理益處的例子是防止或減少?gòu)囊环N織物到另一種織物或相同織物的另一部分的染料轉(zhuǎn)移(也稱為染料轉(zhuǎn)移抑制或抗返染(anti-backstaining)的效果)，從織物表面去除突出或斷裂的纖維以減少起球(pilling)傾向或去除已經(jīng)存在的球或絨毛(也稱為抗起球的效果)，織物柔軟度的改進(jìn)，織物的顏色澄清以及去除織物或服裝的纖維中捕獲的顆粒污垢。酶促漂白是進(jìn)一步的酶去垢性益處，其中催化活性通常用于催化漂白組分如過(guò)氧化氫或其它過(guò)氧化物的形成。表達(dá)：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指涉及變體產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。表達(dá)載體：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意指線性或環(huán)狀dna分子，該分子包括編碼變體的多核苷酸并且該多核苷酸與提供其表達(dá)的控制序列可操作連接。片段：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“片段”是指在seqidno:1的成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一個(gè)或多個(gè)(例如數(shù)個(gè))氨基酸的多肽；其中該片段具有α-淀粉酶活性。在一個(gè)方面，片段含有seqidno:1的至少200個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，例如seqidno:1的至少300個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，或至少350個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，或至少400個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，或至少450個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。硬表面清潔：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“硬表面清潔”是指硬表面的清潔，其中硬表面可以包括地板，桌，壁，屋頂?shù)?，以及諸如汽車(汽車清洗)和盤(pán)(洗碗)等硬物體的表面。洗碗包括但不限于碟(plates)，杯，玻璃器皿(glasses)，碗，餐具(cutlery)如勺，刀，叉，服務(wù)用具，陶瓷，塑料，金屬，瓷器，玻璃和丙烯酸類。宿主細(xì)胞：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指易于用含有本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不相同的親本細(xì)胞的任何后代。強(qiáng)度值：可以以亮度測(cè)量清洗性能，所述量度表示為當(dāng)用白光照亮?xí)r從樣品反射的光強(qiáng)度。當(dāng)樣品被染污時(shí)，反射光的強(qiáng)度低于干凈樣品的反射光的強(qiáng)度。因此，反射光的強(qiáng)度可以用于測(cè)量清洗性能，其中較高的強(qiáng)度值與較高的清洗性能相關(guān)。使用專業(yè)平板式掃描儀(flatbedscanner)(kodakiqsmart,kodak)進(jìn)行顏色測(cè)量，該掃描儀用于捕獲清洗的紡織品的圖像。為了從掃描圖像中提取光強(qiáng)度的值，將來(lái)自圖像的24位像素值轉(zhuǎn)化為紅色、綠色和藍(lán)色(rgb)的值。通過(guò)將rgb值作為向量相加在一起并然后考慮所得向量的長(zhǎng)度可以計(jì)算強(qiáng)度值(int)：改進(jìn)的特性：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“改進(jìn)的特性”是指與親本相比改進(jìn)的與變體相關(guān)的特征。此類改進(jìn)的特性包括但不限于洗滌性能和儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性。改進(jìn)的特性可以是本文定義和描述的那些中的任一種，如穩(wěn)定性。分離的：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的”意指處于自然界中不存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性例子包括(1)任何非天然存在的物質(zhì)；(2)至少部分地從與其在自然界中相關(guān)聯(lián)的一種或多種或全部天然存在的組分中取出的任何物質(zhì)，包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；(3)相對(duì)于自然界中發(fā)現(xiàn)的那種物質(zhì)認(rèn)為修飾的任何物質(zhì)；或者(4)通過(guò)相對(duì)于與其天然相關(guān)聯(lián)的其他組分增加該物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如，編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子的使用)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。成熟多肽：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”是指翻譯和任何翻譯后修飾(如n端加工，c端截短，糖基化，磷酸化等)后的最終形式的多肽。本領(lǐng)域中已知，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種更多種不同的成熟多肽(即，具有不同的c端和/或n端氨基酸)的混合物。成熟多肽編碼序列：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”是指編碼具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。修飾：在本發(fā)明的多肽的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“修飾”表示參考氨基酸序列(即seqidno:1，2或3)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸通過(guò)用不同的氨基酸取代，通過(guò)氨基酸的插入或通過(guò)缺失而改變。此外，突變可以對(duì)應(yīng)于在參考氨基酸序列內(nèi)插入一個(gè)或多個(gè)額外的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“修飾”，“改變”和“突變”可以互換使用，并構(gòu)成相同的含義和目的。核酸構(gòu)建體：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”是指單鏈或雙鏈的核酸分子，其從天然存在的基因中分離或以下述方式修飾為含有核酸區(qū)段，使得否則不會(huì)存在于自然界中，或者是合成的，其包含一個(gè)或多個(gè)控制序列?？刹僮鞯剡B接：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指其中將控制序列相對(duì)于多核苷酸的編碼序列置于適當(dāng)位置使得控制序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)的構(gòu)造。親本或親本α-淀粉酶：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“親本”或“親本α-淀粉酶”是指seqidno:1，2或3的α-淀粉酶或與seqidno:1，2或3的多肽中的任一項(xiàng)具有至少89％的序列同一性的任意α-淀粉酶。親本α-淀粉酶也可以是包含seqidno:1，2或3的片段的多肽，即親本α-淀粉酶可以是具有α-淀粉酶活性的融合多肽，如本文其它地方定義的。殘留活性(ra)：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“殘留活性(ra)”是指在一定溫度下孵育一定時(shí)間后，根據(jù)本發(fā)明的變體和/或酶保留的活性?？梢匀鐚?shí)施例1所述，通過(guò)使用例如phadebas測(cè)定法確定ra。淀粉改性：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“淀粉改性”是指在造紙業(yè)中生產(chǎn)紙漿時(shí)淀粉降解的過(guò)程。紙漿脫漿可用于造紙業(yè)工藝中，以獲得紙漿的最佳粘度。序列同一性：兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性通過(guò)參數(shù)“序列同一性”描述。為了本發(fā)明的目的，使用needleman-wunsch算法(needlemanandwunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性，如在emboss包(emboss：theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite，rice等人，2000，trendsgenet.16：276-277)的needle程序中實(shí)施，優(yōu)選版本5.0.0或更高版本。使用的參數(shù)可以是缺口開(kāi)放罰分10，缺口延伸罰分0.5，和eblosum62(blosum62的embos版本)替代矩陣。使用標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的needle輸出(使用no-brief選項(xiàng)獲取)作為百分比同一性，并且計(jì)算如下：(相同殘基×100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))或者，使用的參數(shù)可以是缺口開(kāi)放罰分10，缺口延伸罰分0.5，和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版本)替代矩陣。使用標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的needle輸出(使用no-brief選項(xiàng)獲取)作為百分比同一性，并且計(jì)算如下：(相同的脫氧核糖核苷酸×100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))子序列：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“子序列”是指在成熟多肽編碼序列的5'和/或3'末端不存在一個(gè)或多個(gè)(例如數(shù)個(gè))核苷酸的多核苷酸；其中該子序列編碼具有α-淀粉酶活性的片段。紡織品：紡織品樣品cs-28(棉上的稻淀粉)獲得centerfortestmaterialsbv,p.o.box120,3133ktvlaardingen,thenetherlands。紡織品護(hù)理益處：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“紡織品護(hù)理益處”定義為不與催化污漬去除或防止污垢的再沉積直接相關(guān)，對(duì)于酶去垢性益處也是重要的。此類紡織品護(hù)理益處的例子是防止或減少?gòu)囊环N紡織品到另一種紡織品或相同紡織品的另一部分的染料轉(zhuǎn)移(也稱為染料轉(zhuǎn)移抑制或抗返染的效果)，從紡織品表面去除突出或斷裂的纖維以減少起球傾向或去除已經(jīng)存在的球或絨毛(也稱為抗起球的效果)，紡織品柔軟度的改進(jìn)，紡織品的顏色澄清以及去除紡織品的纖維中捕獲的顆粒污垢。酶促漂白是進(jìn)一步的酶去垢性益處，其中催化活性通常用于催化漂白組分如過(guò)氧化氫或其它過(guò)氧化物或其它漂白種類的形成。變體：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“變體”是指具有α-淀粉酶活性的多肽，其相對(duì)于seqidno:1的“親本”α-淀粉酶在一個(gè)或多個(gè)(例如數(shù)個(gè))位置處包含突變，即取代，插入和/或缺失。取代是指用不同的氨基酸替換占據(jù)位置的氨基酸；缺失是指去除占據(jù)位置的氨基酸；而插入是指在占據(jù)位置的氨基酸附近和直接之后添加氨基酸。本發(fā)明的變體具有seqidno:1，2或3的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少100％。野生型α-淀粉酶：如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“野生型α-淀粉酶”是指由天然存在的微生物，例如天然存在的細(xì)菌，酵母或絲狀真菌表達(dá)的α-淀粉酶。變體命名規(guī)則具有α-淀粉酶活性的本發(fā)明的多肽對(duì)應(yīng)于源自芽孢桿菌的α-淀粉酶的變體，如seqidno:1，2或3所示。seqidno:1ntapinetmmqyfewdlpndgtlwtkvkneaanlsslgitalwlppaykgtsqsdvgygvydlydlgefnqkgtirtkygtktqyiqaiqaakaagmqvyadvvfnhkagadgtefvdavevdpsnrnqetsgtyqiqawtkfdfpgrgntyssfkwrwyhfdgtdwdesrklnriykfrstgkawdwevdtengnydylmfadldmdhpevvtelknwgtwyvnttnidgfrldavkhikytffpdwltyvrnqtgknlfavgefwsydvnklhnyitktngsmslfdaplhnnfytaskssgyfdmryllnntlmkdqpslavtlvdnhdtqpgqslqswvepwfkplayafiltrqegypcvfygdyygipkynipglkskidplliarrdyaygtqrdyidhqdiigwtregidtkpnsglaalitdgpggskwmyvgkkhagkvfydltgnrsdtvtinadgwgefkvnggsvsiwvak本發(fā)明多肽中的變體(即突變)氨基酸通過(guò)參考seqidno:1(其對(duì)應(yīng)于芽孢桿菌屬種ts-23的成熟蛋白質(zhì)ts23)的氨基酸編號(hào)來(lái)定義。相對(duì)于seqidno:1的氨基酸序列差異以粗體，下劃線顯示。除了seqidno:2的突出顯示的位置x1和x2之外，seqidno:1和2的氨基酸序列是相同的。seqidno:2ntapinetmmqyfewdlpndgtlwtkvkneaanlsslgitalwlppaykgtsqsdvgygvydlydlgefnqkgtirtkygtktqyiqaiqaakaagmqvyadvvfnhkagadgtefvdavevdpsnrnqetsgtyqiqawtkfdfpgrgntyssfkwrwyhfdgtdwdesrklnriykfkawdwevdtengnydylmfadldmdhpevvtelknwgtwyvnttnidgfrldavkhikytffpdwltyvrnqtgknlfavgefwsydvnklhnyitktngsmslfdaplhnnfytaskssgyfdmryllnntlmkdqpslavtlvdnhdtqpgqslqswvepwfkplayafiltrqegypcvfygdyygipkynipglkskidplliarrdyaygtqrdyidhqdiigwtregidtkpnsglaalitdgpggskwmyvgkkhagkvfydltgnrsdtvtinadgwgefkvnggsvsiwvak為了本發(fā)明的目的，使用seqidno:1中公開(kāi)的成熟多肽來(lái)確定另一種α-淀粉酶多肽中的相應(yīng)氨基酸殘基。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解也可以使用seqidno:2的序列來(lái)確定另一種α-淀粉酶中的相應(yīng)氨基酸殘基。將另一種α-淀粉酶的氨基酸序列與seqidno:1中公開(kāi)的成熟多肽比對(duì)，且基于比對(duì)，使用needleman-wunsch算法(needlemanandwunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)確定對(duì)應(yīng)于seqidno:1中公開(kāi)的成熟多肽中的任意氨基酸殘基的氨基酸位置編號(hào)，如在emboss包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,rice等人,2000,trendsgenet.16:276-277)的needle程序中實(shí)施的，優(yōu)選5.0.0版或更新版本。使用的參數(shù)是缺口開(kāi)放罰分10，缺口延伸罰分0.5，和eblosum62(blosum62的embos版本)替代矩陣。在另一種α-淀粉酶中對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基的鑒定可通過(guò)使用幾種計(jì)算機(jī)程序的多種多肽序列的比對(duì)來(lái)確定，這些計(jì)算機(jī)程序包括但不限于muscle(對(duì)數(shù)預(yù)期的多序列比較；版本3.5或更新的版本；edgar,2004,nucleicacidsresearch32:1792-1797)，mafft(版本6.857或更新的版本；katohandkuma,2002,nucleicacidsresearch30:3059-3066；katohetal.,2005,nucleicacidsresearch33:511-518；katohandtoh,2007,bioinformatics23:372-374；katohetal.,2009,methodsinmolecularbiology537:39-64；katohandtoh,2010,bioinformatics26:1899-1900)，以及采用clustalw的embossemma(1.83或更新的版本；thompsonetal.,1994,nucleicacidsresearch22:4673-4680)，應(yīng)用其各自的默認(rèn)參數(shù)。當(dāng)其他α-淀粉酶已經(jīng)與seqidno:1的成熟多肽趨異，使得傳統(tǒng)的基于序列的比較方法不能檢測(cè)其關(guān)系時(shí)(lindahlandelofsson,2000,j.mol.biol.295:613-615)，可應(yīng)用其他成對(duì)序列比較算法?？梢允褂盟阉鞒绦蛟诨谛蛄械乃阉髦蝎@得更大的靈敏度，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示(譜(profile))來(lái)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，psi-blast程序通過(guò)迭代數(shù)據(jù)庫(kù)搜索過(guò)程來(lái)產(chǎn)生譜并且能夠檢測(cè)遠(yuǎn)距離同源物(tschuletal.,1997,nucleicacidsres.25:3389-3402)。當(dāng)多肽的家族或超家族在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中具有一個(gè)或多個(gè)代表時(shí)，甚至可實(shí)現(xiàn)更大的敏感度。程序如genthreader(jones,1999,j.mol.biol.287:797-815；mcguffinandjones,2003,bioinformatics19:874-881)利用來(lái)自多種來(lái)源的信息(psi-blast、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)比對(duì)譜、以及溶劑化潛力(solvationpotential))作為預(yù)測(cè)查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，goughetal.,2000,j.mol.biol.313:903-919的方法可以用于比對(duì)未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于scop數(shù)據(jù)庫(kù)中的超家族模型。繼而，可以使用這些比對(duì)產(chǎn)生多肽的同源性模型，并且使用為了該目的而開(kāi)發(fā)的多種工具評(píng)估此類模型的準(zhǔn)確度。對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，數(shù)種工具和資源可用于檢索和生成結(jié)構(gòu)比對(duì)。例如，scop蛋白質(zhì)超家族已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行比對(duì)，并且那些比對(duì)是可訪問(wèn)的并且可下載的?？梢允褂枚喾N算法，如距離比對(duì)矩陣(holmandsander,1998,proteins33:88-96)或者組合擴(kuò)展(shindyalovandbourne,1998,proteinengineering11:739-747)比對(duì)兩個(gè)或更多個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)，并且可以另外地利用這些算法的執(zhí)行用感興趣的結(jié)構(gòu)查詢結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)以便發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如，holmandpark,2000,bioinformatics16:566-567)。在描述本發(fā)明的α-淀粉酶變體中，為了方便參考而改編以下所述的命名法。采用公認(rèn)的iupac單字母或三字母氨基酸縮寫(xiě)。取代：對(duì)于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，例如在位置226處的蘇氨酸被丙氨酸取代表示為“thr226ala”或者“t226a”。多個(gè)突變由加號(hào)(“+”)分開(kāi)，例如，“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”，代表分別在位置205和位置411處甘氨酸(g)用精氨酸(r)取代和絲氨酸(s)用苯丙氨酸(f)取代。缺失：對(duì)于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置181處的甘氨酸缺失表示為“ser181*”或者“s181*”。多個(gè)缺失由加號(hào)(“+”)分開(kāi)，例如“ser181*+thr182*”或“s181*+t182*”。插入：對(duì)于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，例如在位置195處的甘氨酸之后插入賴氨酸表示為“gly195glylys”或“g195gk”。指定多個(gè)氨基酸的插入[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2等]。例如，在位置195處的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸表示為“gly195glylysala”或“g195gka”。在此類情況下，通過(guò)將小寫(xiě)字母添加至在所插入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基之前的氨基酸殘基的位置編號(hào)中來(lái)對(duì)所插入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。在以上例子中，該序列因此將是：親本：變體：195195195a195bgg-k-a多個(gè)改變。包含多個(gè)改變的變體由加號(hào)(“+”)分開(kāi)，例如“arg170tyr+gly195glu”或者“r170y+g195e”，代表在位置170和位置195處的精氨酸和甘氨酸分別用酪氨酸和谷氨酸取代。不同改變。當(dāng)在一個(gè)位置可以引入不同的改變時(shí)，不同的改變用逗號(hào)分隔，例如“arg170tyr，glu”表示用酪氨酸或谷氨酸取代位置170處的精氨酸。因此，“tyr167gly，ala+arg170gly，ala”表示以下變體：“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”和“tyr167ala+arg170ala”。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及親本α-淀粉酶的變體，所述變體具有α-淀粉酶活性并且與seqidno:1具有至少89％的序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置處包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；并且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，并且其中所述變體與包含基序frsk的淀粉酶相比具有改進(jìn)的殘留活性(ra)。本發(fā)明提供了親本α-淀粉酶的變體，已經(jīng)顯示所述變體與已知的同源α-淀粉酶變體(即與seqidno:1具有小于89％序列同一性的主鏈的變體，且其中該變體具有與本發(fā)明相似的基序)相比具有顯著改進(jìn)的穩(wěn)定性。特別地，如從實(shí)施例2(與遠(yuǎn)距離α-淀粉酶(sp722)中相似變體的比較數(shù)據(jù))可以看出，本發(fā)明的變體具有顯著改進(jìn)的穩(wěn)定性。因此，不受理論的束縛，認(rèn)為預(yù)期缺失變體，如本發(fā)明的缺失變體不能顯示與例如sp722的已知缺失變體相同的穩(wěn)定性模式。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體與seqidno:1具有至少89％，如90％，如91％，如92％，如93％，如94％，如95％，如96％，如97％，如98％，如99％，但小于100％的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，seqidno:2的x2是s，g或t。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，x2是s，g或t。在另一個(gè)實(shí)施方案中，seqidno:2的x1是r，則seqidno:2的x2是g或t。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)x1是r時(shí)，x2是g或t。在另一個(gè)實(shí)施方案中，seqidno:2的x1是s，則seqidno:2的x2是s，g或t。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)x1是s時(shí)，x2是s，g或t。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，seqidno:2的x1為r，且seqidno:2的x2為g。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，x1為r，且x2為g。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，seqidno:2的x1為r，且seqidno:2的x2為t。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，x1為r，且x2為t。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，seqidno:2的x1為s，且seqidno:2的x2為t。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，x1為s，且x2為t。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，seqidno:2的x1為s，且seqidno:2的x2為g。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，x1為s，且x2為g。本發(fā)明的變體還可以包括在一個(gè)或多個(gè)(例如數(shù)個(gè))其它位置的一個(gè)或多個(gè)另外的修飾。氨基酸變化可以具有次要的性質(zhì)，即不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；通常為1至30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基端延伸，如氨基端甲硫氨酸殘基；高達(dá)20至25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或另一種功能促進(jìn)純化的小延伸(如多組氨酸段，抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。保守取代的例子為在下組之內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸，賴氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如h.neurathandr.l.hill,1979,于,theproteins,academicpress,newyork。常見(jiàn)的取代是ala/ser，val/ile，asp/glu，thr/ser，ala/gly，ala/thr，ser/asn，ala/val，ser/gly，tyr/phe，ala/pro，lys/arg，asp/asn，leu/ile，leu/val，ala/glu和asp/gly。或者，氨基酸變化具有使得改變多肽的物理化學(xué)特性的性質(zhì)。例如，氨基酸變化可以改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適ph等等?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域中已知的程序，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(cunninghamandwells,1989,science244:1081-1085)來(lái)鑒定多肽中的必需氨基酸。在后一種技術(shù)中，在分子中的每個(gè)殘基處引入單丙氨酸突變，并測(cè)試所得的突變分子的[酶]活性以鑒定對(duì)分子活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。還參見(jiàn)hiltonetal.,1996,j.biol.chem.271:4699-4708。酶活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用也可以通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析來(lái)進(jìn)行確定，如通過(guò)以下技術(shù)，如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記，與假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變相結(jié)合來(lái)進(jìn)行確定。參見(jiàn)，例如devosetal.,1992,science255:306-312；smithetal.,1992,j.mol.biol.224:899-904；wlodaveretal.,1992,febslett.309:59-64。還可以從與相關(guān)多肽的比對(duì)推斷必需氨基酸的身份。因此，本發(fā)明的變體可以包括進(jìn)一步的修飾，如取代，插入和/或缺失。本發(fā)明的變體可以包括此類進(jìn)一步的修飾以獲得具有改進(jìn)的性能的變體，如改進(jìn)的清洗性能，改進(jìn)的液化特性和改進(jìn)的脫漿特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體中的進(jìn)一步修飾的數(shù)目為1至30，例如，1至20，例如1至10和1至5，如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)修飾。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的數(shù)目為1至20，如1至10，如1至5，如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)修飾。認(rèn)為本發(fā)明的變體可以通過(guò)進(jìn)一步的修改進(jìn)一步穩(wěn)定化和/或增強(qiáng)性能。特定的修飾可能與本發(fā)明的變體的穩(wěn)定性有關(guān)。在具體的實(shí)施方案中，變體進(jìn)一步包含在對(duì)應(yīng)于y242和f266的至少一個(gè)位置的取代，其中根據(jù)seqidno:2編號(hào)。在具體實(shí)施方案中，位置y242的取代為y242f，而位置f266的取代為f266y。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體包含y242f和f266y取代兩者。在具體實(shí)施方案中，除了本文描述的基序之外，本發(fā)明的變體還由取代y242f或f266y，或取代y242f和f266y兩者組成。本發(fā)明的變體還可以包含在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的s243和g475的位置中的至少一個(gè)取代。具體地，取代可以是s243q和g475k。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體包括以下修飾或由以下修飾組成：t182*+g183*+y242f+s243q+f266y+g475k，s181*+t182*+y242f+s243q+f266y+g475k，r180*+t182*+y242f+s243q+f266y+g475k，或者r180*+g183*+y242f+s243q+f266y+g475k，其中根據(jù)seqidno:2編號(hào)。在一個(gè)方面，親本α-淀粉酶具有與seqidno:1的多肽至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一個(gè)方面，親本α-淀粉酶的氨基酸序列與seqidno:1的多肽相差多達(dá)10個(gè)氨基酸，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)。在一個(gè)方面，親本α-淀粉酶具有與seqidno:2的多肽至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一個(gè)方面，親本α-淀粉酶的氨基酸序列與seqidno:2的多肽相差多達(dá)10個(gè)氨基酸，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)。在一個(gè)方面，親本α-淀粉酶具有與seqidno:3的多肽至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一個(gè)方面，親本α-淀粉酶的氨基酸序列與seqidno:3的多肽相差多達(dá)10個(gè)氨基酸，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)。在一個(gè)方面，親本α-淀粉酶包含seqidno:1，2或3的氨基酸序列或由seqidno:1，2或3的氨基酸序列組成。在另一方面，親本α-淀粉酶包含seqidno:1的氨基酸序列或由seqidno:1的氨基酸序列組成。在另一方面，親本α-淀粉酶包含seqidno:1的氨基酸1至485或由seqidno:1的氨基酸1至485組成。在另一方面，親本α-淀粉酶是seqidno:1的成熟多肽的片段，其含有至少100個(gè)氨基酸殘基，例如至少200個(gè)，至少300個(gè)，至少400個(gè)和至少450個(gè)氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，親本α-淀粉酶是seqidno:1的多肽的等位變體。在另一方面，親本α-淀粉酶包含seqidno:2的氨基酸序列或由seqidno:2的氨基酸序列組成。在另一方面，親本α-淀粉酶包含seqidno:2的氨基酸1至485或由seqidno:2的氨基酸1至485組成。在另一方面，親本α-淀粉酶是seqidno:2的成熟多肽的片段，其含有至少100個(gè)氨基酸殘基，例如至少200個(gè)，至少300個(gè)，至少400個(gè)和至少450個(gè)氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，親本α-淀粉酶是seqidno:2的多肽的等位變體。在另一方面，親本α-淀粉酶包含seqidno:3的氨基酸序列或由seqidno:3的氨基酸序列組成。在另一方面，親本α-淀粉酶包含seqidno:3的氨基酸1至485或由seqidno:3的氨基酸1至485組成。在另一方面，親本α-淀粉酶是seqidno:3的成熟多肽的片段，其含有至少100個(gè)氨基酸殘基，例如至少200個(gè)，至少300個(gè)，至少400個(gè)和至少450個(gè)氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，親本α-淀粉酶是seqidno:3的多肽的等位變體?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域公知的方法使用seqidno:1的多肽或其片段設(shè)計(jì)核酸探針，以從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼親本α-淀粉酶的dna。具體地，遵循標(biāo)準(zhǔn)southern印跡法程序，此類探針可以用于與感興趣的細(xì)胞的基因組dna或cdna雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。此類探針可以比整個(gè)序列短得多，但長(zhǎng)度應(yīng)該是至少15個(gè)，例如至少25個(gè)，至少35個(gè)，或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，例如至少200個(gè)核苷酸，至少300個(gè)核苷酸，至少400個(gè)核苷酸，至少500個(gè)核苷酸，至少600個(gè)核苷酸，至少700個(gè)核苷酸，至少800個(gè)核苷酸，或至少900個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。可以使用dna和rna探針兩者。通常標(biāo)記探針用于檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32p，3h，35s，生物素或親合素(avidin))。此類的探針包括在本發(fā)明中?？梢詫?duì)從此類其它菌株制備的基因組dna或cdna文庫(kù)篩選與上述探針雜交并編碼親本的dna。可以通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)分離來(lái)自此類其它菌株的基因組或其他dna。來(lái)自文庫(kù)的dna或分離的dna可以轉(zhuǎn)移并固定在硝酸纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑒定與seqidno:1或其子序列雜交的克隆或dna，該載體材料用于southern印跡。多肽可以是雜合多肽，其中一種多肽的區(qū)域融合于另一種多肽的區(qū)域的n末端或c末端。親本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽融合于本發(fā)明的多肽的n末端或c末端。通過(guò)將編碼另一種多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷酸來(lái)產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列，使得它們?cè)谧x碼框中，且融合多肽的表達(dá)在相同的啟動(dòng)子和終止子的控制下。也可以使用內(nèi)含肽(intein)技術(shù)構(gòu)建融合多肽，其中翻譯后創(chuàng)建融合多肽(cooperetal.,1993,emboj.12:2575-2583；dawsonetal.,1994,science266:776-779)。融合多肽可以在兩種多肽之間進(jìn)一步包括切割位點(diǎn)。在融合蛋白分泌時(shí)，該位點(diǎn)被切割，從而釋放出兩種多肽。切割位點(diǎn)的例子包括但不限于在以下文獻(xiàn)中公開(kāi)的位點(diǎn)：martinetal.,2003,j.ind.microbiol.biotechnol.3:568-576；svetinaetal.,2000,j.biotechnol.76:245-251；rasmussen-wilsonetal.,1997,appl.environ.microbiol.63:3488-3493；wardetal.,1995,biotechnology13:498-503；andcontrerasetal.,1991,biotechnology9:378-381；eatonetal.,1986,biochemistry25:505-512；collins-racieetal.,1995,biotechnology13:982-987；carteretal.,1989,proteins:structure,function,andgenetics6:240-248；和stevens,2003,drugdiscoveryworld4:35-48。親本α-淀粉酶可以從任何屬的微生物獲得。出于本發(fā)明的目的，如本文中結(jié)合給定的來(lái)源使用的，術(shù)語(yǔ)“從...獲得”應(yīng)意指由多核苷酸編碼的親本是由該來(lái)源或由其中已經(jīng)插入來(lái)自該來(lái)源的多核苷酸的菌株產(chǎn)生的。在一個(gè)方面，親本α-淀粉酶是細(xì)胞外分泌的。親本α-淀粉酶可以是細(xì)菌α-淀粉酶。例如，該親本可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽，如芽孢桿菌屬α-淀粉酶。在一個(gè)方面，親本是芽孢桿菌屬種ts-23α-淀粉酶，例如seqidno:1，2或3的α-淀粉酶。seqidno:1，2和3的α-淀粉酶以及其變體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法人工制造。在一個(gè)方面，變體具有與親本α-淀粉酶的氨基酸序列至少89％，如至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％同一性，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，但小于100％的序列同一性。本發(fā)明的變體可以具有與親本α-淀粉酶的氨基酸序列至少89％的序列同一性，并且包含許多修飾，如1至20個(gè)修飾，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20個(gè)。具體地，修飾的數(shù)目可以是1至10，如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)修飾。修飾的數(shù)目可以是1至5，如1，2，3，4或5個(gè)修飾。從實(shí)施例可以看出，與親本α-淀粉酶相比，本發(fā)明的變體已經(jīng)顯示出具有改進(jìn)的特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于所述親本α-淀粉酶，該變體具有改進(jìn)的穩(wěn)定性，如儲(chǔ)存穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性，洗滌劑中的穩(wěn)定性和螯合劑穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本α-淀粉酶相比變體具有改進(jìn)的化學(xué)穩(wěn)定性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“化學(xué)穩(wěn)定性”是指當(dāng)α-淀粉酶變體或親本在包含化學(xué)組分的組合物中時(shí)α-淀粉酶變體或親本的穩(wěn)定性?？梢砸耘c實(shí)施例中所示的相似的方式測(cè)定化學(xué)穩(wěn)定性，即將α-淀粉酶變體或親本在包含化學(xué)組分的組合物中在特定溫度，例如40攝氏度下孵育給定的一段時(shí)間，例如4小時(shí)，然后通過(guò)使用α-淀粉酶活性測(cè)定法確定殘留活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本α-淀粉酶相比，變體具有改進(jìn)的氧化穩(wěn)定性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“氧化穩(wěn)定性”是指當(dāng)α-淀粉酶變體或親本在包含氧化組分的組合物中時(shí)α-淀粉酶變體或親本的穩(wěn)定性?？梢砸耘c實(shí)施例中所示的相似的方式測(cè)定氧化穩(wěn)定性，即將α-淀粉酶變體或親本在包含氧化組分的組合物中在特定溫度，例如40攝氏度下孵育給定的一段時(shí)間，例如4小時(shí)，然后通過(guò)使用α-淀粉酶活性測(cè)定法確定殘留活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本α-淀粉酶相比，變體具有改善的ph穩(wěn)定性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“ph穩(wěn)定性”是指當(dāng)α-淀粉酶變體或親本在具有與可以作為α-淀粉酶的最適ph的ph相比改變的ph的組合物中時(shí)，α-淀粉酶變體或親本的穩(wěn)定性。可以以與實(shí)施例中所示的相似的方式測(cè)定ph穩(wěn)定性，即將α-淀粉酶變體或親本在具有與可以作為α-淀粉酶的天然ph的ph相比改變的ph概貌的組合物中在特定溫度，例如40攝氏度下孵育給定的一段時(shí)間，例如4小時(shí)，然后通過(guò)使用α-淀粉酶活性測(cè)定法確定殘留活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本α-淀粉酶相比，變體具有改進(jìn)的比活性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“比活性”是指通過(guò)使用如實(shí)施例中所述的α-淀粉酶比活性測(cè)定法測(cè)定的α-淀粉酶變體或親本的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本α-淀粉酶相比，變體在儲(chǔ)存條件下具有改善的穩(wěn)定性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“儲(chǔ)存穩(wěn)定性”和“儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性”是指當(dāng)α-淀粉酶變體或親本在制劑中時(shí)α-淀粉酶變體或親本的穩(wěn)定性?？梢砸耘c實(shí)施例中所示的相似的方式測(cè)定儲(chǔ)存穩(wěn)定性，即將組合物中的α-淀粉酶變體或親本在特定溫度，例如25攝氏度下孵育給定的一段時(shí)間，例如2小時(shí)，然后通過(guò)使用α-淀粉酶活性測(cè)定法確定殘留活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本α-淀粉酶相比，變體具有改善的底物穩(wěn)定性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“底物穩(wěn)定性”是指當(dāng)α-淀粉酶變體或親本α-淀粉酶在組合物，如洗滌劑組合物中時(shí)，α-淀粉酶變體或親本α-淀粉酶的穩(wěn)定性?？梢砸耘c實(shí)施例中所示的相似的方式測(cè)定底物穩(wěn)定性，即將組合物中的α-淀粉酶變體或親本在特定溫度，例如60攝氏度下孵育給定的一段時(shí)間，例如2小時(shí)，然后通過(guò)使用α-淀粉酶活性測(cè)定法確定殘留活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本α-淀粉酶相比，變體具有改善的熱活性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“熱活性”是指當(dāng)α-淀粉酶變體或親本α-淀粉酶暴露于例如熱應(yīng)激或熱變化時(shí)，α-淀粉酶變體或親本α-淀粉酶的活性?？梢砸耘c實(shí)施例中所示的相似的方式測(cè)定熱活性，即將α-淀粉酶變體或親本在升高的溫度，例如60攝氏度下孵育給定的一段時(shí)間，例如2小時(shí)，然后通過(guò)使用α-淀粉酶活性測(cè)定法確定殘留活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本α-淀粉酶相比，變體具有改善的熱穩(wěn)定性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定性”是指當(dāng)α-淀粉酶變體或親本在特定的高溫，如60攝氏度下測(cè)試或保留時(shí)，α-淀粉酶變體或親本的穩(wěn)定性。可以以與實(shí)施例中所示的相似的方式測(cè)定熱穩(wěn)定性，即將組合物中的α-淀粉酶變體或親本在升高的溫度，如60攝氏度的溫度下孵育給定的一段時(shí)間，例如24小時(shí)，然后通過(guò)使用α-淀粉酶活性測(cè)定法確定殘留活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本α-淀粉酶相比，變體具有改善的洗滌劑中的穩(wěn)定性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“洗滌劑中的穩(wěn)定性”是指當(dāng)α-淀粉酶變體或親本在洗滌劑組合物或制劑中時(shí)α-淀粉酶變體或親本的穩(wěn)定性?？梢砸耘c實(shí)施例中所示的相似的方式測(cè)定該穩(wěn)定性，即將洗滌劑組合物中的α-淀粉酶變體或親本在特定溫度，例如25攝氏度下孵育給定的一段時(shí)間，例如2小時(shí)，然后通過(guò)使用α-淀粉酶活性測(cè)定法確定殘留活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本α-淀粉酶相比，該變體具有改善的螯合劑穩(wěn)定性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，變體具有改善的穩(wěn)定性，其中通過(guò)phadebas測(cè)定法測(cè)定穩(wěn)定性。因此，可以通過(guò)包括以下步驟的測(cè)定法來(lái)確定改進(jìn)的穩(wěn)定性：在100mmbritton-robinson緩沖液中稀釋變體，并通過(guò)620nm處的分光光度法測(cè)量所得藍(lán)色溶液。本發(fā)明的變體的制備本發(fā)明還涉及用于獲得具有α-淀粉酶活性的變體的方法，包括向親本α-淀粉酶中引入選自對(duì)應(yīng)于seqidno:1的氨基酸序列的r180，s181，t182和g183的位置的兩個(gè)氨基酸的缺失，提供氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)，其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r時(shí)，則x2不是s，所述變體與包含基序frsk的淀粉酶相比具有改進(jìn)的殘留活性(ra)，并且其中所述變體具有α-淀粉酶活性；并且回收該變體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何誘變方法制備變體，如定點(diǎn)誘變，合成基因構(gòu)建，半合成基因構(gòu)建，隨機(jī)誘變，改組(shuffling)等。定點(diǎn)誘變是下述技術(shù)，其中將一個(gè)或多個(gè)(例如數(shù)個(gè))突變引入編碼親本α-淀粉酶的多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)限定位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)涉及使用包含期望的突變的寡核苷酸引物的pcr體外實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變。也可以通過(guò)盒式誘變體外進(jìn)行定點(diǎn)誘變，所述盒式誘變涉及由限制酶在包括編碼親本α-淀粉酶的多核苷酸的質(zhì)粒中的位點(diǎn)處切割并且隨后在多核苷酸中連接包含突變的寡核苷酸。通常，消化該質(zhì)粒與該寡核苷酸的限制酶是相同的，允許該質(zhì)粒的粘性末端以及插入片段彼此連接。參見(jiàn)，例如，schereranddavis,1979,proc.natl.acad.sci.usa76:4949-4955；和bartonetal.,1990,nucleicacidsres.18:7349-4966。還可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2004/0171154；storicietal.,2001,naturebiotechnol.19:773-776；krenetal.,1998,nat.med.4:285-290；和calissanoandmacino,1996,fungalgenet.newslett.43:15-16。任何定點(diǎn)誘變方法可用于本發(fā)明。存在可用于制備變體的許多可商購(gòu)的試劑盒。合成基因構(gòu)建需要體外合成設(shè)計(jì)的多核苷酸分子以編碼感興趣的多肽?；蚝铣煽梢岳枚喾N技術(shù)來(lái)進(jìn)行，如由tianetal.(2004,nature432:1050-1054)所述的基于多重微芯片的技術(shù)以及其中在光可編程的微流芯片上合成并組裝寡核苷酸的類似技術(shù)?？梢宰龀鰡蝹€(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組的已知方法進(jìn)行測(cè)試，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序，如由reidhaar-olsonandsauer,1988,science241:53-57；bowieandsauer,1989,proc.natl.acad.sci.usa86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625所公開(kāi)的那些。可以使用的其他方法包括易錯(cuò)pcr、噬菌體展示(例如，lowmanetal.,1991,biochemistry30:10832-10837；美國(guó)專利號(hào)5,223,409；wo92/06204)以及區(qū)域定向誘變(region-directedmutagenesis)(derbyshireetal.,1986,gene46:145；neretal.,1988,dna7:127)?？梢越M合誘變/改組方法與高通量自動(dòng)化篩選方法來(lái)檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(nessetal.,1999,naturebiotechnology17:893-896)。可以自宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的dna分子，并且使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)其進(jìn)行迅速測(cè)序。這些方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。通過(guò)組合合成基因構(gòu)建、和/或定點(diǎn)誘變、和/或隨機(jī)誘變、和/或改組的各方面來(lái)實(shí)現(xiàn)半合成基因構(gòu)建。半合成構(gòu)建以與pcr技術(shù)組合的下述方法為典型，所述方法利用合成的多核苷酸片段。因此，基因的限定區(qū)域可以從頭合成，而其他區(qū)域可以使用位點(diǎn)特異性誘變引物來(lái)擴(kuò)增，而還有其他區(qū)域可以經(jīng)受易錯(cuò)pcr或非易錯(cuò)pcr擴(kuò)增。然后，可以對(duì)多核苷酸子序列進(jìn)行改組。多核苷酸本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明變體的分離的多核苷酸。因此，本發(fā)明涉及編碼具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性的變體的多核苷酸，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)。核酸構(gòu)建體本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。因此，本發(fā)明涉及包含編碼變體的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述變體具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)。本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明變體的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)控制序列，該控制序列在與控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。因此，本發(fā)明涉及包含編碼變體的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述變體具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)，其中所述多核苷酸可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)控制序列，該控制序列在與控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。可以按多種方式操縱該多核苷酸以提供變體的表達(dá)。根據(jù)表達(dá)載體，多核苷酸在其插入載體中前的操縱可以是期望的或必需的。采用重組dna方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的?？刂菩蛄锌梢允菃?dòng)子，即由宿主細(xì)胞識(shí)別用于表達(dá)該多核苷酸的多核苷酸。啟動(dòng)子包含介導(dǎo)變體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是在宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及雜合型啟動(dòng)子，并且可以從編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。適合于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的例子是從下列各項(xiàng)獲得的啟動(dòng)子：解淀粉芽孢桿菌α-α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢桿菌α-α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penp)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)生麥α-淀粉酶(maltogenicalpha-amylase)基因(amym)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacb)、枯草芽孢桿菌xyla和xylb基因、蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)cryiiia基因(agaisseandlereclus,1994,molecularmicrobiology13:97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動(dòng)子(egonetal.,1988,gene69:301-315)，天藍(lán)色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)瓊脂糖酶(agarase)基因(daga)、和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(villa-kamaroffetal.,1978,proc.natl.acad.sci.usa75:3727-3731)、以及tac啟動(dòng)子(deboeretal.,1983,proc.natl.acad.sci.usa80:21-25)。另外的啟動(dòng)子描述于“usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于gilbertetal.,1980,scientificamerican242:74-94；以及sambrooketal.,1989，同上。串聯(lián)啟動(dòng)子的例子公開(kāi)于wo99/43835中。適合于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的例子是從下列各項(xiàng)的基因獲得的啟動(dòng)子：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶(aspergillusnidulansacetamidase)、黑曲霉(aspergillusniger)中性α-α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(aspergillusawamori)葡糖α-淀粉酶(glucoalpha-amylase)(glaa)、米曲霉(aspergillusoryzae)takaα-淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢菌(fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(wo96/00787)、鑲片鐮孢菌(fusariumvenenatum)淀粉葡糖苷酶(amyloglucosidase)(wo00/56900)、鑲片鐮孢菌daria(wo00/56900)、鑲片鐮孢菌quinn(wo00/56900)、米赫根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(trichodermareesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶i、里氏木霉纖維二糖水解酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iv、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉β-木糖苷酶，以及na2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自曲霉屬中性α-α-淀粉酶基因的經(jīng)修飾的啟動(dòng)子，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由曲霉屬丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)序列替代；非限制性例子包括來(lái)自黑曲霉中性α-α-淀粉酶的基因的經(jīng)修飾的啟動(dòng)子，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由構(gòu)巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)序列替代)；以及其突變型、截短型、以及雜合型啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從下列各項(xiàng)的基因獲得：釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(eno-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(gal1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(adh1、adh2/gap)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)、釀酒酵母金屬硫蛋白(cup1)、以及釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。romanosetal.,1992,yeast8:423-488描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用的啟動(dòng)子?？刂菩蛄羞€可以是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。將終止子序列可操作地連接至編碼該變體的多核苷酸的3’-末端?？梢允褂迷谒拗骷?xì)胞中具有功能的任何終止子。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從克勞氏芽孢桿菌(bacillusclausii)堿性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢桿菌α-α-淀粉酶(amyl)以及大腸桿菌(escherichiacoli)核糖體rna(rrnb)的基因獲得。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子從下列各項(xiàng)的基因中獲得：構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase)、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉takaα-淀粉酶以及尖鐮孢菌胰蛋白酶樣蛋白酶。用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素c(cyc1)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得。romanosetal.,1992,同上描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用的終止子?？刂菩蛄羞€可以是啟動(dòng)子下游且基因的編碼序列上游的mrna穩(wěn)定劑區(qū)(mrnastabilizerregion)，其增加基因的表達(dá)。合適的mrna穩(wěn)定劑區(qū)的例子從以下獲得：蘇云金芽孢桿菌cryiiia基因(wo94/25612)和枯草芽孢桿菌sp82基因(hueetal.,1995,journalofbacteriology177:3465-3471)?？刂菩蛄羞€可以是前導(dǎo)序列，一種對(duì)宿主細(xì)胞的翻譯而言重要的非翻譯mrna區(qū)域。將前導(dǎo)序列可操作地連接至編碼該變體的多核苷酸的5’末端。可以使用在宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列從米曲霉takaα-淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因獲得。適合于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列以下各項(xiàng)的基因中獲得：釀酒酵母烯醇化酶(eno-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子、和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(adh2/gap)?？刂菩蛄羞€可以是多聚腺苷酸化序列，即可操作地連接至變體編碼序列的3’-末端并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識(shí)別成將多腺苷酸殘基添加到所轉(zhuǎn)錄的mrna的信號(hào)的序列。可以使用在宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選多聚腺苷酸化序列從以下各項(xiàng)的基因中獲得：構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉takaα-淀粉酶以及尖鐮孢菌胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的多聚腺苷酸化序列描述于guoandsherman,1995,mol.cellularbiol.15:5983-5990控制序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼與變體的n末端連接的信號(hào)肽，并且指導(dǎo)變體進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路中。該多核苷酸的編碼序列的5’-末端可以固有地包含信號(hào)肽編碼序列，該信號(hào)肽編碼序列在翻譯閱讀框中與編碼該變體的編碼序列的區(qū)段天然地連接在一起?；蛘?，編碼序列的5’末端可包含對(duì)于編碼序列異源的信號(hào)肽編碼序列。外源信號(hào)肽編碼序列在編碼序列不天然地包含信號(hào)肽編碼序列時(shí)可為必需的?；蛘?，外源信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地置換天然信號(hào)肽編碼序列，以便增強(qiáng)變體的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)表達(dá)的變體進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌通路的任何信號(hào)肽編碼序列。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是從以下各項(xiàng)的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列：芽孢桿菌屬ncib11837生麥α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt、nprs、nprm)以及枯草芽孢桿菌prsa。simonenandpalva,1993,microbiologicalreviews57:109-137描述了另外的信號(hào)肽。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的信號(hào)肽編碼序列：黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、米曲霉takaα-淀粉酶、特異腐質(zhì)霉(humicolainsolens)纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶v、疏棉狀腐質(zhì)霉(humicolalanuginosa)脂肪酶以及米赫毛霉天冬氨酸蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽可以獲自以下項(xiàng)的基因：釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶。romanosetal.,1992，同上描述了其他有用的信號(hào)肽編碼序列?？刂菩蛄羞€可以是編碼位于變體的n末端處的前肽的前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下為酶原(zymogen))。多肽原通常是無(wú)活性的并且能夠通過(guò)前肽的催化或自催化切割從多肽原轉(zhuǎn)化為活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因獲得：枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(apre)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt)、嗜熱毀絲霉(myceliophthorathermophila)漆酶(wo95/33836)、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α-因子。在信號(hào)肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰該變體的n末端并且該信號(hào)肽序列定位成緊鄰該前肽序列的n末端。還可以期望添加相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)該變體的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的例子是響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激而使基因的表達(dá)開(kāi)啟或關(guān)閉的那些調(diào)節(jié)系統(tǒng)，包括調(diào)控化合物的存在。在原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、以及trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用adh2系統(tǒng)或gal1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖α-淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉takaα-α-淀粉酶啟動(dòng)子以及米曲霉葡糖α-淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其他例子是允許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控序列包括在甲氨蝶呤存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼該變體的多核苷酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體。因此，本發(fā)明涉及包含編碼變體的多核苷酸的表達(dá)載體，所述變體具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)。本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明變體的多核苷酸、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯停止信號(hào)的重組表達(dá)載體。因此，本發(fā)明涉及包含編碼變體的多核苷酸的表達(dá)載體，所述變體具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk；啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄和翻譯停止信號(hào)的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)。各種核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制性位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)處插入或取代編碼該變體的多核苷酸?；蛘?，該多核苷酸可以通過(guò)將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來(lái)表達(dá)。在產(chǎn)生該表達(dá)載體時(shí)，編碼序列位于該載體中，使得編碼序列與用于表達(dá)的合適的控制序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是可便利地經(jīng)受重組dna程序并且可引起多核苷酸表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可以包含任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘?，載體可以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)整合到基因組中并且與染色體一起復(fù)制的載體，所述載體已經(jīng)整合到所述染色體中。此外，可以使用單一載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒(其共同包含待導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的完整dna)，或轉(zhuǎn)座子。載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑(biocide)或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌性選擇性標(biāo)志物的例子是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗生素抗性(如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環(huán)素抗性)的標(biāo)志物。用于酵母宿主細(xì)胞的適合的標(biāo)志物包括但不限于ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1、以及ura3。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)志物包括但不限于amds(乙酰胺酶(acetamidase))、argb(鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(ornithinecarbamoyltransferase))、bar(草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricinacetyltransferase))、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niad(硝酸還原酶)、pyrg(乳清苷-5’磷酸脫羧酶)、sc(硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶)、以及trpc(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及其等同物。優(yōu)選在曲霉屬細(xì)胞中使用的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)bar基因。載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或載體在細(xì)胞中以不依賴于基因組的方式自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)元件。對(duì)于整合到宿主細(xì)胞基因組中，載體可以依靠編碼變體的多核苷酸序列或者用于通過(guò)同源或非同源重組整合到基因組中的載體的任何其他元件?；蛘撸d體可以包含額外的多核苷酸，用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組在染色體中的精確位置整合入宿主細(xì)胞的基因組中。為了增加在精確位置整合的可能性，整合的元件應(yīng)包含足夠數(shù)目的核酸，如100至10,000個(gè)堿基對(duì)、400至10,000個(gè)堿基對(duì)、以及800至10,000個(gè)堿基對(duì)，其與對(duì)應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，載體可以通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。對(duì)于自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包括使載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中發(fā)揮功能的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制基因(replicator)。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“復(fù)制基因”意指使得質(zhì)粒或載體可在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的例子是允許在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒pbr322、puc19、pacyc177、以及pacyc184的復(fù)制起點(diǎn)以及允許在芽孢桿菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的pub110、pe194、pta1060、以及pamβ1的復(fù)制起點(diǎn)。用于在酵母宿主細(xì)胞中使用的復(fù)制起點(diǎn)的例子是2微米復(fù)制起點(diǎn)、ars1、ars4、ars1與cen3的組合以及ars4與cen6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)有用的復(fù)制起點(diǎn)的例子是ama1和ans1(gemsetal.,1991,gene98:61-67；cullenetal.,1987,nucleicacidsres.15:9163-9175；wo00/24883)。ama1基因的分離和包含基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可以根據(jù)披露于wo00/24883中的方法來(lái)完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加變體的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過(guò)以下方法獲得：將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或通過(guò)包含可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)志物基因及多核苷酸，其中可通過(guò)在適當(dāng)?shù)倪x擇劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇包含選擇性標(biāo)志物基因的擴(kuò)增拷貝，且由此包含多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的(參見(jiàn)，例如sambrooketal.,1989，同上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明涉及包含編碼變體的多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述變體具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)。本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列的編碼本發(fā)明變體的多核苷酸，所述控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的變體的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明涉及宿主細(xì)胞，其包含編碼變體的多核苷酸，所述變體具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)，其中所述多核苷酸可操作地連接到指導(dǎo)變體產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)控制序列。將包括多核苷酸的構(gòu)建體或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，使得將構(gòu)建體或載體作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體維持，如早前所述。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上將取決于編碼變體的基因及其來(lái)源。宿主細(xì)胞可以是在重組產(chǎn)生變體中有用的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于芽孢桿菌屬、梭菌屬(clostridium)、腸球菌屬(enterococcus)、土芽孢桿菌屬(geobacillus)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(lactococcus)、海洋芽孢桿菌屬(oceanobacillus)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)和鏈霉菌屬(streptomyces)。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于彎曲桿菌屬(campylobacter)、大腸桿菌、黃桿菌屬(flavobacterium)、梭桿菌屬(fusobacterium)、螺桿菌屬(helicobacter)、泥桿菌屬(ilyobacter)、奈瑟球菌屬(neisseria)、假單胞菌屬(pseudomonas)、沙門(mén)菌屬(salmonella)和脲原體屬(ureaplasma)。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌(bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金芽孢桿菌的細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬的細(xì)胞，包括但不限于似馬鏈球菌(streptococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(streptococcusuberis)和馬鏈球菌獸瘟亞種(streptococcusequisubsp.zooepidemicus)的細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌細(xì)胞，包括但不限于不產(chǎn)色鏈霉菌(streptomycesachromogenes)、阿維鏈霉菌(streptomycesavermitilis)、天藍(lán)色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)以及淺青紫鏈霉菌(streptomyceslividans)細(xì)胞。將dna導(dǎo)入芽孢桿菌細(xì)胞中可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，changandcohen,1979,mol.gen.genet.168:111-115)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，youngandspizizen,1961,j.bacteriol.81:823-829,或dubnauanddavidoff-abelson,1971,j.mol.biol.56:209-221)、電穿孔(參見(jiàn)例如，shigekawaanddower,1988,biotechniques6:742-751)或接合(參見(jiàn)例如，koehlerandthorne,1987,j.bacteriol.169:5271-5278)。將dna導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，hanahan,1983,j.mol.biol.166:557-580))或電穿孔(參見(jiàn)例如，doweretal.,1988,nucleicacidsres.16:6127-6145)。將dna導(dǎo)入鏈霉菌屬細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見(jiàn)例如，gongetal.,2004,foliamicrobiol.(praha)49:399-405)、接合(參見(jiàn)例如，mazodieretal.,1989,j.bacteriol.171:3583-3585)、或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見(jiàn)例如，burkeetal.,2001,proc.natl.acad.sci.usa98:6289-6294)。將dna導(dǎo)入假單孢菌屬細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：電穿孔(參見(jiàn)例如，choietal.,2006,j.microbiol.methods64:391-397)或接合(參見(jiàn)例如，pinedoandsmets,2005,appl.environ.microbiol.71:51-57)?？梢酝ㄟ^(guò)天然感受態(tài)(參見(jiàn)例如，perryandkuramitsu,1981,infect.immun.32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，cattandjollick,1991,microbios68:189-207)、電穿孔(參見(jiàn)例如，buckleyetal.,1999,appl.environ.microbiol.65:3800-3804)或者接合(參見(jiàn)例如，clewell,1981,microbiol.rev.45:409-436))實(shí)現(xiàn)將dna導(dǎo)入鏈球菌細(xì)胞中。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的用于將dna導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的任何方法。宿主細(xì)胞還可以是真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、或真菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。如本文中使用的，“真菌”包括子囊菌門(mén)(ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(basidiomycota)、壺菌門(mén)(chytridiomycota)、和接合菌門(mén)(zygomycota)、以及卵菌門(mén)(oomycota)和全部有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(如由hawksworthetal.,in,ainsworthandbisby’sdictionaryofthefungi,8thedition,1995,cabinternational,universitypress,cambridge,uk中定義的)。真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。如本文中使用的，“酵母”包括產(chǎn)子嚢酵母(ascosporogenousyeas)(內(nèi)孢霉目(endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(fungiimperfecti)(芽孢綱(blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在將來(lái)可能有變化，出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)如biologyandactivitiesofyeast(skinner,passmore,anddavenport,editors,soc.app.bacteriol.symposiumseriesno.9,1980)中所述的進(jìn)行定義。酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬(candida)、漢遜酵母屬(hansenula)、克魯弗酵母屬(kluyveromyces)、畢赤酵母屬(pichia)、酵母屬(saccharomyces)、裂殖酵母屬(schizosaccharomyces)、或耶羅威亞酵母屬(yarrowia)細(xì)胞，例如乳酸克魯弗酵母(kluyveromyceslactis)、卡爾酵母(saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(saccharomyceskluyveri)、諾地酶母(saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(saccharomycesoviformis)、或解脂耶羅威亞酵母(yarrowialipolytica)細(xì)胞。真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌門(mén)(eumycota)和卵菌門(mén)的亞門(mén)的所有絲狀形式(如由hawksworthetal.,1995,見(jiàn)上文所定義)。絲狀真菌通常的特征在于由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲延伸，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母(如釀酒酵母)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽(budding)，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是枝頂孢霉屬(acremonium)、曲霉屬(aspergillus)、短梗霉屬(aureobasidium)、煙管菌屬(bjerkandera)、擬蠟菌屬(ceriporiopsis)、金孢子菌屬(chrysosporium)、鬼傘菌屬(coprinus)、革蓋菌屬(coriolus)、隱球菌屬(cryptococcus)、線黑粉酵母屬(filibasidium)、鐮孢菌屬(fusarium)、腐質(zhì)霉屬(humicola)、梨孢菌屬(magnaporthe)、毛霉屬(mucor)、毀絲霉屬(myceliophthora)、新美鞭菌屬(neocallimastix)、脈孢菌屬(neurospora)、擬青霉屬(paecilomyces)、青霉菌屬(penicillium)、平革菌屬(phanerochaete)、白腐菌屬(phlebia)、瘤胃壺菌屬(piromyces)、側(cè)耳屬(pleurotus)、裂褶菌屬(schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(thermoascus)、梭孢殼屬(thielavia)、彎頸霉屬(tolypocladium)、栓菌屬(trametes)、或木霉屬(trichoderma)的細(xì)胞。例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉(aspergillusawamori)、臭曲霉(aspergillusfoetidus)、煙曲霉(aspergillusfumigatus)、日本曲霉(aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)、黑刺煙管菌(bjerkanderaadusta)、干擬蠟菌(ceriporiopsisaneirina)、卡內(nèi)基擬蠟菌(ceriporiopsiscaregiea)、淺黃擬蠟孔菌(ceriporiopsisgilvescens)、潘諾希塔擬蠟菌(ceriporiopsispannocinta)、環(huán)帶擬蠟菌(ceriporiopsisrivulosa)、微紅擬蠟菌(ceriporiopsissubrufa)、蟲(chóng)擬蠟菌(ceriporiopsissubvermispora)、狹邊金孢子菌(chrysosporiuminops)、嗜角質(zhì)金孢子菌(chrysosporiumkeratinophilum)、盧克諾文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、糞狀金孢子菌(chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(chrysosporiumpannicola)、昆士蘭金孢子菌(chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌(chrysosporiumtropicum)、褐薄金孢子菌(chrysosporiumzonatum)、灰蓋鬼傘(coprinuscinereus)、毛革蓋菌(coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢菌(fusariumbactridioides)、谷類鐮孢菌(fusariumcerealis)、庫(kù)威鐮孢菌(fusariumcrookwellense)、大刀鐮孢菌(fusariumculmorum)、禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢菌(fusariumgraminum)、異孢鐮孢菌(fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢菌(fusariumnegundi)、尖鐮孢菌(fusariumoxysporum)、多枝鐮孢菌(fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢菌(fusariumroseum)、接骨木鐮孢菌(fusariumsambucinum)、膚色鐮孢菌(fusariumsarcochroum)、擬分枝孢鐮孢菌(fusariumsporotrichioides)、硫色鐮孢菌(fusariumsulphureum)、圓鐮孢菌(fusariumtorulosum)、擬絲孢鐮孢菌(fusariumtrichothecioides)、鑲片鐮孢菌(fusariumvenenatum)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉(myceliophthorathermophila)、粗糙鏈孢菌(neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉菌(penicilliumpurpurogenum)、黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、射脈菌(phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(pleurotuseryngii)、土生梭孢殼(thielaviaterrestris)、長(zhǎng)域毛栓菌(trametesvillosa)、變色栓菌(trametesversicolor)、哈茨木霉(trichodermaharzianum)、康寧木霉(trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(trichodermareesei)或綠色木霉(trichodermaviride)細(xì)胞。真菌細(xì)胞可以通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、以及細(xì)胞壁再生的過(guò)程以本身已知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的適合程序在ep238023,yeltonetal.,1984,proc.natl.acad.sci.usa81:1470-1474,和christensenetal.,1988,bio/technology6:1419-1422中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢菌屬物種的適合方法由malardieretal.,1989,gene78:147-156,和wo96/00787描述?？梢允褂糜扇缫韵挛墨I(xiàn)描述的程序轉(zhuǎn)化酵母：beckerandguarente,inabelson,j.n.andsimon,m.i.,editors,guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology,methodsinenzymology,volume194,pp182-187,academicpress,inc.,newyork；itoetal.,1983,j.bacteriol.153:163；和hinnenetal.,1978,proc.natl.acad.sci.usa75:1920。產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生變體的方法，其包括：(a)在適合于變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；并且(b)回收變體。因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生變體的方法，其包括(a)培養(yǎng)包含編碼變體的多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述變體具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)；并且(b)回收變體。使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生變體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。例如，可以通過(guò)搖瓶培養(yǎng)，或者在適合的培養(yǎng)基中并在允許變體表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、補(bǔ)料-分批發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域中已知的程序在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳和氮源及無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果變體被分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可以從培養(yǎng)基中直接回收變體。如果變體不被分泌，則可以從細(xì)胞裂解物中回收它。可以使用本領(lǐng)域已知的對(duì)這些變體特異的方法檢測(cè)這些變體。這些檢測(cè)方法包括但不限于特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測(cè)定法來(lái)確定變體的活性。可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收變體。例如，可以通過(guò)常規(guī)程序從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收變體，這些常規(guī)程序包括但不限于收集、離心、過(guò)濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種程序來(lái)純化變體，以獲得基本上純的變體，這些程序包括但不限于層析(例如，離子交換、親和力、疏水性、色譜聚焦、以及尺寸排阻)、電泳程序(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page、或萃取(參見(jiàn)，例如proteinpurification,jansonandryden,editors,vchpublishers,newyork,1989)。在一個(gè)替代方面，不回收變體，而是將表達(dá)變體的本發(fā)明的宿主細(xì)胞用作變體的來(lái)源。本發(fā)明的組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的變體的組合物。因此，本發(fā)明涉及包含變體的組合物，所述變體具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)。優(yōu)選地，組合物富含此類變體。術(shù)語(yǔ)“富集”意指組合物的α-淀粉酶活性已經(jīng)增加，例如以1.1的富集因子增加。組合物可包含變體作為主要酶促組分，例如單組分組合物?；蛘?，組合物可以包括多種酶促活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶(carbohydrase)、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶(alpha-glucosidase)、β-葡糖苷酶、鹵代過(guò)氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶(phytase)、多酚氧化酶(polyphenoloxidase)、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。另外的酶可以通過(guò)例如屬于以下屬的微生物產(chǎn)生：曲霉屬，例如棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(aspergillusawamori)、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢菌屬，例如桿孢狀鐮孢菌(fusariumbactridioides)、禾谷鐮孢菌、庫(kù)威鐮孢菌、大刀鐮孢菌、禾本科鐮孢菌、禾赤鐮孢菌、異孢鐮孢菌、合歡木鐮孢菌、尖鐮孢菌、多枝鐮孢菌、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢菌、膚色鐮孢菌、硫色鐮孢菌、圓鐮孢菌、擬絲孢鐮孢菌或鑲片鐮孢菌；腐質(zhì)霉屬，例如特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，例如哈次木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉。組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備，并可以是液體或干組合物的形式。例如，組合物可以處于顆粒或微顆粒的形式?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法將變體穩(wěn)定化。可以通過(guò)加入含有一種或多種酶的單獨(dú)的添加劑或通過(guò)加入包含所有這些酶的組合添加劑將洗滌劑酶包括在洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑(即單獨(dú)的添加劑或組合添加劑)可以配制成例如顆粒，液體，漿體等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制劑是顆粒，特別是無(wú)塵顆粒，液體，特別是穩(wěn)定化的液體或漿體。因此，本發(fā)明還涉及洗滌劑添加劑，其包含本發(fā)明的變體，任選地為無(wú)塵顆粒，穩(wěn)定化的液體或受保護(hù)的酶的形式。因此，本發(fā)明涉及包含變體的洗滌劑添加劑，所述變體具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)，任選地，其中洗滌劑添加劑是無(wú)塵顆粒，穩(wěn)定化的液體或受保護(hù)的酶的形式。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的變體與一種或多種另外的清潔組合物組分組合的洗滌劑組合物。因此，本發(fā)明涉及包含變體的洗滌劑組合物，所述變體具有α-淀粉酶活性且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中所述變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk與一種或多種另外的清潔組合物組分組合的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)。另外的組分的選擇在技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)，并且包括常規(guī)的成分，包括以下列出的示例性的非限制性組分。對(duì)于紡織品護(hù)理，如洗衣，組分的選擇可以包括考慮有待清潔的紡織品的類型、染污的類型和/或程度、進(jìn)行清潔的溫度、以及洗滌劑產(chǎn)品的配制。盡管根據(jù)具體的功能性通過(guò)通用標(biāo)題對(duì)以下提及的組分進(jìn)行分類，但是這并不被解釋為限制，因?yàn)槿缂夹g(shù)人員將理解的，組分可以包括另外的功能性。因此，本申請(qǐng)還涉及組合物，其為清潔組合物。根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以包含洗滌劑組分，如表面活性劑，增潔劑，漂白系統(tǒng)，漂白活化劑，聚合物(polymers)和織物調(diào)色劑(fabrichueingagent)。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以例如針對(duì)包含本發(fā)明的酶與一種或多種另外的adw組合物組分的組合的adw(自動(dòng)洗碗)組合物。另外的組分的選擇在技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)，并且包括常規(guī)成分，包括以下列出的示例性非限制性組分。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及手動(dòng)或自動(dòng)洗碗洗滌劑組合物，其包含本發(fā)明的變體和任選地表面活性劑。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以例如配制為手動(dòng)或機(jī)器洗衣洗滌劑組合物，其包括適合于預(yù)處理沾污的織物的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物柔軟劑組合物，或配制成用于一般家用硬表面清潔操作的用途的洗滌劑組合物，或配制用于手動(dòng)或機(jī)器洗碗操作。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的變體的手動(dòng)或自動(dòng)洗衣洗滌劑組合物。在一個(gè)具體的方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的α-淀粉酶多肽的洗滌劑濃縮物/添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它酶，如蛋白酶，脂肪酶，過(guò)氧化物酶，另一種淀粉分解酶，例如另一種α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，生麥淀粉酶，cgt酶和/或纖維素酶，甘露聚糖酶(例如，來(lái)自novozymes，denmark的mannawaytm)，果膠酶，果膠裂合酶(pectinelyase)，角質(zhì)酶和/或漆酶。通常，所選擇的酶的性質(zhì)應(yīng)與所選擇的洗滌劑相容(即，ph最佳，與其它酶和非酶促成分的相容性等)，并且酶應(yīng)當(dāng)以有效量存在。蛋白酶：合適的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物起源的那些。優(yōu)選微生物起源。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶(subtilisins)，特別是來(lái)源于芽孢桿菌的那些，例如枯草桿菌蛋白酶novo，枯草桿菌蛋白酶carlsberg，枯草桿菌蛋白酶309，枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于wo89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如，豬或牛起源的)和wo89/06270和wo94/25583中描述的鐮孢菌屬(fusarium)蛋白酶。有用的蛋白酶的例子是wo92/19729，wo98/20115，wo98/20116和wo98/34946中描述的變體，特別是在一個(gè)或多個(gè)以下位置具有取代的變體：27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274。優(yōu)選的市售蛋白酶包括(seqidno:3)，和(來(lái)自novozymesa/s),maxacal,purafect(genencorinternationalinc.)。脂肪酶：合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌起源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的脂肪酶的例子包括來(lái)自腐質(zhì)霉屬(同物異名嗜熱霉屬)的脂肪酶，例如如ep258068和ep305216中所述的來(lái)自疏棉狀腐質(zhì)霉(疏棉狀嗜熱霉(t.lanuginosus))或如wo96/13580中所述的來(lái)自特異腐質(zhì)霉，假單胞菌脂肪酶，例如來(lái)自產(chǎn)堿假單胞菌(p.alcaligenes)或擬產(chǎn)堿假單胞菌(p.pseudoalcaligenes)(ep218272)，洋蔥假單胞菌(p.cepacia)(ep331376)，施氏假單胞菌(p.stutzeri)(gb1,372,034)，熒光假單胞菌(p.fluorescens)，假單胞菌物種菌株sd705(wo95/06720和wo96/27002)，威斯康星假單胞菌(p.wisconsinensis)(wo96/12012)，芽孢桿菌脂肪酶，例如，來(lái)自枯草芽孢桿菌(dartoisetal.(1993),biochemicaetbiophysicaacta,1131:253-360)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(jp64/744992)或短小芽孢桿菌(wo91/16422)。其它例子是脂肪酶變體，例如wo92/05249，wo94/01541，ep407225，ep260105，wo95/35381，wo96/00292，wo95/30744，wo94/25578，wo95/14783，wo95/22615，wo97/04079和wo97/07202中描述的那些。優(yōu)選的市售脂肪酶包括lipolase<tm>和lipolaseultra<tm>(novozymesa/s)。淀粉酶：合適的淀粉酶(α和/或β)包括細(xì)菌或真菌起源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。淀粉酶包括例如從芽孢桿菌獲得的α-淀粉酶，例如gb1296,839中更詳細(xì)描述的地衣芽孢桿菌的特殊菌株。有用的α-淀粉酶的例子是wo94/02597，wo94/18314，wo96/23873和wo97/43424中描述的變體，特別是在以下一個(gè)或多個(gè)位置具有取代的變體：15,23,105,106,124,128,133,154,156,181,188,190,197,202,208,209,243,264,304,305,391,408,和444。市售的α-淀粉酶是duramyl<tm>,liquezymetm,termamyl<tm>,natalase<tm>,everest<tm>,fungamyl<tm>和ban<tm>,amplify<tm>,amplifyprime<tm>,stainzyme<tm>,stainzymeplus<tm>(novozymesa/s),preferenzs100,preferenzs110,preferenzs1000(seqidno:11),excellenzs110,excellenzs1000,excellenzs2000,rapidase<tm>和purastar<tm>(來(lái)自genencorinternationalinc.)。纖維素酶：合適的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌起源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。合適的纖維素酶包括來(lái)自芽孢桿菌屬，假單胞菌屬，腐質(zhì)霉屬，鐮孢菌屬，梭孢殼屬，頂孢霉屬的纖維素酶，例如us4,435,307，us5,648,263，us5,691,178，us5,776,757和wo89/09259中公開(kāi)的特異腐質(zhì)霉，嗜熱毀絲霉和尖鐮孢菌產(chǎn)生的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶是具有顏色護(hù)理益處的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的例子是ep0495257，ep0531372，wo96/11262，wo96/29397，wo98/08940中描述的纖維素酶。其它例子是纖維素酶變體，如wo94/07998，ep0531315，us5,457,046，us5,686,593，us5,763,254，wo95/24471，wo98/12307和pct/dk98/00299中所述的那些。市售的纖維素酶包括和(novozymesa/s)，和(genencorinternationalinc.)和kac-(kaocorporation)。過(guò)氧化物酶/氧化酶：合適的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括植物，細(xì)菌或真菌起源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。有用的過(guò)氧化物酶的例子包括來(lái)自鬼傘屬(coprinus)(例如灰蓋鬼傘(c.cinereus))的過(guò)氧化物酶，及其變體，如wo93/24618，wo95/10602和wo98/15257中描述的那些。市售的過(guò)氧化物酶包括(novozymesa/s)。卵磷脂酶(lechinases)/β-葡聚糖酶：合適的卵磷脂酶包括細(xì)菌或真菌起源的那些。它們可以是化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的。有用的β-葡聚糖酶的例子包括wo2015/144824(novozymesa/s)和wo99/06516(henkelkgaa)中描述的那些。可以通過(guò)加入含有一種或多種酶的單獨(dú)的添加劑或通過(guò)加入包含所有這些酶的組合添加劑將洗滌劑酶包括在洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑(即單獨(dú)的添加劑或組合添加劑)可以配制成例如顆粒，液體，漿體等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制劑是顆粒，特別是無(wú)塵顆粒，液體，特別是穩(wěn)定化的液體，或漿體。無(wú)塵顆粒例如可以如在us4,106,991和4,661,452中所公開(kāi)的那樣產(chǎn)生并且可以任選地通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法包被。蠟質(zhì)涂層材料的例子是平均摩爾重量1000至20000的聚(環(huán)氧乙烷)(poly(ethyleneoxide))產(chǎn)物(聚乙二醇，peg)；具有16至50個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚(ethoxylatednonyl-phenol)；乙氧基化脂肪醇(ethoxylatedfattyalcohol)，其中醇包含12至20個(gè)碳原子并且其中存在15至80個(gè)環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸甘油單酯和甘油二酯和甘油三酯。適用于通過(guò)流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜涂層材料的例子在gb1483591中給出。液體酶制品可以例如通過(guò)根據(jù)已確立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而穩(wěn)定化。受保護(hù)的酶可以根據(jù)ep238,216中公開(kāi)的方法來(lái)制備。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如條(bar)，片劑(tablet)，粉末(powder)，顆粒(granule)，糊劑(paste)或液體。液體洗滌劑可以是水性的，通常含有高達(dá)70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑，或非水性的。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，其可以是非離子型的，包括半極性和/或陰離子型和/或陽(yáng)離子型和/或兩性離子型。表面活性劑通常以按重量計(jì)0.1％至60％的水平存在。當(dāng)包含在其中時(shí)，洗滌劑通常包含約1％至約40％的陰離子型表面活性劑，如直鏈烷基苯磺酸鹽(alkylbenzenesulfonate)，α-烯烴磺酸鹽(alpha-olefinsulfonate)，烷基硫酸鹽(alkylsulfate)(脂肪醇硫酸鹽(fattyalcoholsulfate))，醇乙氧基硫酸鹽(alcoholethoxysulfate)，仲鏈烷磺酸鹽(secondaryalkanesulfonate)，α-磺基脂肪酸甲酯(alpha-sulfofattyacidmethylester)，烷基或烯基琥珀酸或皂(soap)。當(dāng)包含在其中時(shí)，洗滌劑通常包含約0.2％至約40％的非離子型表面活性劑，如醇乙氧基化物(alcoholethoxylate)，壬基酚乙氧基化物(nonyl-phenolethoxylate)，烷基多糖苷(alkylpolyglycoside)，烷基二甲基胺氧化物(alkyldimethylamine-oxide)，乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanol-amide)，脂肪酸單乙醇酰胺(fattyacidmono-ethanolamide)，多羥基烷基脂肪酸酰胺(polyhydroxyalkylfattyacidamide)，或葡糖胺的n-?；鵱-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)”)。洗滌劑可以包含0-65％的洗滌劑增潔劑或絡(luò)合劑如mgda，glda，沸石，二磷酸鹽，三磷酸鹽，膦酸鹽(phosphonate)，碳酸鹽，檸檬酸鹽，次氮基三乙酸(nitrilotriaceticacid)，乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)，二乙烯三胺五乙酸(diethylenetri-aminepen-taaceticacid)，烷基或烯基琥珀酸，可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(layeredsilicates)(例如來(lái)自hoechst的sks-6)。洗滌劑可以包含一種或多種聚合物。例子是羧甲基纖維素，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯基吡啶-n-氧化物)(poly(vinylpyridine-n-oxide))，聚(乙烯基咪唑)(poly(vinylimidazole))，聚羧酸鹽(polycarboxylates)如磺化聚合物(sulfonatedpolymers)，聚丙烯酸酯(polyacrylates)，馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯(laurylmethacrylate)/丙烯酸共聚物。洗滌劑可以含有漂白系統(tǒng)，其可以包含h2o2源，如過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽，其可以與形成過(guò)酸的漂白活化劑如漂白催化劑(例如基于mn或基于co的，四乙?；叶坊蛉甚；趸交撬猁}(nonanoyloxybenzenesulfonate))組合?；蛘?，漂白系統(tǒng)可以包括過(guò)氧酸，例如酰胺，酰亞胺(imide)或砜型。本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶可以使用常規(guī)的穩(wěn)定劑來(lái)穩(wěn)定化，例如多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲?；交鹚幔医M合物可以如例如wo92/19709和wo92/19708中所述配制。洗滌劑還可以含有其它常規(guī)洗滌劑成分，如例如織物調(diào)理劑(fabricconditioner)，包括粘土(clays)，泡沫增效劑(foamboosters)，抑泡劑(sudssuppressor)，防蝕劑(anti-corrosionagent)，污垢懸浮劑(soil-suspendingagent)，抗污垢再沉積劑(anti-soilre-depositionagent)，染料，殺菌劑，熒光增白劑，助水溶劑(hydrotropes)，晦暗抑制劑(tarnishinhibitor)或香料(perfumes)。助水溶劑是如下化合物，其在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非極性環(huán)境中溶解極性物質(zhì))。典型地，助水溶劑同時(shí)具有親水的和疏水的特征(如從表面活性劑已知的所謂兩親特性)；然而，助水溶劑的分子結(jié)構(gòu)一般并不有利于自發(fā)自聚集，參見(jiàn)例如由hodgdonandkaler(2007),currentopinionincolloid&interfacescience12:121-128綜述的。助水溶劑并不顯示臨界濃度，高于所述臨界濃度就會(huì)發(fā)生自聚集，如對(duì)表面活性劑以及脂質(zhì)形成膠束、薄層或其他定義明確的中間相(meso-phase)找到的。相反，許多助水溶物顯示連續(xù)類型的聚集過(guò)程，其中聚集物的大小隨著濃度增加而增長(zhǎng)。然而，許多助水溶劑改變了包括極性和非極性特征的物質(zhì)的系統(tǒng)(包括水、油、表面活性劑、和聚合物的混合物)的相行為、穩(wěn)定性、和膠體特性。經(jīng)典地，在從制藥、個(gè)人護(hù)理、食品至技術(shù)應(yīng)用的行業(yè)間使用助水溶劑。助水溶劑在洗滌劑組合物中的使用允許例如更濃的表面活性劑配制(如在通過(guò)去除水而壓縮液體洗滌劑的過(guò)程中一樣)而不引起不希望的現(xiàn)象，如相分離或高粘度。洗滌劑組合物可以包含按重量計(jì)約0-65％，如約5％至約50％的洗滌劑增潔劑或共增潔劑(co-builder)或其混合物。在洗碗洗滌劑中，增潔劑的水平典型地是40％-65％、特別地50％-65％。增潔劑和/或共增潔劑可以特別地是與ca和mg形成水溶性絡(luò)合物的絡(luò)合劑。可以利用本領(lǐng)域中已知的用于在洗衣/adw/硬表面清潔洗滌劑中使用的任何增潔劑和/或共增潔劑。增潔劑的非限制性例子包括沸石(zeolites)、二磷酸鹽(焦磷酸鹽)、三磷酸鹽，如三磷酸鈉(stp或stpp)、碳酸鹽如碳酸鈉、可溶性硅酸鹽如偏硅酸鈉(sodiummetasilicate)、層狀硅酸鹽(例如來(lái)自hoechst的sks-6)、乙醇胺如2-氨基乙-1-醇(mea)、二乙醇胺(dea，也稱為2,2’-亞氨基二乙-1-醇)、三乙醇胺(tea，也稱為2,2’,2”-次氮基三乙-1-醇)、以及(羧甲基)菊粉((carboxymethyl)inulin)(cmi)及其組合。洗滌劑可以包含按重量計(jì)0-30％，如約1％至約20％的漂白系統(tǒng)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知用于洗衣/adw/硬表面清潔洗滌劑中的任何漂白系統(tǒng)。適合的漂白系統(tǒng)組分包括漂白催化劑、光漂白劑、漂白活化劑、過(guò)氧化氫源如過(guò)碳酸鈉、過(guò)硼酸鈉和過(guò)氧化氫―尿素(1:1)、預(yù)成型過(guò)酸(preformedperacid)及其混合物。合適的預(yù)成型過(guò)酸包括但不限于過(guò)氧羧酸(peroxycarboxylicacid)及鹽、二過(guò)氧二羧酸(diperoxydicarboxylicacid)、過(guò)亞氨酸(perimidicacid)及鹽、過(guò)氧單硫酸(peroxymonosulfuricacid)及鹽(例如oxone(r))及其混合物。漂白系統(tǒng)的非限制性例子包括基于過(guò)氧化物的漂白系統(tǒng)，其可以包括例如與過(guò)酸形成漂白活化劑組合的無(wú)機(jī)鹽，包括堿金屬鹽，如過(guò)硼酸鹽(通常是單水合物或四水合物)、過(guò)碳酸鹽、過(guò)硫酸鹽、過(guò)磷酸鹽、過(guò)硅酸鹽的鈉鹽。術(shù)語(yǔ)漂白活化劑在此意指與過(guò)氧化氫反應(yīng)以經(jīng)由過(guò)水解反應(yīng)(perhydrolysis)形成過(guò)酸的化合物。如此形成的過(guò)酸構(gòu)成活化的漂白劑。有待在此使用的合適漂白活化劑包括屬于酯、酰胺、酰亞胺或酸酐類別的那些。合適的例子是四乙?；叶?taed)、4-[(3,5,5-三甲基己?；?氧基]苯-1-磺酸鈉(isonobs)、4-(十二?；趸?苯-1-磺酸鹽(lobs)、4-(癸?；趸?苯-1-磺酸鹽、4-(癸?；趸?苯甲酸鹽(dobs或doba)、4-(壬?；趸?苯-1-磺酸鹽(nobs)和/或披露于wo98/17767中的那些。感興趣的漂白活化劑的具體家族披露于ep624154中并且在所述家族中特別優(yōu)選的是乙酰檸檬酸三乙酯(acetyltriethylcitrate，atc)。atc或短鏈甘油三酯(如三醋汀)具有以下優(yōu)點(diǎn)，它是環(huán)境友好的。此外，乙酰檸檬酸三乙酯和三醋汀在存儲(chǔ)時(shí)在產(chǎn)品中具有良好的水解穩(wěn)定性，并且是有效的漂白活化劑。最后，atc是多功能的，因?yàn)樵谶^(guò)水解反應(yīng)中釋放的檸檬酸鹽可以作為增潔劑起作用?；蛘撸紫到y(tǒng)可以包括例如酰胺、酰亞胺、或砜型的過(guò)氧酸。漂白系統(tǒng)還可以包括過(guò)酸，如6-(苯二甲酰亞氨基)過(guò)己酸(6-(phthalimido)peroxyhexanoicacid，pap)。漂白系統(tǒng)還可以包括漂白催化劑。在一些實(shí)施方案中，漂白組分可以是選自下組的有機(jī)催化劑：具有下式的有機(jī)催化劑：(iii)及其混合物；其中每個(gè)r1獨(dú)立地是包含從9到24個(gè)碳的支鏈烷基或包含從11到24個(gè)碳的直鏈烷基，優(yōu)選地每個(gè)r1獨(dú)立地是包含從9到18個(gè)碳的支鏈烷基或包含從11到18個(gè)碳的直鏈烷基，更優(yōu)選地每個(gè)r1獨(dú)立地選自下組：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、異壬基、異癸基、異十三烷基以及異十五烷基。其他示例性漂白系統(tǒng)描述于例如wo2007/087258、wo2007/087244、wo2007/087259、ep1867708(維生素k)以及wo2007/087242中。適合的光漂白劑可以例如是磺化鋅(sulfonatedzinc)或酞菁鋁(aluminiumphthalocyanines)。優(yōu)選地，除了漂白催化劑、特別是有機(jī)漂白催化劑以外，漂白組分還包括過(guò)酸源。過(guò)酸源可以選自(a)預(yù)成型的過(guò)酸；(b)過(guò)碳酸鹽、過(guò)硼酸鹽或過(guò)硫酸鹽(過(guò)氧化氫源)，優(yōu)選與漂白活化劑組合；和(c)過(guò)水解酶以及酯，用于在紡織品或硬表面處理步驟中在水的存在下原位形成過(guò)酸。洗滌劑可以包含按重量計(jì)0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何聚合物。聚合物可以作為如以上提到的共增潔劑起作用，或可以提供抗再沉積、纖維保護(hù)、污垢釋放、染料轉(zhuǎn)移抑制、油污清潔和/或消泡特性。一些聚合物可以具有多于一種的以上提到的特性和/或多于一種的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纖維素(cmc)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯吡咯烷酮)(pvp)、聚(乙二醇)或聚(環(huán)氧乙烷)(peg)、乙氧基化的聚(亞乙基亞胺)、羧甲基菊粉(cmi)、和聚羧化物(polycarboxylate)，如paa、paa/pma、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修飾cmc(hm-cmc)和硅酮、對(duì)苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(對(duì)苯二甲酸乙二酯)(poly(ethyleneterephthalate))和聚(氧乙烯對(duì)苯二甲酸酯)(poly(oxyetheneterephthalate))的共聚物(pet-poet)、pvp、聚(乙烯基咪唑)(pvi)、聚(乙烯吡啶-n-氧化物)(pvpo或pvpno)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(pvpvi)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯(sulfonatedpolycarboxylates)、聚環(huán)氧乙烷(polyethyleneoxide)和聚環(huán)氧丙烷(peo-ppo)以及乙氧基硫酸二季銨鹽(diquaterniumethoxysulfate)。其他示例性聚合物披露于例如wo2006/130575中。也考慮了以上提到的聚合物的鹽。本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括織物調(diào)色劑，如染料或色素，其當(dāng)配制在洗滌劑組合物中時(shí)可以沉積在織物上，此時(shí)所述織物包括所述洗滌劑組合物的洗液接觸，并且因此通過(guò)可見(jiàn)光的吸收/反射改變所述織物的色彩。熒光增白劑發(fā)射至少某種可見(jiàn)光。相比之下，織物調(diào)色劑改變表面的色彩，因?yàn)樗鼈兾湛梢?jiàn)光光譜的至少一部分。合適的織物調(diào)色劑包括染料和染料-粘土軛合物(conjugates)，并且還可以包括色素。合適的染料包括小分子染料和聚合物染料。合適的小分子染料包括選自下組的小分子染料：落入顏色直接藍(lán)、直接紅、直接紫、酸性藍(lán)、酸性紅、酸性紫、堿性藍(lán)、堿性紫和堿性紅、或其混合物的索引(colourindex)(c.i.)分類的染料，例如如描述于wo2005/03274、wo2005/03275、wo2005/03276和ep1876226中(將其通過(guò)引用而特此結(jié)合)。洗滌劑組合物優(yōu)選包括從約0.00003wt％至約0.2wt％、從約0.00008wt％至約0.05wt％、或甚至從約0.0001wt％至約0.04wt％的織物調(diào)色劑。組合物可以包括從0.0001wt％至0.2wt％的織物調(diào)色劑，當(dāng)組合物處于單位劑量袋的形式時(shí)，這可以是特別優(yōu)選的。合適的調(diào)色劑還披露于例如wo2007/087257和wo2007/087243中。目前在洗滌劑組合物中考慮任何酶，特別是本發(fā)明的α-淀粉酶多肽，可以以對(duì)應(yīng)于每升洗液0.01-100mg酶蛋白的量加入，優(yōu)選每升洗液0.05-5mg的酶蛋白，特別是每升洗液0.1-1mg酶蛋白。另外，本發(fā)明的α-淀粉酶多肽還可以摻入wo2006/002643中公開(kāi)的洗滌劑制劑中，其作為參考文獻(xiàn)并入本文。用途本申請(qǐng)還涉及使用本發(fā)明的變體的方法。用途可以在洗滌劑中，具體是洗衣洗滌劑組合物和洗碗洗滌劑組合物中。因此，本發(fā)明涉及親本α-淀粉酶的變體的用途，其中變體具有α-淀粉酶活性并且與seqidno:1具有至少89％序列同一性，其中變體在對(duì)應(yīng)于seqidno:2的氨基酸180至183的位置包含氨基酸基序fx1x2k(seqidno:4)；其中x1是r或s；且x2可以選自a，r，n，d，c，e，q，g，h，i，l，k，m，f，p，s，t，w，y和v，條件是當(dāng)x1是r，則x2不是s，與含有基序frsk的淀粉酶相比，所述變體具有改進(jìn)的殘留活性(ra)。因此，本發(fā)明提供了本發(fā)明的親本的變體或組合物在家用或工業(yè)清潔過(guò)程中的用途。具體地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的變體在洗衣，洗碗，例如自動(dòng)或手動(dòng)洗碗，硬表面清潔，工業(yè)和機(jī)構(gòu)清潔，紡織品退漿，淀粉改性，淀粉液化，糖化，飼料，烘烤或釀造中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，用途是織物的清潔，例如洗衣。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用途是陶瓷，塑料或玻璃材料的清潔，例如洗碗。因此，本發(fā)明的α-淀粉酶多肽作為清洗、洗碗和硬表面清潔洗滌劑組合物中的組分(在家用或工業(yè)背景中)是適用的。本發(fā)明的α-淀粉酶變體擁有允許多種其它工業(yè)應(yīng)用的有價(jià)值的性質(zhì)。例如，本發(fā)明的α-淀粉酶多肽可用于淀粉處理，尤其是淀粉轉(zhuǎn)化，特別是淀粉的液化(參見(jiàn)例如us3,912,590，ep專利申請(qǐng)?zhí)?52730和63909，wo99/19467，和wo96/28567，所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文)。還考慮了用于淀粉轉(zhuǎn)化目的的組合物，除本發(fā)明的變體外，所述組合物還可以包含葡糖淀粉酶，支鏈淀粉酶(pullulanase)和其它α-淀粉酶。此外，本發(fā)明的α-淀粉酶變體還特別有用于生產(chǎn)甜味劑和乙醇(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,231,017，其通過(guò)引用并入本文)，例如來(lái)自淀粉或全谷物的燃料，飲用和工業(yè)乙醇。本發(fā)明的α-淀粉酶變體還可用于紡織品，織物和衣物的脫漿(參見(jiàn)例如wo95/21247，美國(guó)專利4,643,736，ep119,920，其通過(guò)引用并入本文)，啤酒制造或釀造，紙漿和紙生產(chǎn)。淀粉轉(zhuǎn)化例如在美國(guó)專利號(hào)3,912,590和ep專利公開(kāi)號(hào)252,730和63,909(其通過(guò)引用并入本文)中描述了常規(guī)淀粉轉(zhuǎn)化過(guò)程，如液化和糖化過(guò)程。在一個(gè)實(shí)施方案中，將淀粉降解成較低分子量碳水化合物組分如糖或脂肪替代物(fatreplacer)的淀粉轉(zhuǎn)化過(guò)程包括脫支(debranching)步驟。在將淀粉轉(zhuǎn)化為糖的情況下，淀粉被解聚。此類解聚過(guò)程可以由預(yù)處理步驟和兩個(gè)或三個(gè)連續(xù)的處理步驟(也就是液化過(guò)程，糖化過(guò)程，和依賴于期望的最終產(chǎn)物，任選地異構(gòu)化過(guò)程)組成。(i)天然(native)淀粉的預(yù)處理天然淀粉由微觀顆粒組成，所述微觀顆粒在室溫下不溶于水。當(dāng)加熱水性淀粉漿體時(shí)，顆粒膨脹并最終破裂，將淀粉分子分散到溶液中。在此“凝膠化(gelatinization)”過(guò)程中，粘度急劇增加。由于在典型的工業(yè)過(guò)程中固體水平為30-40％，必須使淀粉變薄或“液化”，以便其可以處理?，F(xiàn)今這種粘度降低主要通過(guò)酶降解來(lái)獲得。(ii)液化在液化步驟期間，α-淀粉酶將長(zhǎng)鏈淀粉降解成支鏈和線性較短的單元(麥芽糖糊精(maltodextrins))。液化過(guò)程在105-110℃下進(jìn)行5至10分鐘，隨后在95℃下進(jìn)行1-2小時(shí)。ph位于5.5和6.2之間。為了確保在這些條件下的最佳酶穩(wěn)定性，加入1mm鈣(40ppm游離鈣離子)。在該處理之后，液化淀粉將具有10-15的“右旋糖當(dāng)量”(dextroseequivalent，de)。(iii)糖化在液化過(guò)程之后，通過(guò)加入葡糖淀粉酶(例如amg)和脫支酶(debranchingenzyme)，如異淀粉酶(isoamylase)(美國(guó)專利號(hào)4,335,208)或支鏈淀粉酶(例如promozymetm)(美國(guó)專利號(hào)4,560,651)，將麥芽糖糊精轉(zhuǎn)化成右旋糖。在此步驟之前，將ph降低至低于4.5的值，保持高溫(高于95℃)以使液化α-淀粉酶滅活以減少不能通過(guò)脫支酶適當(dāng)水解的稱為“潘糖前體”的短寡糖的形成。將溫度降至60℃，并且加入葡糖淀粉酶和脫支酶。糖化過(guò)程進(jìn)行24-72小時(shí)。通常，當(dāng)在液化步驟之后使α-淀粉酶變性時(shí)，約0.2-0.5％的糖化產(chǎn)物是不能被支鏈淀粉酶降解的支鏈三糖6<2>-α-葡糖基麥芽糖(潘糖)。如果在糖化期間存在來(lái)自液化步驟的活性淀粉酶(即，不變性)，則該水平可高達(dá)1-2％，這是非常不希望的，因?yàn)樗@著降低了糖化產(chǎn)率。當(dāng)使用淀粉酶時(shí)，糖化最佳地在約30℃至約75℃，例如45℃至75℃或47℃至74℃的溫度范圍進(jìn)行。糖化可以在約ph3至約ph7，例如ph3.0至ph7.5，ph3.5至ph5.5，ph3.5，ph3.8或ph4.5的ph范圍內(nèi)進(jìn)行。(iv)異構(gòu)化當(dāng)期望的最終糖產(chǎn)品是例如高果糖糖漿時(shí)，右旋糖糖漿可以轉(zhuǎn)化成果糖。在糖化過(guò)程之后，將ph增加到6-8范圍內(nèi)的值，優(yōu)選ph7.5，并且通過(guò)離子交換除去鈣。然后，使用例如固定化的葡萄糖異構(gòu)酶(例如sweetzyme<tm>it)將右旋糖糖漿轉(zhuǎn)化成高果糖糖漿。乙醇生產(chǎn)一般而言，從全谷物的酒精生產(chǎn)(乙醇)可分為4個(gè)主要步驟-研磨-液化-糖化-發(fā)酵(i)研磨為了打開(kāi)結(jié)構(gòu)并允許進(jìn)一步處理，研磨谷物。采用兩種過(guò)程，濕法或干法研磨。在干法研磨中，研磨整個(gè)谷粒并用于過(guò)程的其余部分。濕法研磨給出胚芽(germ)和粗粉(meal)(淀粉顆粒和蛋白)的很好的分離，并且在平行生產(chǎn)糖漿的地方也有一些例外情況。(ii)液化在液化過(guò)程中，淀粉顆粒通過(guò)水解溶解成通常dp高于4的麥芽糖糊精。水解可以通過(guò)酸處理或通過(guò)α-淀粉酶酶促進(jìn)行。在有限的基礎(chǔ)上使用酸水解。原料可以是來(lái)自淀粉處理的側(cè)流或研磨的全谷物。酶促液化通常作為三步熱漿體過(guò)程進(jìn)行。將漿體加熱至60-95℃，優(yōu)選80-85℃，并加入酶。然后，將漿體在95-140℃，優(yōu)選105-125℃之間進(jìn)行噴射蒸煮，冷卻至60-95℃，加入更多的酶以獲得最終水解。液化過(guò)程在ph4.5-6.5，通常在5至6之間的ph下進(jìn)行。研磨和液化谷物也稱為糊狀物(mash)。(iii)糖化為了生產(chǎn)可被酵母代謝的低分子量糖dp1-3，必須進(jìn)一步水解來(lái)自液化的麥芽糖糊精。通常通過(guò)葡糖淀粉酶酶促完成水解，或者可以使用α-葡糖苷酶或酸性α-淀粉酶。完全的糖化步驟可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)，然而，通常只進(jìn)行典型地4小時(shí)的預(yù)糖化，然后完成發(fā)酵期間糖化(ssf)。糖化通常在30-65℃的溫度，通常約60℃，和ph4.5下進(jìn)行。(iv)發(fā)酵將通常來(lái)自酵母屬種(saccharomycesspp.)的酵母加入到糊狀物中，發(fā)酵持續(xù)24-96小時(shí)，如通常35-60小時(shí)。溫度在26-34℃之間，通常在約32℃，ph值為3-6，優(yōu)選約ph4-5。應(yīng)注意最廣泛使用的方法是同時(shí)糖化和發(fā)酵(ssf)工程，其中沒(méi)有糖化的保持階段，意味著將酵母與酶一通添加。當(dāng)進(jìn)行ssf時(shí)，通常在發(fā)酵之前引入在50℃以上的溫度的預(yù)糖化步驟。(v)蒸餾發(fā)酵后，蒸餾該糊狀物以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的過(guò)程獲得的乙醇可以用作例如燃料乙醇；飲用乙醇，即可飲用中性烈酒(potableneutralspirits)；或工業(yè)乙醇。(vi)副產(chǎn)品從發(fā)酵中留下的是谷物，其通常用于液體形式或干燥的動(dòng)物飼料。關(guān)于如何進(jìn)行液化，糖化，發(fā)酵，蒸餾和乙醇回收的進(jìn)一步細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。根據(jù)本發(fā)明的方法，糖化和發(fā)酵可以同時(shí)或分開(kāi)進(jìn)行。紙漿和紙生產(chǎn)本發(fā)明的堿性α-淀粉酶多肽也可用于木質(zhì)纖維素材料的生產(chǎn)，如紙漿，紙和卡片(cardboard)，從淀粉強(qiáng)化的廢紙和卡片，特別是在在ph高于7時(shí)發(fā)生再制漿的情況下以及在淀粉酶促進(jìn)通過(guò)降解強(qiáng)化的淀粉來(lái)分解廢料的情況下。本發(fā)明的α-淀粉酶特別可用于從淀粉包被的印刷紙生產(chǎn)造紙紙漿的方法。該方法可以如wo95/14807中所述的那樣進(jìn)行，包括以下步驟：a)分解紙以產(chǎn)生紙漿，b)在步驟a)之前，期間或之后用淀粉降解酶處理，并且c)在步驟a)和b)之后從紙漿中分離油墨顆粒。本發(fā)明的α-淀粉酶在改性淀粉中也可以是非常有用的，其中將酶促改性的淀粉與堿性填料如碳酸鈣，高嶺土和粘土一起用于造紙。利用本發(fā)明的堿性α-淀粉酶，可以在填料的存在下改性淀粉，從而允許更簡(jiǎn)單的整合過(guò)程。紡織品，織物和衣物的脫漿本發(fā)明的α-淀粉酶還可以在紡織品，織物或衣服脫漿中非常有用。在紡織加工業(yè)中，α-淀粉酶?jìng)鹘y(tǒng)上用作脫漿過(guò)程中的助劑(auxiliaries)，以促進(jìn)去除含淀粉的尺寸，其在織造過(guò)程中充當(dāng)緯紗上的保護(hù)涂層。在編織后完全去除膠料涂層(sizecoating)對(duì)于確保后續(xù)過(guò)程中的最佳結(jié)果是重要的，其中洗擦，漂白和染色織物。酶促淀粉分解是優(yōu)選的，因?yàn)樗簧婕皩?duì)纖維材料的任何有害影響。為了降低加工成本并增加研磨通量，脫漿處理有時(shí)與洗擦和漂白步驟組合。在此類情況下，通常使用非酶助劑如堿或氧化劑來(lái)分解淀粉，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的α-淀粉酶與高ph水平和漂白劑不是非常相容的。淀粉膠料(starchsize)的非酶促分解確實(shí)導(dǎo)致某種纖維損傷，因?yàn)槭褂孟喈?dāng)活潑的化學(xué)品(aggressivechemical)。因此，期望使用本發(fā)明的α-淀粉酶，因?yàn)樗鼈冊(cè)趬A性溶液中具有改進(jìn)的性能。當(dāng)脫漿含纖維素的織物或紡織品時(shí)，可以單獨(dú)或與纖維素酶組合使用α-淀粉酶。脫漿和漂白過(guò)程是本領(lǐng)域公知的。例如，此類過(guò)程描述于wo95/21247，美國(guó)專利4,643,736，ep119,920中，在此通過(guò)引用并入。市售的用于脫漿的產(chǎn)品包括來(lái)自novozymesa/s的和ultra。啤酒制造本發(fā)明的α-淀粉酶在啤酒制造過(guò)程中也可以非常有用；通常在打漿過(guò)程(mashingprocess)中添加α-淀粉酶。通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，不應(yīng)將實(shí)施例解釋為限制本發(fā)明的范圍。本文描述和要求保護(hù)的發(fā)明不限于本文公開(kāi)的具體方面的范圍，因?yàn)檫@些方面旨在說(shuō)明本發(fā)明的若干方面。任何等同的方面都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)際上，除了本文所示和所述的那些之外，本發(fā)明的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將從上述描述中變得顯而易見(jiàn)。此類修改也旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，以包括定義的本公開(kāi)為準(zhǔn)。實(shí)施例實(shí)施例1：用于α-淀粉酶活性的測(cè)定法1.phadebas測(cè)定法可以通過(guò)使用片劑作為底物的方法來(lái)測(cè)定α-淀粉酶活性。phadebas片劑(amylasetest，由pharmaciadiagnostic提供)含有交聯(lián)的不可溶藍(lán)色淀粉聚合物，其已經(jīng)與牛血清白蛋白和緩沖物質(zhì)混合并成片。對(duì)于每次單一測(cè)量，將一個(gè)片劑懸浮于含有5ml100mm的britton-robinson緩沖液(100mm乙酸，100mm磷酸，100mm硼酸，0.1mmcacl2，用naoh將ph調(diào)節(jié)至感興趣的值)的管中。測(cè)試在感興趣的溫度下在水浴中進(jìn)行。將待測(cè)試的α-淀粉酶稀釋在xml的100mmbritton-robinson緩沖液中。將1ml該α-淀粉酶溶液加入到5ml100mm的britton-robinson緩沖液中。淀粉被α-淀粉酶水解，產(chǎn)生可溶性藍(lán)色片段。在620nm下用分光光度法測(cè)量的所得藍(lán)色溶液的吸光度是α-淀粉酶活性的函數(shù)。重要的是，在孵育10或15分鐘(測(cè)試時(shí)間)后測(cè)量的620nm吸光度在620nm處的0.2-2.0吸光度單位的范圍內(nèi)。在該吸光度范圍內(nèi)，活性和吸光度之間存在線性(lambert-beer定律)。因此，必須調(diào)整酶的稀釋度以適應(yīng)這一標(biāo)準(zhǔn)。在指定的條件設(shè)置下(溫度，ph，反應(yīng)時(shí)間，緩沖條件)，1mg給定的α-淀粉酶會(huì)水解一定量的底物，并產(chǎn)生藍(lán)色。在620nm處測(cè)量顏色強(qiáng)度。測(cè)量的吸光度與給定條件設(shè)置下討論的α-淀粉酶的比活性(活性/mg的純?chǔ)?淀粉酶蛋白)成正比。2.pnp-g7測(cè)定法可以通過(guò)使用pnp-g7底物的方法來(lái)確定α-淀粉酶活性。pnp-g7(其是對(duì)-硝基苯基-α,d-麥芽庚糖苷的縮寫(xiě)(p-nitrophenyl-alpha,d-maltoheptaoside))是可被內(nèi)切淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割后，試劑盒中所包括的α-葡糖苷酶進(jìn)一步消化底物以釋放游離pnp分子，該分子具有黃顏色并且因而可通過(guò)可見(jiàn)分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)處測(cè)量。含有pnp-g7底物和α-葡糖苷酶的試劑盒由boehringer-mannheim制造(cat.no.1054635)。為了制備試劑溶液，按照制造商的推薦，將10ml底物/緩沖溶液加入到50ml酶/緩沖溶液中。通過(guò)將20微升樣品轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板并在25℃下孵育來(lái)進(jìn)行測(cè)定。加入預(yù)平衡至25℃的200μl試劑溶液。將溶液混合并預(yù)孵育1分鐘，并且在4分鐘的時(shí)間里每30秒在elisa讀數(shù)器中在od405nm處測(cè)量吸光度。在給定的條件設(shè)置下，時(shí)間依賴性吸收曲線的斜率與所討論的α-淀粉酶的活性成正比。實(shí)施例2：本發(fā)明的α-淀粉酶的殘留活性通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)方法在α-淀粉酶ts23-截短(seqidno:1)中引入兩個(gè)氨基酸缺失。在所得的α-淀粉酶變體中，在r180-s181-t182-g183區(qū)域中引入兩個(gè)氨基酸缺失的不同組合，如下表1所示。位置編號(hào)根據(jù)seqidno:1。將修飾的淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中轉(zhuǎn)化并表達(dá)。將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基離心，并且分離含有淀粉酶的上清液并在britton-robinson緩沖液ph7.3中稀釋至少50倍，然后與具有0.3％edta的90％a型洗滌劑(modeladetergent)混合。然后，將樣品分成兩個(gè)樣品；一個(gè)儲(chǔ)存在4℃，另一個(gè)在40℃下孵育4小時(shí)。之后，樣品在100mmbritton-robinson緩沖液(100mm乙酸+100mm磷酸+100mm硼酸，ph7.3+0.12mmcacl2+0.01％brij，ph調(diào)節(jié)至ph7.3)中稀釋10倍，并且如方法中所述使用phadebas淀粉酶測(cè)定法測(cè)量淀粉酶活性。殘留活性計(jì)算為已經(jīng)在40℃下孵育的樣品中的活性相對(duì)于已經(jīng)在4℃下孵育的樣品中的活性之間的比率。表1：在具有edta的洗滌劑中孵育后的α-淀粉酶變體的殘留活性(ra)變體好淀粉酶變體所得的基序ra改善因子(if)半衰期aseqidno:1+r180*+s181*ftgk1111.26bseqidno:1+t182*+g183*frsk2221.83cseqidno:1+s181*+t182*frgk2221.83dseqidno:1+r180*+t182*fsgk322.92.43eseqidno:1+r180*+g183*fstk363.32.71fseqidno:1+r180*+t182g+g183*fsgk372.52.77gseqidno:1+r180*+t182t+g183*fstk342.32.55hseqidno:1+s181*+t182c+g183*frck372.62.79iseqidno:1+s181*+t182y+g183*fryk322.22.42jseqidno:1+r180+t182i+g183*fsik312.12.34kseqidno:1+r180*+t182l+g183*fslk543.74.45lseqidno:1+s181*+t182l+g183*frlk473.33.71mseqidno:1+r180*+t182q+g183*fsqk342.32.58nseqidno:1+r180*+t182s+g183*fssk614.25.54該實(shí)施例證明了，通過(guò)缺失兩個(gè)氨基酸，可以產(chǎn)生在具有edta的洗滌劑存在下具有增加的穩(wěn)定性的α-淀粉酶變體，并且通過(guò)在氨基酸基序中保留絲氨酸，蘇氨酸和/或甘氨酸清楚地觀察到最大的效果。實(shí)施例3：殘留活性(ra)的比較數(shù)據(jù)類似于實(shí)施例2，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)方法將兩個(gè)氨基酸缺失引入α-淀粉酶sp722(seqidno:5)中。在所得的α-淀粉酶變體中，在r181-g182-d183-g184區(qū)域中引入兩個(gè)氨基酸缺失的不同組合，如下表2所示。位置編號(hào)根據(jù)seqidno:5。將修飾的淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中轉(zhuǎn)化并表達(dá)。將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基離心，并且分離含有淀粉酶的上清液并在britton-robinson緩沖液ph7.3中稀釋至少50倍，然后將它們與具有0.3％edta的90％a型洗滌劑混合。然后，將樣品分成兩個(gè)樣品；一個(gè)儲(chǔ)存在4℃，另一個(gè)在45℃下孵育4小時(shí)。之后，樣品在100mmbritton-robinson緩沖液(100mm乙酸+100mm磷酸+100mm硼酸，ph7.3+0.12mmcacl2+0.01％brij，ph調(diào)節(jié)至ph7.3)中稀釋10倍，并且如方法中所述使用phadebas淀粉酶測(cè)定法測(cè)量淀粉酶活性。殘留活性計(jì)算為已經(jīng)在45℃下孵育的樣品中的活性相對(duì)于已經(jīng)在4℃下孵育的樣品中的活性之間的比率。表2：在具有edta的洗滌劑中孵育后的本領(lǐng)域中已知的α-淀粉酶變體的殘留活性(ra)實(shí)施例4：關(guān)于殘留活性(ra)的比較數(shù)據(jù)與實(shí)施例2和3類似，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的定點(diǎn)方法在α-淀粉酶sp722(seqidno:5)中引入兩個(gè)氨基酸缺失。與前兩個(gè)實(shí)施例相比在略長(zhǎng)的孵育后測(cè)定殘留活性(ra)(將目前的變體孵育18小時(shí)而非4小時(shí))。在所得的α-淀粉酶變體中，在r181-g182-d183-g184區(qū)中引入兩個(gè)氨基酸取代的不同組合，如下文3中指示。位置編號(hào)根據(jù)seqidno:5。將修飾的淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中轉(zhuǎn)化并表達(dá)。將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基離心，并且分離含有淀粉酶的上清液并在britton-robinson緩沖液ph7.3中稀釋至少50倍，然后將它們與具有0.3％edta的90％a型洗滌劑混合。然后，將樣品分成兩個(gè)樣品；一個(gè)儲(chǔ)存在4℃，另一個(gè)在45℃下孵育18小時(shí)。之后，樣品在100mmbritton-robinson緩沖液(100mm乙酸+100mm磷酸+100mm硼酸，ph7.3+0.12mmcacl2+0.01％brij，ph調(diào)節(jié)至ph7.3)中稀釋10倍，并且如方法中所述使用phadebas淀粉酶測(cè)定法測(cè)量淀粉酶活性。殘留活性計(jì)算為已經(jīng)在45℃下孵育的樣品中的活性相對(duì)于已經(jīng)在4℃下孵育的樣品中的活性之間的比率。表3：在具有edta的洗滌劑中孵育后的本領(lǐng)域中已知的α-淀粉酶變體的殘留活性(ra)序列表<110>諾維信公司（novozymesa/s）<120>穩(wěn)定化的α-淀粉酶變體及其用途<130>14038-cn-np<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>484<212>prt<213>芽孢桿菌種<400>1asnthralaproileasngluthrmetmetglntyrpheglutrpasp151015leuproasnaspglythrleutrpthrlysvallysasnglualaala202530asnleuserserleuglyilethralaleutrpleuproproalatyr354045lysglythrserglnseraspvalglytyrglyvaltyraspleutyr505560aspleuglyglupheasnglnlysglythrileargthrlystyrgly65707580thrlysthrglntyrileglnalaileglnalaalalysalaalagly859095metglnvaltyralaaspvalvalpheasnhislysalaglyalaasp100105110glythrgluphevalaspalavalgluvalaspproserasnargasn115120125glngluthrserglythrtyrglnileglnalatrpthrlyspheasp130135140pheproglyargglyasnthrtyrserserphelystrpargtrptyr145150155160hispheaspglythrasptrpaspgluserarglysleuasnargile165170175tyrlyspheargserthrglylysalatrpasptrpgluvalaspthr180185190gluasnglyasntyrasptyrleumetphealaaspleuaspmetasp195200205hisprogluvalvalthrgluleulysasntrpglythrtrptyrval210215220asnthrthrasnileaspglypheargleuaspalavallyshisile225230235240lystyrthrphepheproasptrpleuthrtyrvalargasnglnthr245250255glylysasnleuphealavalglygluphetrpsertyraspvalasn260265270lysleuhisasntyrilethrlysthrasnglysermetserleuphe275280285aspalaproleuhisasnasnphetyrthralaserlyssersergly290295300tyrpheaspmetargtyrleuleuasnasnthrleumetlysaspgln305310315320proserleualavalthrleuvalaspasnhisaspthrglnprogly325330335glnserleuglnsertrpvalgluprotrpphelysproleualatyr340345350alapheileleuthrargglngluglytyrprocysvalphetyrgly355360365asptyrtyrglyileprolystyrasnileproglyleulysserlys370375380ileaspproleuleuilealaargargasptyralatyrglythrgln385390395400argasptyrileasphisglnaspileileglytrpthrargglugly405410415ileaspthrlysproasnserglyleualaalaleuilethraspgly420425430proglyglyserlystrpmettyrvalglylyslyshisalaglylys435440445valphetyraspleuthrglyasnargseraspthrvalthrileasn450455460alaaspglytrpglygluphelysvalasnglyglyservalserile465470475480trpvalalalys<210>2<211>482<212>prt<213>芽孢桿菌種<220><221>misc_feature<222>(180)..(180)<223>其中x是r或s<220><221>misc_feature<222>(181)..(181)<223>其中x是a,r,n,d,c,e,q,g,h,i,l,k,m,f,p,s,r,w,y,或v,但當(dāng)x1是r時(shí)x2不是s<400>2asnthralaproileasngluthrmetmetglntyrpheglutrpasp151015leuproasnaspglythrleutrpthrlysvallysasnglualaala202530asnleuserserleuglyilethralaleutrpleuproproalatyr354045lysglythrserglnseraspvalglytyrglyvaltyraspleutyr505560aspleuglyglupheasnglnlysglythrileargthrlystyrgly65707580thrlysthrglntyrileglnalaileglnalaalalysalaalagly859095metglnvaltyralaaspvalvalpheasnhislysalaglyalaasp100105110glythrgluphevalaspalavalgluvalaspproserasnargasn115120125glngluthrserglythrtyrglnileglnalatrpthrlyspheasp130135140pheproglyargglyasnthrtyrserserphelystrpargtrptyr145150155160hispheaspglythrasptrpaspgluserarglysleuasnargile165170175tyrlysphexaaxaalysalatrpasptrpgluvalaspthrgluasn180185190glyasntyrasptyrleumetphealaaspleuaspmetasphispro195200205gluvalvalthrgluleulysasntrpglythrtrptyrvalasnthr210215220thrasnileaspglypheargleuaspalavallyshisilelystyr225230235240thrphepheproasptrpleuthrtyrvalargasnglnthrglylys245250255asnleuphealavalglygluphetrpsertyraspvalasnlysleu260265270hisasntyrilethrlysthrasnglysermetserleupheaspala275280285proleuhisasnasnphetyrthralaserlysserserglytyrphe290295300aspmetargtyrleuleuasnasnthrleumetlysaspglnproser305310315320leualavalthrleuvalaspasnhisaspthrglnproglyglnser325330335leuglnsertrpvalgluprotrpphelysproleualatyralaphe340345350ileleuthrargglngluglytyrprocysvalphetyrglyasptyr355360365tyrglyileprolystyrasnileproglyleulysserlysileasp370375380proleuleuilealaargargasptyralatyrglythrglnargasp385390395400tyrileasphisglnaspileileglytrpthrarggluglyileasp405410415thrlysproasnserglyleualaalaleuilethraspglyprogly420425430glyserlystrpmettyrvalglylyslyshisalaglylysvalphe435440445tyraspleuthrglyasnargseraspthrvalthrileasnalaasp450455460glytrpglygluphelysvalasnglyglyservalseriletrpval465470475480alalys<210>3<211>583<212>prt<213>芽孢桿菌種<400>3asnthralaproileasngluthrmetmetglntyrpheglutrpasp151015leuproasnaspglythrleutrpthrlysvallysasnglualaala202530asnleuserserleuglyilethralaleutrpleuproproalatyr354045lysglythrserglnseraspvalglytyrglyvaltyraspleutyr505560aspleuglyglupheasnglnlysglythrileargthrlystyrgly65707580thrlysthrglntyrileglnalaileglnalaalalysalaalagly859095metglnvaltyralaaspvalvalpheasnhislysalaglyalaasp100105110glythrgluphevalaspalavalgluvalaspproserasnargasn115120125glngluthrserglythrtyrglnileglnalatrpthrlyspheasp130135140pheproglyargglyasnthrtyrserserphelystrpargtrptyr145150155160hispheaspglythrasptrpaspgluserarglysleuasnargile165170175tyrlyspheargserthrglylysalatrpasptrpgluvalaspthr180185190gluasnglyasntyrasptyrleumetphealaaspleuaspmetasp195200205hisprogluvalvalthrgluleulysasntrpglythrtrptyrval210215220asnthrthrasnileaspglypheargleuaspalavallyshisile225230235240lystyrserphepheproasptrpleuthrtyrvalargasnglnthr245250255glylysasnleuphealavalglygluphetrpsertyraspvalasn260265270lysleuhisasntyrilethrlysthrasnglysermetserleuphe275280285aspalaproleuhisasnasnphetyrthralaserlyssersergly290295300tyrpheaspmetargtyrleuleuasnasnthrleumetlysaspgln305310315320proserleualavalthrleuvalaspasnhisaspthrglnprogly325330335glnserleuglnsertrpvalgluprotrpphelysproleualatyr340345350alapheileleuthrargglngluglytyrprocysvalphetyrgly355360365asptyrtyrglyileprolystyrasnileproglyleulysserlys370375380ileaspproleuleuilealaargargasptyralatyrglythrgln385390395400argasptyrileasphisglnaspileileglytrpthrargglugly405410415ileaspthrlysproasnserglyleualaalaleuilethraspgly420425430proglyglyserlystrpmettyrvalglylyslyshisalaglylys435440445valphetyraspleuthrglyasnargseraspthrvalthrileasn450455460alaaspglytrpglygluphelysvalasnglyglyservalserile465470475480trpvalalalysthrserasnvalthrphethrvalasnasnalathr485490495thrthrserglyglnasnvaltyrvalvalalaasnileprogluleu500505510glyasntrpasnthralaasnalailelysmetasnprosersertyr515520525prothrtrplysalathrilealaleuproglnglylysalaileglu530535540phelyspheilelyslysaspglnalaglyasnvaliletrpgluser545550555560thrserasnargthrtyrthrvalpropheserserthrglysertyr565570575thralasertrpasnvalpro580<210>4<211>4<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列<220><221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>其中x是r或s<220><221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>其中x是a,r,n,d,c,e,q,g,h,i,l,k,m,f,p,s,r,w,y,或v,但當(dāng)x1是r時(shí)x2不是s<400>4phexaaxaalys1<210>5<211>485<212>prt<213>bacillushalmapalus<400>5hishisasnglythrasnglythrmetmetglntyrpheglutrphis151015leuproasnaspglyasnhistrpasnargleuargaspaspalaser202530asnleuargasnargglyilethralailetrpileproproalatrp354045lysglythrserglnasnaspvalglytyrglyalatyraspleutyr505560aspleuglyglupheasnglnlysglythrvalargthrlystyrgly65707580thrargserglnleugluseralailehisalaleulysasnasngly859095valglnvaltyrglyaspvalvalmetasnhislysglyglyalaasp100105110alathrgluasnvalleualavalgluvalasnproasnasnargasn115120125glngluileserglyasptyrthrileglualatrpthrlyspheasp130135140pheproglyargglyasnthrtyrseraspphelystrpargtrptyr145150155160hispheaspglyvalasptrpaspglnserargglnpheglnasnarg165170175iletyrlyspheargglyaspglylysalatrpasptrpgluvalasp180185190sergluasnglyasntyrasptyrleumettyralaaspvalaspmet195200205asphisprogluvalvalasngluleuargargtrpglyglutrptyr210215220thrasnthrleuasnleuaspglypheargileaspalavallyshis225230235240ilelystyrserphethrargasptrpleuthrhisvalargasnala245250255thrglylysglumetphealavalalagluphetrplysasnaspleu260265270glyalaleugluasntyrleuasnlysthrasntrpasnhisserval275280285pheaspvalproleuhistyrasnleutyrasnalaserasnsergly290295300glyasntyraspmetalalysleuleuasnglythrvalvalglnlys305310315320hispromethisalavalthrphevalaspasnhisaspserglnpro325330335glygluserleugluserphevalglnglutrpphelysproleuala340345350tyralaleuileleuthrarggluglnglytyrproservalphetyr355360365glyasptyrtyrglyileprothrhisservalproalametlysala370375380lysileaspproileleuglualaargglnasnphealatyrglythr385390395400glnhisasptyrpheasphishisasnileileglytrpthrargglu405410415glyasnthrthrhisproasnserglyleualathrilemetserasp420425430glyproglyglyglulystrpmettyrvalglyglnasnlysalagly435440445glnvaltrphisaspilethrglyasnlysproglythrvalthrile450455460asnalaaspglytrpalaasnpheservalasnglyglyservalser465470475480iletrpvallysarg485當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12