本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基因敲除方法及其sgrna片段與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

crispr/cas9基因編輯技術(shù)是細菌和古細菌在噬菌體長期選擇壓力下進化出來的一種有效抵御外源dna和病毒入侵的免疫機制，是由一段rna通過堿基互補配對識別dna，指導cas9核酸內(nèi)切酶切割識別的外源雙鏈dna，誘發(fā)同源重組或非同源末端連接，進而實現(xiàn)在目的dna上進行編輯。crispr-cas系統(tǒng)對dna分子的靶向切割特性，使其可以被用于定向的基因修飾。2012年，doudan研究小組首次將crrnas：tracrrna二元復(fù)合體改造為單鏈rna嵌合體，并指導cas9蛋白在特定位點剪切。目前，crispr-cas9已經(jīng)在人類細胞、小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥等生物中成功實現(xiàn)了基因組定點修飾。盡管zfn、和talen技術(shù)也具有高效的基因編輯效率，但crispr/cas9定點基因編輯方面有獨特優(yōu)勢。首先，crispr/cas9的靶點在基因組中分布頻率高，幾乎每8bp就有一個靶點，talen的靶點在基因組的分布頻率大概是1/125bp，而zfn每500bp才有一個合適的靶點，crispr/cas9系統(tǒng)更容易在需要突變的點附近篩選到高效的靶點。其次，crispr/cas9在引入定點插入時比zfn和talen具有更精確的優(yōu)勢，這是由于cas9切割dna兩條鏈的功能分別屬于兩個功能域，通過突變其中的一個功能域使cas9變成只切割一條鏈的切口酶，同時引入修復(fù)模板，這樣大大降低了天然cas9切割雙鏈引入隨機突變的概率。因此，crispr/cas9基因編輯技術(shù)在研究基因的功能方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。

但現(xiàn)有基因編輯技術(shù)的編輯效率較低，操作較為復(fù)雜，亟待改進。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種基因敲除方法及其sgrna片段與應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中基因編輯的效率較低等問題。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種基因敲除方法，包括分別獲得表達cas9和sgrna的轉(zhuǎn)基因生物，再將兩種轉(zhuǎn)基因生物雜交，獲得共表達陽性個體。

在本發(fā)明的一些實施例中，所述sgrna含有如seqidno.9、seqidno.10所示序列中的至少一種。

在本發(fā)明的一些實施例中，所述生物為家蠶，家蠶的中文學名為桑蠶，拉丁學名bombyxmorilinnaeus，是一種以桑葉為食料的鱗翅目泌絲昆蟲，屬無脊椎動物，節(jié)肢動物門蠶蛾科蠶蛾屬桑蠶種；將cas9載體和sgrna載體分別導入家蠶胚胎中，得到對應(yīng)的目標轉(zhuǎn)基因家蠶，將獲得的目標轉(zhuǎn)基因家蠶雜交，獲得共表達陽性個體。

在本發(fā)明的一些實施例中，利用piggybac重組表達載體將cas9基因和sgrna分別整合至家蠶基因組，含有cas9基因的piggybac重組表達載體由含有cas9基因的表達盒插入到載體pbac[3×p3-egfp]的bglⅱ酶切位點得到，含有sgrna的piggybac重組表達載體由含有sgrna的表達盒插入到載體pbac[3×p3-dsred]的bglⅱ酶切位點得到。

在本發(fā)明的一些實施例中，包括將表達盒ie1-cas9-sv40插入到最終載體pbac[3×p3-egfp]，得到重組表達載體pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]，將上述重組表達載體與輔助質(zhì)?；旌?，將混合液注射至蠶蛾的卵中，孵化得到g0代蟻蠶，蟻蠶羽化成蠶蛾蠶蛾回交或自交，得到g1代蛾圈，取g1代蛾圈中陽性轉(zhuǎn)基因系家蠶，培育至羽化，自交選純，獲得表達cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶；將內(nèi)源性基因序列接入家蠶內(nèi)源性u6啟動子后，再將sgrna序列連接至u6啟動子，獲得u6-sgrna表達盒，將u6-sgrna表達盒插入到載體pbac[3×p3-dsred]，得到重組表達載體，將上述重組表達載體與輔助質(zhì)?；旌希瑢⒒旌弦鹤⑸渲列Q蛾的卵中，孵化得到g0代蟻蠶，蟻蠶羽化成蠶蛾蠶蛾回交或自交，得到g1代蛾圈，取g1代蛾圈中陽性轉(zhuǎn)基因系家蠶，培育至羽化，自交選純，獲得表達sgrna的轉(zhuǎn)基因家蠶；將表達cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶與表達sgrna的轉(zhuǎn)基因家蠶雜交，獲得共表達陽性個體。

本發(fā)明第二方面提供一種sgrna片段，含有如seqidno.9、seqidno.10所示序列中的至少一種。

本發(fā)明第三方面提供含有上述sgrna片段的重組載體、基因表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或轉(zhuǎn)基因個體。

本發(fā)明第四方面提供一種含有上述sgrna片段的crispr/cas9載體，包括cas9表達載體以及含有上述sgrna片段的表達載體，該載體可以為基于piggybac轉(zhuǎn)座載體的cas9蛋白表達載體。

在本發(fā)明的一些實施例中，所述cas9表達載體的啟動子選自bmnpv極早期啟動子ie1。

在本發(fā)明的一些實施例中，所述sgrna表達載體的啟動子選自u6啟動子。

在本發(fā)明的一些實施例中，cas9表達載體是以眼和神經(jīng)特異的啟動子3×p3啟動的綠色熒光蛋白作為表達盒，綠色熒光蛋白作為篩選標記，篩選標記后含有啟動cas9基因表達的ie1啟動子；sgrna表達載體是以眼和神經(jīng)特異的啟動子3×p3啟動的紅色熒光蛋白作為表達盒，紅色熒光蛋白作為篩選標記，篩選標記后含有啟動sgrna基因表達的u6啟動子。

在本發(fā)明的一些實施例中，所述cas9表達載體是以眼和神經(jīng)特異的啟動子3×p3啟動的加強型綠色熒光蛋白egfp作為表達盒，加強型綠色熒光蛋白作為篩選標記，篩選標記后含有啟動cas9基因表達的ie1啟動子。

在本發(fā)明的一些實施例中，所述sgrna表達載體是含有以眼和神經(jīng)特異的啟動子3×p3啟動的紅色熒光蛋白作為表達盒，紅色熒光蛋白作為篩選標記，篩選標記后含有啟動sgrna基因表達的u6啟動子。

本發(fā)明第五方面提供上述sgrna片段及其crispr/cas9載體在基因敲除中的應(yīng)用。

如上所述，本發(fā)明的一種基因敲除方法及其sgrna片段與應(yīng)用，具有以下有益效果：本發(fā)明簡化了載體構(gòu)建技術(shù)，提高了注射效率，對靶標序列的編輯可以在受精完成后持續(xù)進行，因而保證了編輯效率。

附圖說明

圖1顯示為表達載體pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]載體示意圖。

圖2顯示為表達載體pbac[3×p3-dsred+u6-sgrna]載體示意圖。

圖3顯示為表達載體pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]獲得的表達cas9的轉(zhuǎn)基因家蠶品系各時期熒光圖。

圖4顯示為表達載體pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna1]獲得的表達sgrna的轉(zhuǎn)基因家蠶品系各時期熒光圖。

圖5顯示為表達cas9的轉(zhuǎn)基因家蠶品系cas9蛋白表達圖。

圖6a顯示為cas9表達品系與sgrna1表達品系，在轉(zhuǎn)錄水平檢測cas9表達水平和在基因組水平u6-sgrna1檢測圖。

圖6b顯示為cas9表達品系與sgrna2表達品系，在轉(zhuǎn)錄水平檢測cas9表達水平和在基因組水平u6-sgrna2檢測圖。

圖7顯示為bmdes3基因靶點1的基因編輯示意圖。

圖8顯示為bmdes3基因靶點2的基因編輯示意圖。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

piggybac轉(zhuǎn)座子是在粉紋夜蛾中發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)座子，piggybac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導的外源基因插入其能夠識別基因組上的ttaa位點并攜帶外源基因插入，并且可以穩(wěn)定遺傳，被廣泛應(yīng)用于多個物種的轉(zhuǎn)基因研究。在家蠶中，piggybac轉(zhuǎn)座子介導的外源基因插入技術(shù)被廣泛用于基因功能的研究。

實施例一

基于piggybac轉(zhuǎn)座載體的cas9表達載體pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]的構(gòu)建。

圖1顯示為表達載體pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]載體示意圖。

cas9基因來自載體phsp70-cas9(購自addgene公司，網(wǎng)址：www.addgene.org/)，cas9基因序列如seqidno.1所示。

將cas9基因插入到出發(fā)載體psl1180的多克隆位點，得到中間載體，然后將完整的含有cas9基因的表達盒ie1-cas9-sv40插入到最終載體pbac[3×p3-egfp]得到重組表達載體。

具體操作方法：

步驟s1、制備載體psl1180[cas9-sv40]

將cas9基因通過claⅰ/xbaⅰ限制性內(nèi)切酶雙酶切載體phsp70-cas9，回收得到cas9基因片段(回收操作按照takara膠回收(小量)試劑盒使用說明進行)，將回收片段與相同酶切的psl1180[sv40]載體骨架片段按照takaradnaligationkitver2.1使用說明進行連接，得到psl1180[cas9-sv40]。

步驟s2、制備ie1啟動子序列

pcr體外擴增，從bmnpv基因組中擴增ie1啟動子序列，并在擴增片段上下游分別添加hindiii限制性內(nèi)切酶和claⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點，經(jīng)t-a克隆到載體pmd19-t獲得質(zhì)粒，將獲得的pmd19-t載體質(zhì)粒用hindiii限制性內(nèi)切酶和claⅰ限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收ie1啟動子序列(回收操作按照takara膠回收(小量)試劑盒使用說明進行)，啟動子ie1的序列如seqidno.2所示。

所需pcr反應(yīng)程序為：①94℃預(yù)變性4min，②94℃變性40s，③55℃退火40s，④72℃延伸40s，⑤返回步驟②進行30個循環(huán)，⑥72℃終延伸10min，⑦12℃forever。

pcr擴增上、下游引物分別如seqidno.3、seqidno.4所示：

ie1-f(seqidno.3)：5’-cgaagcttttgcagttcgggacataaatg-3’

ie1-r(seqidno.4)：5’–cgatcgattagatccctagtcgtttggt-3’

步驟s3、制備中間載體psl1180[ie1-cas9-sv40]

通過hindiii限制性內(nèi)切酶和claⅰ限制性內(nèi)切酶雙酶切步驟s1所得載體psl1180[cas9-sv40]，回收載體骨架(回收操作按照takara膠回收(小量)試劑盒使用說明進行)，與步驟s2獲得的ie1啟動子序列按照takaradnaligationkitver2.1使用說明進行連接，獲得中間載體psl1180[ie1-cas9-sv40]。

步驟s4、制備表達盒片段ie1-cas9-sv40

通過ascⅰ限制性內(nèi)切酶單酶切psl1180[ie1-cas9-sv40]，按試劑盒要求回收并補平黏性末端，制得表達盒片段ie1-cas9-sv40。

步驟s5、制備載體骨架

通過bglⅱ限制性內(nèi)切酶單酶切載體pbac[3×p3-egfp](參見參考文獻：tomitam,munetsunah,satot,etal.transgenicsilkwormsproducerecombinanthumantypeiiiprocollagenincocoons.natbiotechnol,2003,21:52～56.)，按照takara膠回收(小量)試劑盒使用說明進行回收載體骨架并補平去磷酸化，得到載體骨架片段。

步驟s6、制備目標載體pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]

將步驟s4制得的表達盒片段ie1-omelo-sv40與步驟s5制得的pbac[3×p3-egfp]載體骨架片段按照takaradnaligationkitver2.1使用說明進行連接，獲得目標載體pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]。

本實施例構(gòu)建獲得的轉(zhuǎn)基因重組載體以眼和神經(jīng)特異的啟動子3×p3啟動的增強型綠色熒光蛋白(egfp)的表達盒，增強型綠色熒光蛋白作為篩選標記，其后含有ie1啟動子，啟動優(yōu)化后cas9基因的表達。

實施例二

培育cas9基因的轉(zhuǎn)基因系家蠶。

用市購的多化性家蠶品系305作為原始材料，親代蠶卵經(jīng)正常桑葉飼養(yǎng)并化蛾交配產(chǎn)卵。

取10nl～15nl濃度為400ng/μl的實施例一所制得重組載體質(zhì)粒pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]與輔助質(zhì)粒pha3pig混合。將混合液分別注射至400粒家蠶品系305雌蛾產(chǎn)下2h～6h的蠶卵中，用無毒膠水封口以后置于25℃、相對濕度為85％的環(huán)境中催青孵化。孵化后pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]獲得156頭g0代蟻蠶。

所得蟻蠶用桑葉飼養(yǎng)至羽化成蛾，將獲得蠶蛾回交或自交，獲得注射了pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]質(zhì)粒的蛾圈37個。

蛾圈g1代蠶卵，用電動宏觀熒光顯微鏡觀察篩選，獲得6個眼睛發(fā)綠色熒光的蛾圈，轉(zhuǎn)化效率為16.22％。

將獲得的陽性轉(zhuǎn)基因家蠶飼養(yǎng)至羽化后進一步自交選純，即獲得能穩(wěn)定遺傳的在家蠶中全時期全組織表達cas9蛋白的家蠶轉(zhuǎn)基因系，即ie1-cas9-sv40轉(zhuǎn)基因家蠶系。

圖3顯示為表達載體pbac[3×p3-egfp+ie1-cas9-sv40]獲得的表達cas9的轉(zhuǎn)基因家蠶品系各時期熒光圖。

圖5顯示為表達cas9的轉(zhuǎn)基因家蠶品系cas9蛋白表達圖。

實施例三

本實施例以家蠶內(nèi)源性脂肪酸去飽和酶基因bmdes3為例，該基因為家蠶脂肪酸去飽和酶基因家族中的一員，需要說明的是，本發(fā)明的敲除方法適用于任何具有特異性適合靶點的單個內(nèi)源性基因或具有類似結(jié)構(gòu)域的基因家族的多重敲除。bmdes3基因序列如seqidno.5所示。

構(gòu)建家蠶內(nèi)源性脂肪酸去飽和酶基因bmdes3的打靶載體。

將設(shè)計好的bmdes3特異靶序列接入家蠶內(nèi)源性u6啟動子后，再與sgrna相連，然后將含有完整靶序列的sgrna表達盒插入到最終載體pbac[3×p3-dsred]得到重組表達載體。

圖2顯示為表達載體pbac[3×p3-dsred+u6-sgrna]載體示意圖。

具體操作方法：

步驟s1、制備u6啟動子序列

pcr體外擴增，從家蠶dz品系基因組中擴增u6啟動子序列，經(jīng)t-a克隆到載體pmd19-t獲得質(zhì)粒pmd19-t-u6。

所需pcr反應(yīng)程序為：①94℃預(yù)變性4min，②94℃變性40s，③55℃退火40s，④72℃延伸40s，⑤返回步驟②進行30個循環(huán)，⑥72℃終延伸10min，⑦12℃forever。

pcr擴增上下游引物分別如seqidno.7、seqidno.8所示：

u6-f(seqidno.7)：5’-aggttatgtagtacacat-3’

u6-r(seqidno.8)：5’-acttgtagagcacgatat-3’

u6啟動子序列如seqidno.6所示。

步驟s2、篩選bmdes3的sgrna靶點序列

根據(jù)crisprdirect在線分析工具(http://crispr.dbcls.jp/)預(yù)測家蠶內(nèi)源性去飽和酶基因bmdes3的sgrna序列，同時根據(jù)軟件分析靶序列在家蠶中的脫靶效率，最后選擇高效編緝的sgrna序列，其序列為seqidno.9和seqidno.10。

target1(seqidno.9)：ggcttatggcgagtgcataa

target2(seqidno.10)：gcgtaactcgggatatgttt

需要說明的是，本實施例選擇的sgrna序列是通過與家蠶基因組序列進行blast比對，篩選出的具有最佳特異性的兩條序列，以有利于后續(xù)的敲除實驗，當然，sgrna序列也有其他選擇。

步驟s3、制備sgrna表達盒

以u6-bmdes3-f(seqidno.11)和u6-bmdes3-r11(seqidno.12)作為引物，以質(zhì)粒pmd19-t-u6為模版進行體外擴增，得到擴增產(chǎn)物；將得到的擴增產(chǎn)物稀釋50倍后作為模版，再次用引物u6-bmdes3-f(seqidno.11)和引物u6-bmdes3-r2(seqidno.13)進行體外擴增，得到擴增產(chǎn)物；將得到的擴增產(chǎn)物稀釋50倍后作為模版，第三次用引物u6-bmdes3-f(seqidno.11)和引物u6-bmdes3-r3(seqidno.14)體外擴增得到擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物按照takara膠回收(小量)試劑盒使用說明進行回收，并用ncoi和ecorⅰ雙酶切回收產(chǎn)物并補平及去磷酸化。獲得表達bmdes3基因target1sgrna的表達盒u6-bmdes3sgrna1。

同理，用引物u6-bmdes3-f(seqidno.11)和引物u6-bmdes3-r21(seqidno.15)，以質(zhì)粒pmd19-t-u6為模版進行體外擴增得到擴增產(chǎn)物；將得到的擴增產(chǎn)物稀釋50倍后作為模版，再次用引物u6-bmdes3-f(seqidno.11)和引物u6-bmdes3-r2(seqidno.13)進行體外擴增得到擴增產(chǎn)物；將得到的擴增產(chǎn)物稀釋50倍后作為模版，第三次用引物u6-bmdes3-f(seqidno.11)和引物u6-bmdes3-r3(seqidno.14)體外擴增得到擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物按照takara膠回收(小量)試劑盒使用說明進行回收，并用ncoi和ecorⅰ雙酶切回收產(chǎn)物并補平及去磷酸化。獲得表達bmdes3基因target2sgrna的表達盒u6-bmdes3sgrna2。

所需pcr反應(yīng)程序均為：①94℃預(yù)變性4min，②94℃變性40s，③60℃退火40s，④72℃延伸40s，⑤返回步驟②進行30個循環(huán)，⑥72℃終延伸10min，⑦12℃forever。

u6-bmdes3-f(seqidno.11)：5’-gcgaattcaggttatgtagtacacatt-3’

u6-bmdes3-r11(seqidno.12)：

5’-tatttctagctctaaaacttatgcactcgccataagccacttgtagagcacgatatt-3’

u6-bmdes3-r2(seqidno.13)：

5’-caagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaaca-3’

u6-bmdes3-r3(seqidno.14)：

5’-gccatggaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactag-3’

u6-bmdes3-r21(seqidno.15)：

5’-tatttctagctctaaaacaaacatatcccgagttacgcacttgtagagcacgatatt-3’

步驟s4、制備載體骨架

通過bglⅱ限制性內(nèi)切酶單酶切載體pbac[3×p3-dsred]，按照takara膠回收(小量)試劑盒使用說明進行回收載體骨架并補平去磷酸化，得到載體骨架片段。

步驟s5、制備目標載體pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna1]和pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna2]

將步驟s3制得的表達盒片段u6-bmdes3sgrna1和u6-bmdes3sgrna2分別與步驟s5制得的pbac[3×p3-dsded]載體骨架片段按照takaradnaligationkitver2.1使用說明進行連接，獲得目標載體pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna1]和pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna2]。

本實施例構(gòu)建獲得的轉(zhuǎn)基因重組載體以眼和神經(jīng)特異的啟動子3×p3啟動的紅色熒光蛋白(dsded)的表達盒，紅色熒光蛋白作為篩選標記，其后含有以u6啟動子啟動sgrna的表達盒。

實施例四

培育表達家蠶內(nèi)源性基因bmdes3的sgrna1和sgrna2的轉(zhuǎn)基因家蠶品系。

用市購的多化性家蠶品系305作為初始材料，親代蠶卵經(jīng)正常桑葉飼養(yǎng)至羽化后交配產(chǎn)卵。

取10nl～15nl濃度為400ng/μl的實施例三所制得的重組載體pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna1]和pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna2]，分別與輔助質(zhì)粒pha3pig混合。將混合液分別注射至400粒家蠶品系305雌蛾產(chǎn)下2h～6h的蠶卵中，用無毒膠水封口以后置于25℃、相對濕度為85％的環(huán)境中催青孵化。孵化后獲得注射pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna1]質(zhì)粒的g0代蟻蠶79頭，注射pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna2]質(zhì)粒的g0代蟻蠶93頭。

所得蟻蠶用桑葉飼養(yǎng)至羽化成蛾，將獲得蠶蛾回交或自交。pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna1]獲得24個蛾圈，pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna2]獲得31個蛾圈。

蛾圈g1代蠶卵，用電動宏觀熒光顯微鏡觀察，經(jīng)篩選pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna1]獲得9個眼睛發(fā)紅色熒光的蛾圈，轉(zhuǎn)化效率為37.5％，pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna2]獲得13個眼睛發(fā)紅色熒光的蛾圈，轉(zhuǎn)化效率為41.94％。

將獲得的陽性轉(zhuǎn)基因家蠶飼養(yǎng)至羽化成蛾并進一步自交選純，即獲得能穩(wěn)定遺傳的在家蠶中表達家蠶內(nèi)源性基因bmdes3的sgrna1和sgrna2的轉(zhuǎn)基因家蠶品系，即u6-bmdes3sgrna1轉(zhuǎn)基因家蠶系和u6-bmdes3sgrna2轉(zhuǎn)基因家蠶系。

圖4顯示為表達載體pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna1]獲得的表達sgrna的轉(zhuǎn)基因家蠶品系各時期熒光圖。表達載體pbac[3×p3-dsred+u6-bmdes3sgrna2]獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶品系各時期熒光圖與圖4類似。

圖6a顯示為cas9表達品系與sgrna1表達品系，在轉(zhuǎn)錄水平檢測cas9表達水平和在基因組水平u6-sgrna1檢測圖。

圖6b顯示為cas9表達品系與sgrna2表達品系，在轉(zhuǎn)錄水平檢測cas9表達水平和在基因組水平u6-sgrna2檢測圖。

測試例一

將實施例二獲得的ie1-cas9-sv40轉(zhuǎn)基因家蠶系和實施例四獲得的u6-bmdes3sgrna1轉(zhuǎn)基因家蠶系進行雜交，蠶卵用電動宏觀熒光顯微鏡觀察，并篩選出眼睛部位既發(fā)紅色熒光，又發(fā)綠色熒光的蠶卵，以新鮮桑葉飼喂至4齡。隨機選擇5只個體，分別提取基因組，用特異性引物進行擴增并測序，所有個體打靶位點1(pam基序前方20bp)附近均有不同堿基數(shù)量的缺失，大小分別為2個到14個堿基之間，其序列如圖7所示。

測試例二

將實施例二獲得的ie1-cas9-sv40轉(zhuǎn)基因家蠶系和實施例四獲得的u6-bmdes3sgrna2轉(zhuǎn)基因家蠶系進行雜交，蠶卵用電動宏觀熒光顯微鏡觀察，并篩選出眼睛部位既發(fā)紅色熒光，又發(fā)綠色熒光的蠶卵，以新鮮桑葉飼喂至4齡。隨機選擇5頭個體，分別提取基因組，用特異性引物進行擴增并測序，所有個體打靶位點2(pam基序前方20bp)附近均有不同堿基數(shù)量的缺失，大小分別為1個到9個堿基之間且其中一個個體有堿基替換，其序列如圖8所示。

上述實施例將crispr/cas9基因組定點編輯技術(shù)與piggybac轉(zhuǎn)座子介導的基因插入技術(shù)相結(jié)合，即先分別獲得cas9和sgrna的穩(wěn)定轉(zhuǎn)家蠶基因系，然后通過雜交的方式獲得同時表達cas9和sgrna的家蠶個體，可有效提高靶標基因的敲除效率。同現(xiàn)有的直接注射sgrna混合純化后的cas9蛋白、mrna或者能夠轉(zhuǎn)錄為cas9mrna的表達載體技術(shù)相比，簡化了載體構(gòu)建技術(shù)，提高了注射效率，對靶標序列的編輯可以在受精完成后持續(xù)進行，因而保證了編輯效率。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種高效、穩(wěn)定的cas9介導的靶標基因編輯方法。即先分別獲得單獨表達cas9蛋白和sgrna的轉(zhuǎn)基因家蠶系，然后通過雜交的方式使cas9介導的靶標基因編輯更加高效的進行，避免了現(xiàn)有的注射表達載體后直接篩選陽性個體效率低的問題，共表達陽性個體中靶標基因的敲除效率達100％，從而更好地服務(wù)于基因功能研究，并在基因工程育種中發(fā)揮重要意義。

本發(fā)明適用的物種廣泛，目前發(fā)現(xiàn)每個物種都具有相應(yīng)于該物種的u6啟動子，均可用于構(gòu)建pbac[3×p3-dsred+u6-sgrna]表達載體，因而具有在所有物種中均可適用的潛力。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。

sequencelisting

<110>西南大學

<120>一種基因敲除方法及其sgrna片段與應(yīng)用

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