本發(fā)明屬于分子生物學(xué)特別是基因診斷領(lǐng)域，尤其是pak5在癌癥診斷預(yù)后治療及藥物篩選中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：腎細(xì)胞癌(renalcellcarcinoma,rcc)，又稱腎癌，約占所有惡性腫瘤的3％(jemal,a.,etal.,cancerstatistics,2010.cacancerjclin,2010.60(5):p.277-300)，其起源于腎小管上皮，主要由透明細(xì)胞癌、嫌色細(xì)胞癌以及乳頭狀癌等構(gòu)成，其中，以腎透明細(xì)胞癌最為多見(jiàn)，約占總體的4/5(zeng,z.,etal.,astudyexploringcriticalpathwaysinclearcellrenalcellcarcinoma.expthermed,2014.7(1):p.121-130.)。近年來(lái)，腎癌的發(fā)病率逐年上升，并且逐漸低齡化，據(jù)統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率以每年約2.5％的速度增長(zhǎng)(cohen,h.t.andf.j.mcgovern,renal-cellcarcinoma.nengljmed,2005.353(23):p.2477-90.)。對(duì)于早期腎癌，手術(shù)切除是主要的治療手段，且大部分早期腎癌的患者可通過(guò)手術(shù)治療得到根治。然而，由于腎癌早期癥狀不明顯，病情進(jìn)展較快，在確診時(shí)通常就有20～30％的患者存在轉(zhuǎn)移性病變，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)最佳時(shí)間，而腎癌本身對(duì)放化療不敏感，且自身免疫治療效果欠佳(bleumer,i.,etal.,immunotherapyforrenalcellcarcinoma.eururol,2003.44(1):p.65-75.)，因此，發(fā)現(xiàn)與腎癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異性蛋白，并研究其生物學(xué)特性和分子機(jī)制，對(duì)于早期診斷腎癌、控制腎癌的轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)晚期腎癌患者的生存時(shí)間并提高其生活質(zhì)量至關(guān)重要。腎癌是一種泌尿系統(tǒng)獨(dú)特的惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)及腎外表現(xiàn)極為豐富，臨床病理學(xué)高度多樣，很難做到早期診斷和治療。血尿、疼痛和腹部包塊稱為腎腫瘤的三聯(lián)征。值得注意的是目前腎癌中有30％～50％病例系偶然發(fā)現(xiàn)的無(wú)癥狀患者。三聯(lián)征齊全時(shí)多已屬晚期，且30％的腎癌在診斷時(shí)已有或?qū)l(fā)生轉(zhuǎn)移病變(jonasch,e.,j.gao,andw.k.rathmell,renalcellcarcinoma.bmj,2014.349:p.g4797)。腎癌的主要治療方法是外科手術(shù)根治，但即使早期腎癌患者手術(shù)后，仍有30.4％將發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性腎癌預(yù)后較差，對(duì)放化療等治療不敏感，平均生存時(shí)間僅3.33個(gè)月，3年存活率低于5％(maclennan,s.,etal.,systematicreviewofoncologicaloutcomesfollowingsurgicalmanagementoflocalisedrenalcancer.eururol,2012.61(5):p.972-93)。隨著影像學(xué)的發(fā)展，尤其是超聲的廣泛應(yīng)用和ct檢測(cè)的普及，越來(lái)越多的腎癌被早期診斷。但是依然有相當(dāng)多的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期或者局部晚期，單純手術(shù)預(yù)后差。腎癌的組織病理類型較多，尚有形態(tài)學(xué)不明確的病理亞型，而且不同病理類型的腎癌具有不同的臨床特點(diǎn)、治療方案和預(yù)后。腎癌惡性程度決定其手術(shù)方式，術(shù)前影像學(xué)技術(shù)只能判別其臨床分期，尚不能提示腫瘤惡性程度。目前國(guó)內(nèi)腎癌一線化療藥索拉非尼對(duì)于腎癌的輔助治療和新輔助治療有顯著的效果，但是部分患者出現(xiàn)化療耐藥(poprach,a.,etal.,efficacyofsunitinibinpatientswithmetastaticorunresectablerenalcellcarcinomaandrenalinsufficiency.eurjcancer,2015.51(4):p.507-13)。晚期或局部晚期的腎癌預(yù)后較差。所以對(duì)腎癌患者的早期診斷對(duì)于該病的鑒別病理分型、提示惡性程度、監(jiān)測(cè)化療耐藥以及預(yù)后復(fù)發(fā)判斷的十分重要，但是目前對(duì)于腎癌乃至多數(shù)實(shí)體瘤來(lái)說(shuō)尚未找到合適的早期診斷和預(yù)后隨訪生物標(biāo)志物。而目前已有的研究顯示某些蛋白質(zhì)有可能會(huì)成為一種潛在的早期診斷和治療腎癌的新途徑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面以及簡(jiǎn)要介紹一些較佳實(shí)施例。在本部分以及本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)摘要和發(fā)明名稱中可能會(huì)做些簡(jiǎn)化或省略以避免使本部分、說(shuō)明書(shū)摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡(jiǎn)化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面以及簡(jiǎn)要介紹一些較佳實(shí)施例。在本部分以及本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)摘要和發(fā)明名稱中可能會(huì)做些簡(jiǎn)化或省略以避免使本部分、說(shuō)明書(shū)摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡(jiǎn)化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。鑒于上述和/或現(xiàn)有治療癌癥的技術(shù)空白，提出了本發(fā)明。因此，本發(fā)明其中的一個(gè)目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種pak5基因或pak5蛋白在制備診斷或預(yù)后癌癥的試劑或試劑盒的用途。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：對(duì)pak5基因或pak5蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑以及相應(yīng)的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)；其中，所述癌癥，其為腎癌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種癌癥診斷試劑盒。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：包括，該試劑盒含有容器，容器中含有核酸探針，其中的核酸探針為pak5基因特異性核酸探針；其中，所述癌癥，其為腎癌。作為本發(fā)明所述癌癥診斷試劑盒的一種優(yōu)選方案，其中：所述探針，其偶聯(lián)有可檢測(cè)基團(tuán)。作為本發(fā)明所述癌癥診斷試劑盒的一種優(yōu)選方案，其中：所述可檢測(cè)基團(tuán)選自生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)或同位素。本發(fā)明的另一個(gè)目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種癌癥診斷試劑盒。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：該試劑盒含有容器，容器中含有抗體，其特征在于：包括，其中，所述抗體是抗pak5抗體；其中，所述癌癥，其為腎癌；其中，所述抗pak5抗體，其偶聯(lián)有可檢測(cè)基團(tuán)。作為本發(fā)明所述癌癥診斷試劑盒的一種優(yōu)選方案，其中：所述可檢測(cè)基團(tuán)，其為自生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)或同位素。本發(fā)明的另一個(gè)目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種pak5蛋白或其核酸序列在制備癌癥診斷試劑或試劑盒的用途；其中，所述癌癥，其為腎癌；其中，所述癌癥診斷試劑是抗pak5蛋白特異性抗體或pak5基因的特異性核酸探針。本發(fā)明的另一個(gè)目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種篩選治療癌癥的候選化合物的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：包括，測(cè)試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察所述測(cè)試組的細(xì)胞中pak5的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組的所述細(xì)胞中pak5的表達(dá)量和/或活性；其中，若測(cè)試組中細(xì)胞的pak5的表達(dá)量和/或活性大于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)pak5的表達(dá)和/或活性有促進(jìn)作用的治療癌癥的候選化合物。作為本發(fā)明所述篩選治療癌癥的候選化合物的方法的一種優(yōu)選方案，其中：包括，測(cè)試組中，癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；在對(duì)照組中，在癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；其中，若測(cè)試組中癌細(xì)胞的數(shù)量或生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖有抑制作用的治療癌癥的候選化合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種pak5基因或pak5蛋白或其抑制劑在制備治療癌癥的藥物中的用途；其中，所述癌癥，其為腎癌。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種診斷腎癌的分子標(biāo)志物，使用該分子標(biāo)志物可以在腎癌發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。另外，通過(guò)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來(lái)為患者決定治療方案策略。本發(fā)明的包括pak5基因或蛋白的抑制劑的治療藥物可用作新的腎癌的治療藥物。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。其中：圖1顯示利用qpcr檢測(cè)pak5基因在腎癌組織與癌旁正常腎組織中的表達(dá)情況。圖2顯示利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)pak5蛋白在腎癌組織與癌旁正常腎組織中的表達(dá)情況。圖3顯示利用westernblot檢測(cè)sirna對(duì)pak5基因的干擾效率。圖4顯示抑制pak5基因表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的影響。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說(shuō)明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開(kāi)的具體實(shí)施例的限制。其次，此處所稱的“一個(gè)實(shí)施例”或“實(shí)施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說(shuō)明書(shū)中不同地方出現(xiàn)的“在一個(gè)實(shí)施例中”并非均指同一個(gè)實(shí)施例，也不是單獨(dú)的或選擇性的與其他實(shí)施例互相排斥的實(shí)施例。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。pak5蛋白和多核苷酸在本發(fā)明中，“本發(fā)明蛋白”、“本發(fā)明多肽”、“pak5蛋白”可互換使用，指簡(jiǎn)稱為pak5。應(yīng)理解，所述術(shù)語(yǔ)還包括pak5的活性片段和衍生物。在本發(fā)明中，“本發(fā)明基因”、“本發(fā)明多核苷酸”指編碼pak5蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“pak5蛋白”、“pak5多肽”或“癌癥標(biāo)志物pak5”可互換使用，都指具有人蛋白pak5氨基酸序列的蛋白或多肽。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的?？贵w本發(fā)明還包括對(duì)pak5蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人pak5基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與pak5基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈fv分子；或嵌合抗體。激動(dòng)劑和藥物組合物利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與pak5蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，尤其是激動(dòng)劑等。本發(fā)明pak5蛋白的激動(dòng)劑，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可促進(jìn)pak5蛋白的表達(dá)和/或活性，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞(包括腎癌)的生長(zhǎng)或增殖。通常，可將這些激動(dòng)劑配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中ph通常約為5-8，較佳地ph約為6-8，盡管ph值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)：瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明pak5蛋白或其激動(dòng)劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克～10毫克/千克體重。檢測(cè)方法和試劑盒本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人pak5蛋白水平或mrna水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人pak5蛋白水平，可以用于診斷腎癌。一種檢測(cè)樣品中是否存在pak5蛋白的方法是利用pak5蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括：將樣品與pak5蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在pak5蛋白。pak5蛋白或其多核苷酸可用于pak5蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或dna芯片上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。抗pak5的抗體可以固定在蛋白質(zhì)芯片上，用于檢測(cè)樣品中的pak5蛋白。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)腎癌的試劑盒，它含有特異性擴(kuò)增pak5的引物對(duì)和/或pak5特異性抗體。篩選方法本發(fā)明還提供了基于pak5進(jìn)行藥物篩選的方法。一種方法是先篩選影響(促進(jìn))pak5表達(dá)或活性的化合物，然后對(duì)篩選出的化合物進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)癌細(xì)胞。一種篩選方法可基于pak5的mrna的表達(dá)水平。其中，代表性的癌細(xì)胞包括(但不限于)：腎癌細(xì)胞。實(shí)施例1本發(fā)明基因的差異表達(dá)1、樣品收集：腎癌組織樣品：收集腎癌患者，全部患者均經(jīng)手術(shù)治療，包括34對(duì)腎癌及其癌旁正常腎組織。所有患者均經(jīng)過(guò)病理檢查確診患有腎癌。其他入組條件為：所有患者入院前未接受過(guò)任何治療：未合并其它惡性腫瘤；未合并其它激素相關(guān)性疾病；臨床資料完整。2、在mrna水平上進(jìn)行驗(yàn)證2.1提取組織rna：使用trizol一步法提取組織總rna，通過(guò)nanodropnd-1000讀取260nm和280nm處的吸光度值(od值)測(cè)定rna溶液的濃度。經(jīng)1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察，檢查rna的完整性。2.2逆轉(zhuǎn)錄使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)1μg總rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/ldntp，0.1mmol/l/dtt，30μmol/loligodt，200u/μlmmlvrt，模板rna。42℃孵育1小時(shí)，72℃10分鐘，短暫離心。2.3pcrpak5基因引物序列如下：上游引物：5’-tgttcatgcattctagagaaagtgg-3’下游引物：5’-gcatttcaccacagtgtatttctga-3’gapdh基因引物序列如下：上游引物：5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’下游引物：5’-ggtggaatcatattggaaca-3’以上引物序列由上海生工生物工程股份有限公司提供。2.4結(jié)果結(jié)果如圖1所示，與癌旁正常腎組織相比，腎癌組織中pak5基因的mrna水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)實(shí)施例2pak5蛋白的差異表達(dá)1、樣品收集：腎癌組織樣品：收集腎癌患者，全部患者均經(jīng)手術(shù)治療，包括307例腎癌標(biāo)本和34例正常腎組織的組織芯片。所有患者均經(jīng)過(guò)病理檢查確診患有腎癌。其他入組條件為：所有患者入院前未接受過(guò)任何治療：未合并其它惡性腫瘤；未合并其它激素相關(guān)性疾病；臨床資料完整。2、按照如下方法檢測(cè)pak5的表達(dá)水平：(1)封閉過(guò)氧化物酶：取組織芯片進(jìn)行脫蠟，脫蠟至水化(脫蠟過(guò)程如下：二甲苯ⅰ10min→二甲苯ⅱ10min→無(wú)水乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min)后，用3％h2o2溶液于暗處封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15min；(2)蒸餾水漂洗：切片置于蒸餾水中，搖床上洗5min/次，共三次；(3)抗原修復(fù)：加入ph8.0的tris-edta或ph6.0的檸檬酸鈉溶液，在95℃水浴鍋中水浴50min，進(jìn)行抗原修復(fù)；(4)蒸餾水漂洗：取出切片，自然冷卻至室溫后，用蒸餾水洗三遍，再用washbuffer潤(rùn)洗一次；(5)孵育一抗：用免疫組化筆將組織圈住，在圈內(nèi)滴加pak5抗體液(為pak5抗體與抗體稀釋液混合配制，二者比例為1:100)，4℃孵育過(guò)夜；(6)蒸餾水漂洗：用蒸餾水洗三遍，washbuffer潤(rùn)洗一次；(7)滴加二抗：滴加hrp標(biāo)記的二抗工作液(為hrp二抗與抗體稀釋液混合配制，二者比例為1:1)，室溫孵育60min；(8)蒸餾水漂洗：蒸餾水洗3次，每次5min；(9)dab顯色：滴加顯色底物dab，在顯微鏡下觀察顯色情況，于蒸餾水中終止反應(yīng)；(10)蘇木素復(fù)染：將切片放入蘇木素染液中染色2min，1％鹽酸酒精分化后，流水沖洗10min；(11)脫水透明：經(jīng)80％、95％、100％梯度酒精脫水、二甲苯透明，于通風(fēng)廚中干燥；(12)封片：用中性快干膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，采圖。采圖后，根據(jù)肺癌患者和遠(yuǎn)端組織的腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性面積給予免疫組化評(píng)分。3、免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度*腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性面積＝0-9分，結(jié)果統(tǒng)計(jì)：陰性：0分；低度陽(yáng)性：1-3分；高度陽(yáng)性>3分。其中，腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度、陽(yáng)性面積的評(píng)分如下：由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生獨(dú)立對(duì)腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。4、結(jié)果分析：采用spss16.0腎癌組織組和癌旁正常腎組織對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果如圖1所示，與癌旁正常腎組織相比，腎癌組織中pak5蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。實(shí)施例3抑制pak5基因的表達(dá)1、sirna的設(shè)計(jì)合成針對(duì)pak5的sirna序列：5’-caaagtcttcgtacctgaatc-3’陰性對(duì)照序列：5’-ucuacucuuucuaggagguuguga-3’以上sirna序列與陰性對(duì)照sirna序列(sirna-nc)均由上海艾博思生物科技有限公司提供。2、腎癌細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染2.1細(xì)胞培養(yǎng)786-o細(xì)胞培養(yǎng)于rpmi1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100g/ml鏈霉素)中，achn細(xì)胞培養(yǎng)于dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100g/ml鏈霉素)中，均在37℃，5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染(1)轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，在500μl無(wú)雙抗培養(yǎng)基中接種1-2*105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為30-50％。鋪板時(shí)要將細(xì)胞消化完全混勻，避免細(xì)胞堆積生長(zhǎng)。(2)用50μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋sirna(轉(zhuǎn)染細(xì)胞的終濃度為33nm，輕輕吹吸3-5次混勻)。(3)輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用50μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋1μllipofectamine2000輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5min。(4)混合轉(zhuǎn)染試劑和sirna稀釋液，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置20min。(5)轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24孔細(xì)胞板中，100μl/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。(6)細(xì)胞板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48小時(shí)。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后可換新鮮培養(yǎng)基。3、利用westernblot檢測(cè)sirna的干擾效率3.1提取細(xì)胞總蛋白利用常規(guī)方法進(jìn)行操作。3.2將提取的蛋白定量進(jìn)行sds-page電泳，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色。3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用imagej軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將目的條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.4結(jié)果結(jié)果如圖3所示，sirna-pak5能夠有效地抑制pak5蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例4pak5基因的表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞增殖能力的測(cè)定1、步驟：1.1取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌細(xì)胞，消化、離心后以5*103個(gè)/孔接種于96孔板中，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，每孔加培養(yǎng)基至100μl，融合度為60％時(shí)轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h(37℃，5％co2的條件下)。1.2用lipofectamine2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染(空白組轉(zhuǎn)染pbs、模擬陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體、實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染sirna-pak5小干擾片段)，8-12h即可，12h后直接棄去轉(zhuǎn)染液，加新鮮培養(yǎng)基測(cè)24h增殖情況。1.3轉(zhuǎn)染成功后加入10μlcck-8溶液(注意在孔中不要生成氣泡，它們會(huì)影響吸光度，即od值的度數(shù))。1.4將培養(yǎng)板在37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h(需根據(jù)自己細(xì)胞于0.5、1、2、4h分別測(cè)1次，選od值在0.2-2.0的結(jié)果較好的1次的時(shí)間點(diǎn)作為孵育時(shí)間點(diǎn))。1.5用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處各孔的od值。1.6如果暫時(shí)不測(cè)定od值，打算以后測(cè)定，可以向每孔中加入10μlstopsolution，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在4℃條件下，在7天內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。2、結(jié)果檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染sirna-nc的細(xì)胞對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染sirna-pak5的腎癌細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pak5基因表達(dá)促進(jìn)了腎癌細(xì)胞的增殖。實(shí)施例5transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pak5基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響1、步驟：1.1從-20℃的冰箱中取出凍存的matrigel膠，然后在4℃溫度條件下過(guò)夜，使其變?yōu)橐后w。1.2取出200μl無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，加入50μl的matrigel試劑，在低溫條件，最好是在冰面上操作將其混合均勻，然后各加入100μl，放在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培育5h，此間常觀察液體情況，當(dāng)液體變成稍白色時(shí)，說(shuō)明其已變?yōu)槟虘B(tài)。1.3將轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞用胰酶消化，用不含血清的培養(yǎng)基清洗2次，然后計(jì)數(shù)，再將其配成細(xì)胞懸浮液。1.4用無(wú)血清的培養(yǎng)基將凝膠輕輕洗1次，然后將4*104個(gè)786-o細(xì)胞懸浮于100μlrpmi1640培養(yǎng)基中(1*105個(gè)achn細(xì)胞懸浮于100μldmem培養(yǎng)基中)，再接種于transwell上室。1.5下室中加入480μl對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基和120μlfbs。1.637℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12h后，取出transwell小室，每組均重復(fù)3個(gè)樣品。1.7其中1個(gè)小室棄去培養(yǎng)基，用pbs洗3遍，4％多聚甲醛固定10min，棉簽擦掉上層未穿過(guò)上室的細(xì)胞，pbs洗3遍，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察。剩余2個(gè)小室同樣方式處理觀察。2、結(jié)果：侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sirna-nc的786-o細(xì)胞組侵襲個(gè)數(shù)平均為214個(gè)，achn細(xì)胞組為287個(gè)，轉(zhuǎn)染sirna-pak5的786-o細(xì)胞組侵襲個(gè)數(shù)平均為94個(gè)，achn細(xì)胞組為135個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12