本發(fā)明屬于分子標(biāo)記篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于蛸科物種鑒定的dna條形碼。

背景技術(shù)：

蛸科動物隸屬軟體動物門(mollusca)、頭足綱(cephalopoda)、八腕目(octopoda)，分布于世界各海域，其中大部分為淺海性種類，也有少數(shù)深海種類。作為重要海洋經(jīng)濟生物之一，蛸科動物具有高蛋白、低脂肪，富含?；撬岬忍攸c，深受廣大消費者喜愛。同時，因其生長快速，生活史較短，具有廣闊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化前景。有助于對該科物種的準(zhǔn)確鑒定和系統(tǒng)進化關(guān)系的深入了解，以及種質(zhì)資源保護、管理和有效利用。

目前，有關(guān)蛸科動物的鑒定、分類和系統(tǒng)發(fā)育研究主要基于形態(tài)學(xué)結(jié)合分子學(xué)方法。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征如體長、腕長、胴體長等測量指標(biāo)，具有操作簡單，數(shù)據(jù)易獲取等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于物種描述、分類和鑒定。早在上世紀(jì)，形態(tài)學(xué)鑒定手段就廣泛應(yīng)用于蛸科分類和系統(tǒng)發(fā)生。但是，蛸科動物的形態(tài)特征可塑性強、近緣種形態(tài)差異細(xì)微，導(dǎo)致單純依靠形態(tài)學(xué)特征鑒定收效甚微，僅很少一部分物種被區(qū)分開來，大多數(shù)蛸科動物分類地位仍處于混亂狀態(tài)，例如蛸科中超過90％、200多個物種組成的蛸屬中，由于涵蓋了諸多形態(tài)特征模糊的物種，被一些學(xué)者稱其為“catchall”的一個屬。正因如此，越來越多的學(xué)者致力于細(xì)化蛸科分類。尋找一種通用性更高、更為穩(wěn)定的鑒定方法來輔助形態(tài)學(xué)進行物種分類成為當(dāng)務(wù)之急，特別是對于那些嚴(yán)重缺乏形態(tài)數(shù)據(jù)的物種。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種用于蛸科物種鑒定的dna條形碼，可以準(zhǔn)確對蛸科進行鑒定、分類；從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明首先提供一種蛸科物種的鑒定方法，是通過檢測蛸科線粒體的nd5基因來完成的；

所述的蛸科物種，為砂蛸amphioctopusaegina、條紋蛸amphioctopusmarginatus、短蛸amphioctopusfangsiao、真蛸octopusvulgaris、長蛸octopusminor、栗色蛸octopusconispadiceus、中國小孔蛸cistopuschinensis和臺灣小孔蛸cistopustaiwanicus。

本發(fā)明提供用于檢測8個蛸科物種的dna條形碼，其序列信息如下：

用于檢測砂蛸的dna條形碼，其核苷酸序列如下(seqidno:1)：

ttccttatatactcatgcaatgtttaaagctttattatttttatgtggtggtaatattattcataatttttttggaatgcaggatattcgtgatttgaagggtattagatatatattaccttttactagtattatttttaatatttcaaatatggctttatgtggatttccttttttggcggggttttattctaaagatttaattattgagatggtgttatttagaaatataaatatattgattggtgttttttctttatttggggtgtgtttaactatattatattctttgcgtatatcaatatatatagtttgaggggatgtaaaaagtgtagtttatgaagatatagaggataatgatttttatgttattatatcaataataattttatgtataggagctttatttggaggttttttgttgcaaagggtggtaatatattttaatgaggtaattattttacctaatatatataaattaatggtttcgtttttattaatattttctttattgttttcttttaggttgtgattattaggtttaaataaaatgagctataatttagtttattgatgtaatagtaaaatatgatttatatcttctttaagtggttatccttttataatattaataaaaaatataactaatatgaatttaaaagtggttgatatgggttgattagaaatattagggaggacagggaa；

用于檢測條紋蛸的dna條形碼，其核苷酸序列如下(seqidno:2)：

tattattcataatttttttgggatacaagatattcgtgatttaaaaggtgttagatatatattaccttttactagtattatttttaatatttcaaatatagcattatgtggatttccttttttagcgggattttattctaaagatttaattattgagatggtattaattagaaatataaatatattgattggaatttttgctttatttggtgtatgtttaactatattatattctatacgtatatctatatatataatttgaggggatgtaaaaagtgtaatttatgaaaatataaatgataatgattgatatgtcattatatcaatattaattttgtgtagaggtgcattatttgggggatttatattacaaagattagtaatttattttaatgaggtaattattttacctagtatatataaattaatggtttcgtttttattaatattttctttattattttcttttagattatgaatatttggattgagtaaaataaattataatttaatttattgatgtaataggaaaatatgatttatatcttctttaagagggtatccttttataatattaataaaaaatgttagtaatataaatttaaagattattgatataggttga；

用于檢測短蛸的dna條形碼，其核苷酸序列如下(seqidno:3)：

tggaatacaagatattcgagatataaaaggggttagttatatattaccttttactagtattatttttaatatctcaaacatagcattatgtggatttccctttttagcaggtttttattctaaggatttaattattgagatagtattaaataggaatataaatatattgattactatatttgtaatatttggggtatgtttaactatattttattctatacgaatatctatatatatattatggggggatgtaaaaagtgtagtctatgaaaatataatagatgatgataagtatgttgttatatcaatattaattttatgtataggggcattatttggtggttttgttttacaaacaatggtgttttgttttaatgaaattattattttacctatattatataaattaatagttttatttcttttgatattttctttattattttcttttagtttatgaatatttagaataaataaaataaattataatttaatttattggtgtaatagaaaaatgtgatttatatcttctttgaggggttatccttttataatattaattaa；

用于檢測真蛸的dna條形碼，其核苷酸序列如下(seqidno:4)：

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用于檢測長蛸的dna條形碼，其核苷酸序列如下(seqidno:5)：

atatacgcatgcaatatttaaagctcttttatttttatgtggtgggaatattatttattgttataatggttctcaggatattcgggatattagtggggtaatatataatttaccttttactagtgttatttttaatatttcaaatatggcactttgtggttttccttttttagccggtttttattcaaaagatttaattatagagattttattaagaggtaatgtaaatttattgattggtatgattggtttatttggggtttgtttaactatattatattcaatacggatatctatatatgtagtatggggggaggtaaaaagtataatttatgaaaatatagaagatgatgatttatatattgttgtttctataataattttgtgtaggggagctttatttggaggatttattttacaaagttttattatttgttttgatgaagtaattattttacctttattatataaaaggttgattataattatattagtatttagtttacttttatcattaaggttatggagtaaaaatgaagataaaattatatataatttattatattgatgtaatagaaaaatgtgatttataacttctttaagaagttatccttttatatatatattaaaaggtattactaatataaatttgaaattagtagatataggttgatt；

用于檢測栗色蛸的dna條形碼，其核苷酸序列如下(seqidno:6)：

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用于檢測中國小孔蛸的dna條形碼，其核苷酸序列如下(seqidno:7)：

ttatatactcatgcgttatttaaggcattattatttttatgtggaggtaatattattcattgttataatggagttcaggatattcgtgatattaagggagtgagatataatttaccattaacaggggttatttttaatatttctaatatggcattatgtgggtttccttttttagcaggattttattctaaagatttaattattgagattttattaaggaataatataaatttattgatggggttatttgcaatatttggggtttgtttaactatattatattcaatacgaatatctatttttataatatgaggtgatgtaaagagggttatttatgaaaatatagaagatagtgacatatttgtggtttattcaataattattttatgttttggagctttatttggtggttttagattacagagtttagtaataagatttaatgaagttattatattacctattttttataaattacttgtattaatattgatttttttatgtatattaatttcgttgagagtatgagggttaagtaggggtaaacaaaaatataatatattatattgatgtaatagtaaaatatgatttttgtcttttttaagtggttttccttttttaatttttatgaagttaagaagaaattcaacattgaagttaattgataatggatgatt；

用于檢測臺灣小孔蛸的dna條形碼，其核苷酸序列如下(seqidno:8)：

tatatttaaagctttattgtttttatgtggggggaacattattcattgttataatggaatgcaagatattcgattaattataggtgtaagttataatttgcctttaactagagttgtaataaatatttctaatatagctttatgtggatttccttttttagcagggttttattctaaggatttaattattgagaaaataatgagaagaaatataaatttttttttgaggttatttgggttatttggagtatgcttaactatactatatagacttcgaataagtttatttatgatttgaggaaatgttagaagagtggtttatttaaatataaaggataatgatgtttatgtaattgtttctatgttgattttatcttttggggcaatatttgggggaattataattcaaagtgtaattatgagatttaatgaagtaatttttttacctttattttataaaatgatagttatgatattattgtttttatcattgttagtgtcattaagagtttgagtaaggattagtagaatttatgttagtaatatttttgtttgatttaatagaaaaatatgatttttgtcttctttgagaggatacccctttttattgataataaaaaatattactaatattaatttaaaagtagttgatataggtt。

本發(fā)明還提供能用于擴增上述條形碼的引物，其引物序列如下：

nd5-f：tccctghcctcctaatatttctaatc(seqidno:9)、

nd5-r：ctttdtttcatttatatactcatgc(seqidno:10)；

上述的dna條形碼和擴增引物用于鑒定蛸科物種，具體步驟如下：

1)提取待檢測的樣品的dna，

2)用上述的引物對步驟1)提取的dna進行pcr擴增，獲得擴增產(chǎn)物；

3)將擴增產(chǎn)物進行測序，

4)將測序的序列進行比對、校正、目標(biāo)dna條形碼序列建樹，確定待檢測樣品的物種。

本發(fā)明提供了蛸科物種nd5基因擴增的引物及pcr方法，以蛸科物種dna為模板，能將本科樣本的nd5基因高效準(zhǔn)確地擴增出來，為蛸科動物的分子研究奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明具有簡便快捷、dna用量少、通用性好等優(yōu)點，彌補了現(xiàn)有分子標(biāo)記在蛸科動物鑒定分類及系統(tǒng)發(fā)生研究中的不足，同時驗證了nd5基因作為蛸科dna條形碼在物種鑒定、分類和系統(tǒng)發(fā)生研究的適用性。

附圖說明

圖1：擴增8種蛸科物種dna模板電泳結(jié)果，其中1.砂蛸，2.條紋蛸，3.短蛸，4.真蛸，5.中國小孔蛸，6.臺灣小孔蛸，7.長蛸，8.栗色蛸，9.陰性對照(其它反應(yīng)條件不變，水代替模板dna)；mk.dna分子量標(biāo)準(zhǔn)：從上到下依次為1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。

圖2：基于全序列及擴增的nd5部分序列，以kimura-2-parameter為模型構(gòu)建nj樹。

圖3：實施例3的系統(tǒng)樹分類鑒定結(jié)果圖。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明的范圍。下面對本發(fā)明的內(nèi)容進行詳細(xì)的說明。

實施例1：蛸科物種鑒定dna條形碼的篩選和擴增引物的篩選

1.獲得蛸科物種及幽靈蛸，共10個物種，分別為amphioctopusaegina，amphioctopusmarginatus，amphioctopusfangsiao，octopusvulgaris，cistopuschinensis，cistopustaiwanicus，octopusminor，octopusconispadiceus，octopusbimaculatus，vampyroteuthisinfernalis。獲取上述物種共線粒體全序列，及13個蛋白編碼基因作為候選基因。

2.用clustalw軟件對上述全線粒體基因序列對齊，用gblocks去掉多余序列，應(yīng)用mega6.0軟件計算序列間的k2p距離，并基于上述基因序列分別構(gòu)建maximumlikelihood(ml),neighborjoining(nj)和maximumparsimony(mp)系統(tǒng)樹，分析上述基因序列對蛸科物種鑒定的有效性。

3.在上述co3，nd3，nd2，co1，co2，atp8，atp6，nd5，nd4，nd4l，cob，nd6，nd1共13個蛋白編碼基因分別構(gòu)建的系統(tǒng)樹中，基于co2，atp8，nd4l，nd1基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹與全序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相差甚遠(yuǎn)；nd3，nd4,nd6基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹與全序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)差距也較大；以co3，nd2，co1這三種基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹與全序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹結(jié)構(gòu)相近，僅有某個分支與全序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同；除此之外，nd5，atp6和cob基因與全序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)高度一致，三種基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹與全序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹所得置信度數(shù)據(jù)分析采用spss21.0軟件包進行配對樣本t檢驗，以p<0.05作為顯著水平判定nd5，atp6，cob基因與全序列之間的相關(guān)性和差異顯著性。結(jié)果如表1所示，nd5基因和全序列之間相比未出現(xiàn)顯著下降，且nd5基因和全序列之間存在顯著相關(guān)關(guān)系；atp6，cob基因和全序列之間相比出現(xiàn)顯著下降，且atp6，cob基因和全序列之間均不存在顯著相關(guān)關(guān)系。綜上所述，nd5基因是最適于蛸科物種鑒定的dna條形碼。

表1配對樣本t檢驗結(jié)果

4.用clustalw軟件對上述物種nd5基因序列對齊比對，找出nd5基因序列兩側(cè)的保守區(qū)域。用primer5軟件在保守區(qū)域設(shè)計通用引物，即上游引物nd5-f和下游引物nd5-r。引物序列如下：

nd5-f：tccctghcctcctaatatttctaatc(h＝a/c/t)

nd5-r：ctttdtttcatttatatactcatgc(d＝a/g/t)

實施例2：蛸科8種物種鑒定的dna條形碼基因制備方法，

包括有以下步驟：

1.材料

8份蛸科動物，其來源詳見(表2)。全部樣本均由澳大利亞維多利亞博物館名譽館長盧重成教授進行形態(tài)學(xué)鑒定。

表2.蛸科動物樣本

2.dna提取

取各樣本胴體肌肉組織，按照molluscdnakitd3373-01(omega)試劑盒操作手冊提取上述樣品dna。

3.pcr擴增

pcr反應(yīng)在200ul離心管中進行，反應(yīng)總體積為10ul，包括以下試劑：

為防止實驗出現(xiàn)假陽性結(jié)果，特設(shè)置陰性對照，用無菌雙去離子水替代模板dna，按照同樣的方法進行pcr擴增。

pcr反應(yīng)液配制完后，2000rpm離心15s，將離心管放入pcr儀中，進行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性3min；94℃變性45s，42℃退火1min，72℃延伸1min20s，共32個循環(huán)，72℃再延伸5min獲得擴增產(chǎn)物。

取2ulpcr產(chǎn)物點至1.5％瓊脂糖電泳孔中，120v電泳25min，紫外凝膠分析檢測，成像。

按本發(fā)明引物及方法擴增8種蛸科動物dna模板電泳結(jié)果如圖1所示，所有蛸科樣本在分子量為750bp處均有清晰單一的條帶，陰性對照未出現(xiàn)目標(biāo)條帶，表明本發(fā)明擴增體系及引物能成功擴增出蛸科物種nd5基因。

4.pcr產(chǎn)物序列的獲取及編輯

將上述pcr產(chǎn)物擴大30ul體系送至生物公司測序，得到相應(yīng)樣本對應(yīng)的nd5基因序列。將序列結(jié)果通過手工校對、序列拼接，并利用clustalw軟件對齊并裁剪成長度一致的基因序列。

5.分子進化樹的構(gòu)建及dna條形碼序列準(zhǔn)確性及適用性驗證

基于上述基因序列數(shù)據(jù)，同時從ncbi上下載上述8種及雙斑蛸、幽靈蛸線粒體全序列和nd5基因序列，用mega6.0軟件選擇kimure-2-parameter遺傳距離模型，同時采用bootstrap重復(fù)抽樣1000次循環(huán)，計算系統(tǒng)樹中節(jié)點的自舉置信水平，分別構(gòu)建鄰接法(nj)分子系統(tǒng)樹。結(jié)果如圖2，從圖2中可以看出，nd5序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與基于線粒體全序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致，其中擬蛸屬、小孔蛸屬各自聚為一支，蛸屬為非單系發(fā)生，其中真蛸、雙斑蛸親緣關(guān)系較近等結(jié)果也支持了形態(tài)學(xué)及分子學(xué)上鑒定的屬和大部分種的地位，進一步證明了本發(fā)明構(gòu)建的dna條形碼在蛸科物種鑒定、分類和系統(tǒng)發(fā)生研究的有效性和可行性。

實施例3：nd5基因作為dna條形碼在蛸科其他物種鑒定的適用性檢驗：

為了驗證上述nd5基因作為dna條形碼在蛸科其他物種鑒定的適用性，以不同于上述實驗材料的物種amphioctopuskagoshimensis，thaumoctopusmimicus，octopussp.1，octopussp.2作為實驗對象，運用實施例2中方法進行dna提取、pcr擴增，電泳檢測均能得到如圖1所示的750bp的條帶，系統(tǒng)樹分類鑒定結(jié)果如圖3，能準(zhǔn)確將上述物種區(qū)分，證明了nd5基因作為dna條形碼在蛸科其他物種鑒定的適用性。

上述實施例為本發(fā)明較好的實施方式，但本發(fā)明的實施方式不受上述實施例的限制，在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，任何對本發(fā)明的改變、修飾、替代、組合、簡化等，都包含在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國海洋大學(xué)

<120>一種用于蛸科物種鑒定的dna條形碼

<130>

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

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