本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及兩種黑芥基因組dna序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

十字花科蕓薹屬蔬菜包括以白菜為代表的a基因組brassicarapa(aa,n＝10)，黑芥的b基因組，brassicanigra(bb,n＝8)，和甘藍為代表的c基因組brassicaoleracea(cc,n＝9)，以及他們自然加倍形成的三個異緣四倍體復(fù)合種：甘藍型油菜類b.napus(aacc,n＝19),芥菜類b.juncea(aabb,n＝18)，和埃塞俄比亞芥b.carinata(bbcc,n＝17)，組成了著名的u三角。包含了世界范圍內(nèi)最重要的食用，油用及調(diào)味用蔬菜，也是研究屬內(nèi)遺傳多樣性和物種及多倍性演化的模式材料。

黑芥是蕓薹屬的野生種，在長期的生態(tài)適應(yīng)下保留了很多優(yōu)良性狀，如抗多種病原菌(groat,2003；pradhanetal.,2011)，和優(yōu)異的種油質(zhì)量(chèvreetal.,1991；pradhanetal.,2011)。這些都是蕓薹屬育種的重要基因源，然而，b基因組遺傳和細胞學(xué)信息的缺乏阻礙了其基因的轉(zhuǎn)移和利用。蕓薹屬物種進化和倍性演化研究也受到b基因組信息缺乏的限制。

隨著a、c基因組的快速研究，黑芥b基因組的研究也將越來越受到重視，黑芥基因組測序計劃也已啟動，因此其細胞遺傳學(xué)研究也必須先前一步。開發(fā)穩(wěn)定的細胞學(xué)標記和建立方便可靠的核型鑒定方法是基礎(chǔ)。

蕓薹屬蔬菜染色體小，尤其是b基因組的黑芥，完全不可能靠形態(tài)識別所有染色體，核型是細胞遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。目前，關(guān)于蕓薹屬b基因組的染色體核型分析鮮有報道，基本還停留在染色體形態(tài)和c顯帶技術(shù)上，重復(fù)性差，辨別受主觀因素影響大，方法繁瑣。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供用于鑒定蕓薹屬植物b基因組的成套dna分子。

本發(fā)明提供的成套dna分子，為如下1)或2)：

1)由序列表的序列1所示的單鏈dna分子和序列表的序列2所示的單鏈dna分子組成；

2)由序列a所示的單鏈dna分子和序列b所示的單鏈dna分子組成；

序列a為與序列1同源性大于90％的序列；

序列b為與序列2同源性大于90％的序列。

本發(fā)明另一個目的是提供用于鑒定蕓薹屬植物b基因組的成套載體。

本發(fā)明提供的成套載體，由表達序列1所示的單鏈dna分子的重組載體和表達序列2所示的單鏈dna分子的重組載體組成。

表達序列1所示的單鏈dna分子的重組載體為將序列1所示的bnsat28序列克隆到pmd-18t載體上得到的質(zhì)粒。

表達序列2所示的單鏈dna分子的重組載體為將序列2所示的bnsat68序列克隆到pmd-18t載體上得到的質(zhì)粒。

本發(fā)明第3個目的是提供用于鑒定蕓薹屬植物b基因組的試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的成套dna分子或上述的成套載體。

上述中，所述序列1所示的單鏈dna分子的核苷酸和所述序列2所示的單鏈dna分子的核苷酸標記不同的熒光基團。

上述成套dna分子或上述成套載體或上述試劑盒在區(qū)分或輔助區(qū)分或鑒定或輔助鑒定蕓薹屬植物b基因組各條染色體中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。

上述成套dna分子或上述成套載體或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測蕓薹屬植物中含有黑芥的b基因組染色體的哪條染色體中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；其中，待測蕓薹屬植物具體為非黑芥；

或，上述成套dna分子或上述成套載體或上述試劑盒在鑒定待測植物的基因組中是否含有來源于黑芥的b基因組的染色體或某條染色體中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。

上述中，所述蕓薹屬植物為黑芥。

本發(fā)明第4個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測蕓薹屬植物中來源于黑芥的b基因組染色體為幾號染色體的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：采用上述成套dna分子中的2個單鏈dna分子作為探針，分別對待測蕓薹屬植物和黑芥進行雙色熒光原位雜交，根據(jù)所述待測蕓薹屬植物b基因組染色體的信號位置與所述黑芥的b基因組8條染色體的信號位置進行比較，若所述待測蕓薹屬植物b基因組染色體的信號位置與黑芥的b基因組某條染色體的信號位置一致，則所述待測蕓薹屬植物b基因組染色體為或候選為黑芥的b基因組該條染色體。

本發(fā)明第5個目的是提供一種區(qū)別黑芥的8條染色體的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：采用上述成套dna分子中的2個單鏈dna分子作為探針，對黑芥進行雙色熒光原位雜交，根據(jù)所述黑芥b基因組染色體的信號位置區(qū)別黑芥的8條染色體。

序列表的序列1所示的單鏈dna分子和序列表的序列2所示的單鏈dna分子在作為鑒別黑芥的b基因組的探針中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。

上述探針為原位熒光雜交探針。

本研究將利用兩個dna重復(fù)序列結(jié)合熒光原位雜交(fish)技術(shù)建立黑芥的染色體細胞學(xué)可視標記。通過信號強弱和位置關(guān)系清晰地辨別黑芥每一條染色體。該技術(shù)和方法將為蕓薹屬物種進化、基因組和細胞學(xué)分析等分子生物學(xué)研究提供便利。

本發(fā)明的實驗證明，(1)bnsat28和bnsat68是黑芥基因組中含量豐富的兩類串聯(lián)重復(fù)序列；(2)bnsat28和bnsat68的獲得使蕓薹屬作物的染色體的識別更容易、準確，填補了蕓薹屬作物染色體鑒定上探針的缺乏；(3)通過bnsat28和bnsat68可以對蕓薹屬b基因組來源的每條染色體進行準確的辨別；(4)在利用黑芥進行遠緣雜交種質(zhì)創(chuàng)新中可提供黑芥染色體可視的細胞學(xué)標記；(5)結(jié)合其它標記對黑芥基因組遺傳圖譜和物理圖譜的組裝進行驗證和補充；(6)結(jié)合其它標記對檢測b基因組的易位、倒位、漸滲、和附加系的鑒定提供便利。

附圖說明

圖1為串聯(lián)重復(fù)序列bnsat28和bnsat68和45srdna(或crb)在黑芥有絲分裂中期染色體上的兩次fish雜交結(jié)果。a和a'：bnsat28(紅)，bnsat68(綠)和45srdna(黃)；b和b'：bnsat28(紅)，bnsat68(綠)和crb(黃)，bar＝5μm。

圖2為bnsat28和bnsat68鑒別黑芥每條染色體的核型模式圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

白菜‘北京新2號’(b.rapa，aa,n＝10)、黑芥‘g1/1’(b.nigra，bb,n＝8)、甘藍類甘藍‘中甘21號’(b.oleracea，cc,n＝9)。

實施例1、dna重復(fù)序列bnsat28和bnsat68的分離

以黑芥‘g1/1’為材料，通過隨機基因組測序獲得0.6g的堿基數(shù)相當(dāng)于約0.8倍的黑芥基因組(以基因組大小為630mb計算,johnstonetal.,2005)。結(jié)合nováketal.(2010)和macasetal.(2010)的方法對序列進行重復(fù)序列分析，發(fā)現(xiàn)了其中兩個基因組含量較豐富的串聯(lián)重復(fù)序列bnsat28和bnsat68，并通過pcr克隆驗證。

bnsat28的核苷酸序列為序列表中的序列1。

bnsat68的核苷酸序列為序列表中的序列2。

實施例2、dna重復(fù)序列bnsat28和bnsat68作為檢測探針的應(yīng)用

一、bnsat28和bnsat68作為檢測探針的熒光原位雜交(fish)試驗方法

1、染色體制片

1)將待測植物種子放在有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，室溫下生根；

2)待根尖長度0.5-1cm時，切下根尖放入裝有d2h2o的試管中，并將該試管放入盛有冰水混合物的冰盒于冰箱中放置22-24h進行預(yù)處理；

3)將經(jīng)過預(yù)處理的根尖放入固定液(無水乙醇:冰醋酸＝3:1(v/v))中固定1-7天；

4)將根尖分生組織部分切下與4％(體積百分含量)纖維素酶和1％(體積百分含量)果膠酶混合液中，37℃處理50min，軟化根尖；

5)將軟化的根尖用d2h2o小心清洗，浸泡15min；

6)重新用乙醇：冰醋酸體積比3:1的固定液固定，并轉(zhuǎn)移至干凈的載玻片上，于45％(體積百分含量)的冰醋酸中擠碎制片；

7)將片子于-70℃冰箱中保存，這樣可以長久保存且不嚴重影響原位雜交的結(jié)果，得到染色體制片。

2、探針制備

1)缺口平移標記探針反應(yīng)體系

缺口平移標記探針反應(yīng)體系見表1和表2所示。

含bnsat28序列的質(zhì)粒為將序列1所示的bnsat28序列克隆到pmd-18t載體上得到的質(zhì)粒。

含bnsat68序列的質(zhì)粒為將序列2所示的bnsat68序列克隆到pmd-18t載體上得到的質(zhì)粒。

含45srdna序列的質(zhì)粒將序列3所示的45srdna序列克隆到pmd-18t載體上得到的質(zhì)粒。

含crb序列的質(zhì)粒將序列4所示的crb序列克隆到pmd-18t載體上得到的質(zhì)粒。

表1為缺口平移標記bnsat28探針反應(yīng)體系

表2為缺口平移標記bnsat68探針反應(yīng)體系

表3為缺口平移標記45srdna或crb探針反應(yīng)體系

用d2h2o調(diào)整總?cè)笨谄揭茦擞浱结樂磻?yīng)體系至50μl，每加入一種溶液要混合，加完后離心充分混勻；

2)將裝有50μl反應(yīng)液的試管于水浴鍋中14-15℃水浴2h；

3)加入5μl終止緩沖液(200mm的edta)終止反應(yīng)。

注意:

1)10x緩沖液:0.5mtrishcl,ph7.5,50mmmgcl2

dntp溶液:0.5mmdatp,0.5mmdgtp,0.5mmdctp

dutp溶液:0.166mmdutp(地高辛或生物素標記)，0.333mmdttp

以上試劑均購自羅氏公司(roche,indianapolis,in)

輔助探針45srdna(序列3)和crb(序列4)(蕓薹屬著絲粒細胞學(xué)標記，limetal.,2005)是用香豆素標記的(diethylaminocoumarin(deac)-dutp)，購自珀金埃爾默公司(perkinelmer,inc.)，雜交后直接顯示橙色，不需二抗檢測。

2)探針標記最關(guān)鍵的部分是最后的切口平移產(chǎn)物的大小，當(dāng)標記的探針大小約為200-600bp時，原位雜交將獲得好的結(jié)果。

3)為確定探針大小，吸取反應(yīng)液5μl于沸水中變性4min，并立刻置于冰上冷卻，然后在小型凝膠樣品上電泳。

4)切口平移產(chǎn)物的大小可以通過在反應(yīng)溶液中加入不同量的dna酶i進行調(diào)整。

3、探針與染色體雜交

1)用刀片揭掉蓋玻片(片子保存于-80℃冰箱)，將片子置于梯度酒精(70％，95％，100％)中洗脫，每個梯度洗5min，室溫下晾干。片子應(yīng)在原位雜交前干燥幾小時。

2)雜交液反應(yīng)體系的制備

表3為雜交液反應(yīng)體系

3)用d2h2o調(diào)整雜交反應(yīng)體系至20μl，確保溶液充分混合，因為50％的硫酸葡聚糖非常粘稠。

4)將混合液于80℃干浴器上變性5min，并立刻置于冰上。離心混勻，得到雜交混合液。

5)向干燥的片子上滴加150μl溶于2xssc的70％甲酰胺溶液，蓋上22×40mm的蓋玻片，放在平板(金屬或玻璃)上于80℃烘箱中烘烤1.5min。(10ml溶于2xssc的70％甲酰胺溶液：7ml甲酰胺，1ml20xssc，2mld2h2o)。

6)揭掉蓋玻片，然后將其浸到梯度冷乙醇(70％，95％，100％，-20℃，每梯度5min)中洗脫，空氣中干燥。

7)每張片子加10μl上述4)得到的雜交混合液，蓋上18×18mm蓋玻片，用粘合劑密封片子，并置于濕盒中。

注意：可以用任何一個盒子，盒底墊上兩層3mm的濕濾紙，用塑料棒或其他東西支撐片子。

8)將濕盒放入37℃恒溫箱中孵育，最少六小時或過夜。

注意：

1)可以用相差顯微鏡鏡檢，以確保細胞處于分裂中期，且染色體形態(tài)較好，這是非常重要的，如果洗脫干燥后染色體狀態(tài)很差很難獲得令人滿意的雜交結(jié)果。

2)甲酰胺的質(zhì)量很重要，用的購于sigma公司，效果很好。

4、雜交信號熒光檢測

1)用鑷子刮開粘合劑，然后將片子放入盛有2xssc的染色缸中，輕輕搖洗直至蓋玻片從載玻片上掉下來。

2)按下列步驟洗滌玻片：

表4為雜交液洗脫過程

注意：可以通過提高2xssc的洗滌溫度和時間來降低背景，上述洗滌方法大部分效果較好。

3)將玻片在紙巾上控干水分(不要太干)，滴加100μlfitc異硫氰酸熒光素(根據(jù)不同試劑公司稀釋1:50至1:200)，蓋上22×40mm的蓋片，37℃孵育30min。

4)通過傾斜玻片或?qū)⒉Ｆ胧⒂?xpbs的燒杯中，揭掉蓋片，然后用1xpbs在室溫下?lián)u洗玻片三次，每次5min。

5)在紙巾上控干水分，滴加100μl羅丹明標記的抗地高辛抗體(根據(jù)不同試劑公司稀釋1:50至1:200)，蓋上22×40mm的蓋片，37℃孵育30min。

6)通過傾斜玻片或?qū)⒉Ｆ胧⒂?xpbs的燒杯中，揭掉蓋片，然后用1xpbs在室溫下?lián)u洗玻片三次，每次5min。

7)在紙巾上控干水分，滴加一滴含有抗淬滅劑(購自vector)的1μg/ml的dapi即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，蓋上蓋片。

8)熒光顯微鏡檢測原位雜交結(jié)果：羅丹明標記的探針在熒光下呈紅色信號，生物素標記的探針在熒光下呈黃綠色信號，用香豆素標記的直接顯示橙色，染色體為dapi的藍色信號。

二、檢測

按照上述一的方法，以bnsat28、bnsat68、45srdna(或crb)作為檢測探針，分別對黑芥(bb)、白菜(aa)、甘藍(cc)不同材料的單株進行2次fish(熒光原位雜交)分析，2次的輔助探針分別為45srdna和crb探針。每個雜交結(jié)果以觀察10個以上的有絲分裂中期染色體細胞的雜交結(jié)果為準。

白菜(aa)和甘藍(cc)的fish結(jié)果顯示，白菜aa基因組和甘藍cc基因組上均沒有bnsat28和bnsat68的明顯雜交信號。

黑芥(bb)的兩次fish結(jié)果如圖1所示，黑芥的bb基因組的8對染色體上分別有不同的雜交信號特征；兩個序列的雙色fish可以將黑芥8對染色體明確的辨別：染色體按照從長到短排列，1號染色體：bnsat28和bnsat68在著絲粒的上下都有雜交信號，bnsat28的兩個信號更靠近著絲粒；2號染色體：bnsat28在染色體短臂靠近末端有微弱信號；3號染色體：bnsat28和bnsat68均沒有雜交信號；4號染色體：bnsat28和bnsat68的雜交信號都在短臂，bnsat68更靠近著絲粒一端；5號染色體：bnsat28信號位于染色體短臂，靠近著絲粒；6號染色體：bnsat28和bnsat68的雜交信號都在短臂，bnsat28更靠近著絲粒一端；7號染色體：bnsat28信號位于染色體短臂，靠近著絲粒；8號染色體：bnsat68位于短臂，bnsat28位于長臂。

選定20個中期細胞，使用image-proplus6.0軟件，對染色體長度和fish信號的熒光強度進行測量。以bnsat68在1號染色體短臂的信號強度標定為1，其他信號強度轉(zhuǎn)換為相對值得到表5，根據(jù)表5繪制出圖2。

表5為黑芥有絲分裂中期染色體及信號相對強度

圖2是bnsat28和bnsat68在黑芥8條染色體上的示意圖。

上述結(jié)果表明，利用bnsat28和bnsat68為探針，或增加輔助探針45srdna或crb通過多色fish技術(shù)，一次雜交就可以將蕓薹屬b基因組的8條染色體準確無誤的辨別，提供了黑芥染色體可視的細胞學(xué)標記。

序列表

<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院

<120>兩種黑芥基因組dna序列及其應(yīng)用

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>703

<212>dna

<213>黑芥(b.nigra)

<400>1

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<213>黑芥(b.nigra)

<400>2

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<220>

<223>

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<223>

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