本發(fā)明屬于秸稈生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種秸稈降解酸化菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，社會對能源的需求越來越大，煤、石油等化石能源的過度開發(fā)利用不僅帶來能源問題，更是帶來大氣污染等諸多環(huán)境問題，已嚴(yán)重影響人類社會的可持續(xù)發(fā)展。當(dāng)前，清潔能源、綠色能源已成為全人類共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題和發(fā)展方向，沼氣作為一種清潔的可再生能源因其原料來源廣泛，易于產(chǎn)業(yè)化推廣等優(yōu)勢更是備受關(guān)注。
伴隨著農(nóng)業(yè)廢棄物的資源能源化，秸稈作為一種非常豐富的資源，我國每年秸稈產(chǎn)量達(dá)7億噸，相當(dāng)于3.5億噸標(biāo)準(zhǔn)煤。但目前我國農(nóng)作物秸稈的利用率低，如何充分利用這些資源而又使環(huán)境不受污染是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)面臨的難題。利用秸稈生產(chǎn)沼氣或生物天然氣，實現(xiàn)其資源化，將成為緩解當(dāng)今我國面臨的“糧食、能源、環(huán)境”三大危機(jī)的重要途徑之一。
秸稈的主要成分木質(zhì)纖維素是由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素之間通過復(fù)雜的化學(xué)鍵緊密結(jié)合而成，不易被沼氣發(fā)酵的微生物降解，致使發(fā)酵效率低下，在沼氣發(fā)酵之前將秸稈有效降解酸化成小分子糖類和酸類物質(zhì)，成為秸稈沼氣發(fā)酵的關(guān)鍵所在。
目前在文獻(xiàn)和專利中已有報道的復(fù)合菌劑在秸稈預(yù)處理生產(chǎn)沼氣中的應(yīng)用：中國發(fā)明專利CN101948752A公開了一種用于沼氣發(fā)酵的復(fù)合菌劑。它包含了纖維素擬桿菌發(fā)酵液、巴氏芽孢梭菌發(fā)酵液、黑海甲烷袋狀菌發(fā)酵液及馬氏甲烷八疊球菌發(fā)酵液；該技術(shù)針對的是以牛糞為主要原料的沼氣發(fā)酵，與秸稈沼氣發(fā)酵存在不同。中國發(fā)明專利CN106148224A 公開了一種秸稈降解酸化菌劑及其制造方法，包含活性成分為產(chǎn)黃纖維單胞菌、產(chǎn)纖維二糖梭菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌的復(fù)合菌劑。其纖維素酶系組分不全、活性低，同時缺乏半纖維素降解酶嚴(yán)重影響秸稈原料的降解速率。中國發(fā)明專利CN104531767A公開了一種好氧酸化厭氧發(fā)酵秸稈產(chǎn)沼氣的生產(chǎn)工藝，利用兩相法生產(chǎn)秸稈沼氣，但對于水解相菌株構(gòu)成并未明確。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對秸稈沼氣兩相發(fā)酵的水解工藝，提供一種秸稈降解酸化菌劑，以提高秸稈酸化效率。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
優(yōu)選地，所述酸化菌劑中，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)、所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)、所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比為：1~3U:100~300U:2×104～4×104CFU:1×104～2×104CFU。
優(yōu)選地，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei) 發(fā)酵液的酶活力為100~300U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為10000~30000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1×106～2×106CFU/ml。
一種秸稈降解酸化菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟S1：分別制備里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液；
步驟S2：將所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液及酵母菌發(fā)酵液按體積比3:3:2:2混合，即得酸化菌劑。
優(yōu)選地，所述酸化菌劑中，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)、所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)、所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比為：1~3U:100~300U:2×104～4×104CFU:1×104～2×104CFU。
優(yōu)選地，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為100~300U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為10000~30000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1×106～2×106CFU/ml。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：
1）本發(fā)明提供的秸稈降解酸化菌劑，是一種由里氏木霉菌、綠色木霉菌、醋酸桿菌和酵母菌復(fù)合而成的兼性厭氧分解菌劑。酸化過程中，由里氏木霉菌和綠色木霉菌產(chǎn)生的水解酶類主要針對纖維素和半纖維素的分解，兩者協(xié)同在較短的時間(≤2天)內(nèi)，即可有效破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，并可以將纖維素和半纖維素分解成可利用的糖類，提高木質(zhì)纖維素、纖維素和半纖維素的降解率；同時醋酸桿菌與酵母菌協(xié)同作用迅速將前述分解而成的可利用糖轉(zhuǎn)化為產(chǎn)甲烷菌可利用的乙酸、丁酸等小分子有機(jī)酸，大幅度加快整體秸稈沼氣發(fā)酵的產(chǎn)氣速率，顯著降低原料的水力停留時間。
2）本發(fā)明構(gòu)建的秸稈降解酸化菌劑具有以下優(yōu)勢：由里氏木霉及綠色木霉提供的纖維素、半纖維素水解酶酶系齊全，酶活力高，pH適用范圍廣，兩者協(xié)同能夠快速降解木質(zhì)纖維素類原料。在微量曝氣條件下，小分子糖類可迅速被醋酸桿菌及酵母菌協(xié)同利用并轉(zhuǎn)化為乙酸等小分子有機(jī)酸，且轉(zhuǎn)化得到的乙酸含量高，乙酸為產(chǎn)甲烷菌能夠有限利用的小分子有機(jī)酸，這樣有利于提高秸稈發(fā)酵產(chǎn)甲烷的產(chǎn)量。
3）本發(fā)明酸化菌劑應(yīng)用于秸稈降解，尤其是沼氣發(fā)酵工藝中秸稈的酸化降解，促進(jìn)秸稈快速酸化，提高酸化效率。實踐表明，本發(fā)明酸化菌劑可應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等秸稈產(chǎn)沼氣發(fā)酵工藝中的酸化降解，能夠顯著提高纖維素、半纖維素的降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，使纖維素的降解率達(dá)到25%以上，半纖維素的降解率達(dá)到25%以上，揮發(fā)性有機(jī)酸含量提高1倍以上。
具體實施方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進(jìn)一步清楚闡述本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。在下文的描述中，給出了大量具體的細(xì)節(jié)以便提供對本發(fā)明更為徹底的理解。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，本發(fā)明可以無需一個或多個這些細(xì)節(jié)而得以實施。
本發(fā)明一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
其中，里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液是由里氏木霉菌(Trichodermareesei)CGMCC No.9537經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液。其中，里氏木霉菌(Trichodermareesei)CGMCC No.9537已于2014年8月25日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.9537。該菌種已在專利CN104328057A中公布。里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的制備方法，參見中國專利CN104328057A中公開的里氏木霉菌(Trichodermareesei)CGMCC No.9537的發(fā)酵培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：
①種子液制備：將里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537接入PDA斜面培養(yǎng)基，29℃，培養(yǎng)144h，待孢子鋪滿斜面，用無菌生理鹽水洗下孢子，配制成107個/mL的孢子懸浮液，以10%(v/v)的接種量接入液體種子培養(yǎng)基中，于29℃、180r/min條件下，培養(yǎng)24h，制備種子液；
②發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟①制備的種子液以8%(v/v)的接種量接入50L發(fā)酵罐(3000mL/5000mL的裝液量)中，接種后0~10h，通氣比1：0.6，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度30℃；10h之后，通氣比1：1.5，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度28℃；還原糖含量為0.3%以下時開始進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料培養(yǎng)基的質(zhì)量配比組成為乳糖15%，玉米漿2%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸鎂0.1%，氯化鈣0.05%，吐溫80 0.03%，微量元素0.2%，pH值為4.0，余量為水，其加入速率為240mL/h，溶氧量為40%(v/v)，發(fā)酵周期為6d，得到里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液；
其中，所述PDA斜面培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克、自來水1000毫升、自然PH。上述液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比組成均為微晶纖維素1%，乳糖2%，葡萄糖0.1%，玉米漿1%，酵母粉0.5%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.6%，氯化鈣0.05%，微量元素0.05%，pH值為4.5，余量為水。
綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液是由綠色木霉菌(Trichodermaviride)CGMCC No.5832經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液。綠色木霉菌(Trichodermaviride)CGMCC No.5832已于2012年3月2日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.5832。該菌種已在專利CN105154414A中公布。綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的制備方法，參閱中國專利CN105154414A中公開的綠色木霉菌(Trichodermaviride)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：
①菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng)：將綠色木霉菌株(Trichoderma viride) CGMCC No.5832轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃，培養(yǎng)7天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養(yǎng)基(121~124℃，滅菌30min)中，于220r/min，30℃條件下，培養(yǎng)18h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.3體積%的接種量接入一級種子罐中，于30℃，通氣比1：0.6(v/v)的條件下，培養(yǎng)20h，得到一級種子液；將所述一級種子液以10體積%的接種量接入二級種子罐，于30℃，通氣比1： 0.6(v/v)的條件下，培養(yǎng)10h，得到二級種子液；
②補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵罐F1中加入24000L發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(以質(zhì)量百分比計，葡萄糖3.0%，乳糖0.5%，玉米漿3.0%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.1%，氯化鈣0.05%，微量元素0.01%，余量為水)。調(diào)節(jié)pH值為4.5，于121~124℃，滅菌30min；待培養(yǎng)基溫度降至30℃，在無菌條件下，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積的8%的接種量接入所述二級種子液，接種后0~8h，通氣比為1： 1.0，攪拌轉(zhuǎn)速為110r/min，培養(yǎng)溫度為30℃；接種8h以后，通氣比1：2.0，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)溫度28℃；當(dāng)還原糖濃度在0.3重量%以下時，開始連續(xù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為每小時補(bǔ)料量為發(fā)酵液體積的的1.0%，當(dāng)發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐容積的70%時，將發(fā)酵罐F1中1/2體積的發(fā)酵液導(dǎo)入二級發(fā)酵罐F2，以與發(fā)酵罐F1相同的補(bǔ)料速率連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)，剩余的1/2體積的發(fā)酵液繼續(xù)連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)；待F1、F2的發(fā)酵液體積分別達(dá)到發(fā)酵罐容積的80%，以0.01/h稀釋率D向F1、F2流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時以與補(bǔ)料相同的速率，由F1、F2共同向下一級發(fā)酵罐F3連續(xù)輸出發(fā)酵醪液，待F3發(fā)酵液體積與F1、F2分別相等時，終止發(fā)酵，發(fā)酵周期為10天，得到綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液；
其中：所述PDA斜面培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克、自來水1000毫升、自然PH。所述三角瓶種子培養(yǎng)基、一級種子罐及二級種子罐的組成均為，以質(zhì)量百分比計，葡萄糖1.5%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.6%，玉米漿2%，余量為水。所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為，玉米漿1.5%，硫酸銨0.7%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸鎂0.2%，氯化鈣0.2%，微量元素0.1%，其余為淀粉酸解液（葡萄糖含量16重量%），調(diào)節(jié)pH值為4.4，于121~124℃下滅菌30min；所述微量元素的組成為，以質(zhì)量百分比計，鉬酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%，余量為水；所述淀粉酸解液是通過如下制備方法獲得的：用0.4重量%的鹽酸溶液將淀粉配制成15重量%的淀粉漿，于115℃下酸解30min，酸解結(jié)束后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至4.5。
醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液是由醋酸桿菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液。其中，醋酸桿菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973可通過商業(yè)途徑購買，例如：通過ATCC獲得該菌株。醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液通過下述制備方法獲得：將醋酸桿菌(Acetobacter aceti)ATCC No.15973接種于酵母粉-葡萄糖-乙醇培養(yǎng)基，所述酵母粉-葡萄糖-乙醇培養(yǎng)基的組成為：酵母粉1%，葡萄糖0.3%，無水乙醇8%，余量為水，在30℃條件下通風(fēng)培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液。
酵母菌發(fā)酵液是由酒精酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液。其中，所說的酒精酵母可以是南陽五號酵母菌1300，該南陽五號酵母菌為我國酒精生產(chǎn)的常用酵母菌種，為公眾知曉并可通過商業(yè)途徑購買獲得。酵母菌發(fā)酵液通過如下制備方法獲得：將南陽五號酵母菌接種于麥芽汁培養(yǎng)基中，在32℃條件下通風(fēng)培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液。
將制備的上述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液、酵母菌發(fā)酵液經(jīng)濃縮或稀釋后，按體積比為3:3:2:2，配置混合菌液，混合，即得酸化菌劑；并確保該酸化菌劑中各菌的配比如下：所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)、所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)、所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比為：1~3U:100~300U:2～4×104CFU:1～2×104CFU。更加優(yōu)選的是，上述酸化菌劑中，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei) 發(fā)酵液的酶活力為100~300U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride) 發(fā)酵液的酶活力為10000~30000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1×106～2×106CFU/ml。
上述秸稈降解酸化菌劑的使用方法，包括如下步驟：將秸稈粉碎為1~5cm的片段，在水解罐內(nèi)配制一定固形物含量的物料濃度，添加所述酸化菌劑，間歇曝氣同時低速攪拌，實現(xiàn)秸稈的快速降解。
實施例1
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為100U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為30000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti) 的濃度為2×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1×106CFU/ml。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)為里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)為綠色木霉菌(Trichodermaviride) CGMCC No.5832，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)為醋酸桿菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973，所述酵母菌為南陽五號酵母菌。
上述秸稈降解酸化菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟S1：分別參照上述方法制備里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride) CGMCC No.5832發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液；
步驟S2：將所述里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride) CGMCC No.5832發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液按體積比3:3:2:2混合，即得酸化菌劑。
實施例2
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為300U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為10000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為4×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為2×106CFU/ml。
本實施例秸稈降解酸化菌劑中各菌種類及其制備方法參閱實施例1。
實施例3
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為150U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為20000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為3×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1.5×106CFU/ml。
本實施例秸稈降解酸化菌劑中各菌種類及其制備方法參閱實施例1。
實施例4
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為250U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為26000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為2.5×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1×106CFU/ml。
本實施例秸稈降解酸化菌劑中各菌種類及其制備方法參閱實施例1。
實施例5
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液的酶活力為200U/ml，所述綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液的酶活力為14000U/ml，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為3.5×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1.5×106CFU/ml。
本實施例秸稈降解酸化菌劑中各菌種類及其制備方法參閱實施例1。
對比例1
一種秸稈降解酸化菌劑，包括綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液，所述綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:2:2；各菌種類、濃度及其制備方法同實施例3。
對比例2
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:2:2；各菌種類、濃度及其制備方法同實施例3。
對比例3
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2；各菌種類、濃度及其制備方法同實施例3。
對比例4
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液和醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液和醋酸桿菌發(fā)酵液的體積比為3:3:2，各菌種類、濃度及其制備方法同實施例3。
對比例5
一種秸稈降解酸化菌劑，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)發(fā)酵液、綠色木霉菌(Trichodermaviride)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液，所述里氏木霉菌發(fā)酵液、綠色木霉菌發(fā)酵液、醋酸桿菌發(fā)酵液和酵母菌發(fā)酵液的體積比為1：1：1：1。各菌種類、濃度及其制備方法同實施例3。
對比例6
一種秸稈降解酸化菌劑，包括產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液、產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液；
其中，產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為ACCC No .00522。產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液的制備方法參閱公開號為CN106148224 A的專利，具體為：將產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum) ACCC No .00522接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在室溫(30℃)條件下靜止培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液；將經(jīng)活化的菌種發(fā)酵液接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為30℃的發(fā)酵罐中靜止逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大過程按5%的比例轉(zhuǎn)接，當(dāng)發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)達(dá)到109個/mL時終止培養(yǎng)，得到產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum) ACCC No .00522發(fā)酵液；
產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為DSM No .11055；產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液的制備方法參閱公開號為CN106148224 A的專利，具體為：將產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena) ACCC No. 11055接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在室溫(30℃)條件下靜止培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液；將經(jīng)活化的菌種發(fā)酵液接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為30℃的發(fā)酵罐中靜止逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大過程按5%的比例轉(zhuǎn)接，當(dāng)發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)達(dá)到109個/mL時終止培養(yǎng)，得到產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena) ACCC No .11055發(fā)酵液；
醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液的制備方法參閱本發(fā)明上述記載的對應(yīng)方法，所述醋酸桿菌(Acetobacter aceti)的濃度為3×106CFU/ml，所述酵母菌的濃度為1.5×106CFU/ml。
該對比例秸稈降解酸化菌劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟S1：分別參照上述方法制備產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液、產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液；
步驟S2：將所述產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液、產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液、醋酸桿菌(Acetobacter aceti)發(fā)酵液和南陽五號酵母菌發(fā)酵液按體積比3:3:2:2混合，即得酸化菌劑。
實施例6 秸稈降解酸化菌劑應(yīng)用于玉米秸稈酸化處理
實驗設(shè)計在100L酸解罐中進(jìn)行，設(shè)計試驗組、對照組和空白組：
試驗組：設(shè)置3組，使用實施例1~3制備的秸稈降解酸化菌劑；
對照組：設(shè)置6組，分別使用對比例1~6制備的秸稈降解酸化菌劑；
空白組：不添加任何菌劑。
實施方法：將玉米秸稈粉碎為2~3cm的片段，每立方米酸解體系接種秸稈降解酸化菌劑10公斤(酸化菌劑添加量為酸解罐裝料量的1%)，其余體積由自來水補(bǔ)充，水力停留時間為2天，連續(xù)運(yùn)行20天。每天進(jìn)料玉米秸稈3Kg(以干重計)。檢測每天的纖維素、半纖維素和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，并計算降解率。其中，纖維素、半纖維素測定依據(jù)美國國家可再生能源實驗室(NREL)方法，揮發(fā)性有機(jī)酸的檢測方法參照Q/YZJ10-03-02-2000。
纖維素降解率＝已分解纖維素量×100%/總纖維素量，半纖維素降解率＝已分解半纖維素量×100%/總半纖維素量。
連續(xù)運(yùn)行10天后，使用菌劑的處理，經(jīng)過2天的預(yù)處理，玉米秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量如表1所示。
表1 玉米秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量
由表1可以看到，采用本發(fā)明實施例1~3秸稈降解酸化菌劑較空白組效果明顯，纖維素降解率提高2.4~2.9倍，半纖維素降解率提高2.6~3.2倍，揮發(fā)性有機(jī)酸含量提高1.0~1.3倍。對照組較空白組雖然在纖維素、半纖維素降解率及其揮發(fā)性有機(jī)酸含量方面均有所提高，但是較試驗組仍然差異明顯。對照組中，對比例1~4制備的酸化菌劑用于降解玉米秸稈，所檢測玉米秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率及揮發(fā)性有機(jī)酸含量較試驗組而言均有不同程度地明顯降低，可以看到本發(fā)明所使用酸化菌劑在玉米秸稈的降解過程中發(fā)揮了很好地協(xié)同作用，相互配合獲得顯著的降解效果。對比例5改變各菌種的有效含量，結(jié)果其對纖維素以及半纖維素的降解性能下降。對比例6采用已知的應(yīng)用于秸稈酸化菌劑制備的兩種菌替代本發(fā)明的兩種菌，發(fā)現(xiàn)其對纖維素、半纖維素的降解率雖然較空白組有所提高，但是與試驗組結(jié)果相比，差異顯著。
實施例7 秸稈降解酸化菌劑應(yīng)用于小麥秸稈酸化處理
實驗設(shè)計于100L酸解罐進(jìn)行，設(shè)計試驗組、對照組和空白組：
試驗組：設(shè)置3組，使用實施例1~3制備的秸稈降解酸化菌劑；
對照組：設(shè)置6組，分別使用對比例1~6制備的秸稈降解酸化菌劑；
空白組：不添加任何菌劑。
實施方法：將小麥秸稈粉碎為1~2cm的片段，按每立方米酸解體系接種秸稈降解酸化菌劑10公斤(菌劑添加量為酸解罐裝料量的1%)，其余體積由自來水補(bǔ)充，水力停留時間為2天，連續(xù)運(yùn)行30天。每天進(jìn)料小麥秸稈3.5Kg(以干重計)。檢測每天的纖維素、半纖維素和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，并計算降解率。
連續(xù)運(yùn)行15天后，使用菌劑的處理，經(jīng)過3天的預(yù)處理，小麥秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量如表2所示。
表2 小麥秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量
由表2可以看到，采用本發(fā)明實施例1~3秸稈降解酸化菌劑較空白組效果明顯，纖維素降解率提高2.1~2.5倍，半纖維素降解率提高1.6~2.1倍，揮發(fā)性有機(jī)酸含量提高1.3~1.7倍。對照組較空白組雖然在纖維素、半纖維素降解率及其揮發(fā)性有機(jī)酸含量方面均有所提高，但是較試驗組仍然差異明顯。對照組中，對比例1~4制備的酸化菌劑用于降解小麥秸稈，所檢測小麥秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率及揮發(fā)性有機(jī)酸含量較試驗組而言均有不同程度的降低，可以看到本發(fā)明所使用酸化菌劑在小麥秸稈的降解過程中發(fā)揮了很好地協(xié)同作用，相互配合獲得顯著的降解效果。對比例5改變各菌種的有效含量，結(jié)果其對小麥纖維素以及半纖維素的降解性能下降。對比例6采用已知的應(yīng)用于秸稈酸化菌劑制備的兩種菌替代本發(fā)明的兩種菌，發(fā)現(xiàn)其對小麥纖維素、半纖維素的降解率雖然較空白組有所提高，但是與試驗組結(jié)果相比，差異顯著。
實施例8 秸稈降解酸化菌劑應(yīng)用于水稻秸稈酸化處理
實驗設(shè)計于100m3酸解罐進(jìn)行，設(shè)計試驗組、對照組和空白組：
試驗組：設(shè)置3組，使用實施例1~3制備的秸稈降解酸化菌劑；
對照組：設(shè)置6組，分別使用對比例1~6制備的秸稈降解酸化菌劑；
空白組：不添加任何菌劑。
實施方法：將水稻秸稈粉碎為4~5cm的片段，按每立方米酸解體系接種秸稈降解酸化菌劑10公斤(菌劑添加量為酸解罐裝料量的1%)，其余體積由自來水補(bǔ)充，水力停留時間為3天，連續(xù)運(yùn)行30天。每天進(jìn)料水稻秸稈300Kg(以干重計)。檢測每天的纖維素、半纖維素和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，并計算降解率。
連續(xù)運(yùn)行15天后，使用菌劑的處理，經(jīng)過3天的預(yù)處理，水稻秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量如表3所示。
表3 水稻秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率和揮發(fā)性有機(jī)酸含量
由表3可以看到，采用本發(fā)明實施例1~3秸稈降解酸化菌劑較空白組效果明顯，纖維素降解率提高2.0~2.5倍，半纖維素降解率提高1.7~1.9倍，揮發(fā)性有機(jī)酸含量提高1.2~1.4倍。對照組較空白組雖然在纖維素、半纖維素降解率及其揮發(fā)性有機(jī)酸含量方面均有所提高，但是較試驗組仍然差異明顯。對照組中，對比例1~4制備的酸化菌劑用于降解水稻秸稈，所檢測水稻秸稈的纖維素降解率、半纖維素降解率及揮發(fā)性有機(jī)酸含量較試驗組而言均有不同程度的降低，可以看到本發(fā)明所使用酸化菌劑在水稻秸稈的降解過程中發(fā)揮了很好地協(xié)同作用，相互配合獲得顯著的降解效果。對比例5改變各菌種的有效含量，結(jié)果其對水稻纖維素以及半纖維素的降解性能下降。對比例6采用已知的應(yīng)用于秸稈酸化菌劑制備的兩種菌替代本發(fā)明的兩種菌，發(fā)現(xiàn)其對水稻纖維素、半纖維素的降解率雖然較空白組有所提高，但是與試驗組結(jié)果相比，差異顯著。
綜上可知，本發(fā)明秸稈酸化菌劑并非隨意搭配獲得，而且各菌種種類及活性對所得酸化菌劑降解秸稈的效率均存在顯著的影響，相互協(xié)同增強(qiáng)秸稈水解酸化過程中纖維素和半纖維素的降解率以及揮發(fā)性有機(jī)酸含量，進(jìn)而提高甲烷的產(chǎn)量。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案所做的其他修改或者等同替換，只要不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。