本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及一種植物耐鹽相關(guān)蛋白HbSCaBP10及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：土壤鹽漬化、干旱等逆境是植物生長(zhǎng)、發(fā)育的主要環(huán)境限制因素。植物為了應(yīng)對(duì)逆境，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中演化形成一套感知逆境脅迫、傳導(dǎo)逆境信號(hào)，并在分子、細(xì)胞和生理水平上響應(yīng)的精細(xì)調(diào)控機(jī)制。Ca2+依賴(lài)的信號(hào)途徑在植物多種生物過(guò)程包括逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在解密Ca2+信號(hào)、應(yīng)答植物逆境脅迫的過(guò)程中鈣離子感受器是重要的信號(hào)傳遞者，調(diào)控脅迫響應(yīng)基因的開(kāi)與關(guān)。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)的不同，鈣離子感受器分為響應(yīng)型和依賴(lài)性鈣離子感受器。前者既能結(jié)合Ca2+，又具有激酶活性，如鈣離子依賴(lài)性蛋白激酶(CDPKs)；而后者只能結(jié)合Ca2+，并與特異的蛋白激酶互作后才能傳遞鈣信號(hào)，如SOS3類(lèi)似鈣離子感受器(SOS3-LIKECALCIUMBINDINGPROTEIN，簡(jiǎn)稱(chēng)SCaBP)。野大麥(HoMeumbrevisubulatum(Trin.)Link)是禾本科大麥屬一種多年生兼性鹽生的優(yōu)良牧草，主要分布在西西伯利亞、蒙古和我國(guó)東北、華北、新疆、西藏和內(nèi)蒙等省區(qū)，是鹽化和堿化草甸草原的建群種，可在含鹽量0.6-1.0％的土地上良好生長(zhǎng)，它的耐鹽性可與小花堿茅等媲美，具有重要的應(yīng)用和科學(xué)研究?jī)r(jià)值。但前人只局限在形態(tài)、解剖、生理等方面的研究，在抗逆調(diào)控基因的克隆與功能分析方面研究較少。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種植物耐鹽相關(guān)蛋白HbSCaBP10及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，獲自野大麥，命名為HbSCaBP10蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a2)將序列4的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物耐鹽性相關(guān)的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a1)中的HbSCaBP10蛋白便于純化和檢測(cè)，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a2)中的HbSCaBP10蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(a2)中的HbSCaBP10蛋白的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述HbSCaBP10蛋白的基因(HbSCaBP10基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述HbSCaBP10基因?yàn)槿缦?b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：(b1)序列表中序列3所示的DNA分子；(b2)在嚴(yán)格條件下與(b1)限定的DNA序列雜交且編碼與生物耐鹽性相關(guān)蛋白的DNA分子；(b3)與(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼與生物耐鹽性相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實(shí)驗(yàn)中65℃下雜交并洗膜。含有所述HbSCaBP10基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。所述重組表達(dá)載體具體可為在pGreen0029載體的多克隆位點(diǎn)中插入了序列表的序列3自5′端第1-783位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體具體可為將pGreen0029載體的BamHI和MfeI酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列3自5′端第1-783位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)HbSCaBP10蛋白或HbSCaBP10基因在調(diào)控生物耐鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)HbSCaBP10蛋白或HbSCaBP10基因在生物育種中的應(yīng)用。所述生物育種是為了選育耐鹽性高的生物。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將HbSCaBP10基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性高于所述目的植物。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為南芥族植物。所述南芥族植物可為擬南芥屬植物。所述所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因生物的方法，是將HbSCaBP10基因、HbCIPK2基因和HbSOS1基因共同導(dǎo)入目的生物中，得到轉(zhuǎn)基因生物；所述轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性高于所述目的生物。所述HbCIPK2基因?yàn)榫幋aHbCIPK2蛋白的基因。所述HbSOS1基因?yàn)榫幋aHbSOS1蛋白的基因。所述HbCIPK2蛋白是由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。所述HbSOS1蛋白是由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。所述碼HbCIPK2蛋白的基因?yàn)槿缦?c1)或(c2)所述的DNA分子：(c1)編碼區(qū)如序列表中序列5自5′末端第68-1426位核苷酸所示的DNA分子；(c2)序列表中序列5所示的DNA分子。所述編碼HbSOS1蛋白的基因?yàn)槿缦?d1)或(d2)所述的DNA分子：(d1)編碼區(qū)如序列表中序列1自5′末端第71至3490位核苷酸所示的DNA分子；(d2)序列表中序列1所示的DNA分子。所述目的生物可為植物或微生物。所述微生物具體可為酵母。所述酵母具體可為酵母敏鹽突變菌株AXT3K。本發(fā)明還保護(hù)一種提高植物耐鹽性的方法，是增加目的植物中HbSCaBP10蛋白的表達(dá)量和/或活性，提高植物耐鹽性。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為南芥族植物。所述南芥族植物可為擬南芥屬植物。所述所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護(hù)一種提高生物耐鹽性的方法，是增加目的生物中HbSCaBP10蛋白、HbCIPK2蛋白和HbSOS1蛋白的表達(dá)量和/或活性，提高生物耐鹽性。所述目的生物可為植物或微生物。所述微生物具體可為酵母。所述酵母具體可為酵母敏鹽突變菌株AXT3K。本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述方法在生物育種中的應(yīng)用。所述生物育種是為了選育耐鹽性高的生物。以上任一所述生物可為植物或微生物。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為南芥族植物。所述南芥族植物可為擬南芥屬植物。所述所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。所述微生物具體可為酵母。所述酵母具體可為酵母敏鹽突變菌株AXT3K。本發(fā)明提供了一種HbSCaBP10蛋白及其編碼基因，上調(diào)HbSCaBP10基因的表達(dá)量能夠提高植物耐鹽性。同時(shí)提高HbSOS1基因、HbSCaBP10基因和HbCIPK2基因的表達(dá)量，能夠更為顯著的提高生物的耐鹽性。本發(fā)明可以應(yīng)用到植物育種中，對(duì)培育耐鹽植物有著積極的作用。附圖說(shuō)明圖1為HbSCaBP10的表達(dá)譜。圖2為HbSCaBP10在突變體sos3過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性分析。圖3為HbSCaBP10與蛋白激酶HbCIPK2互作的鑒定。圖4為蛋白激酶HbCIPK2與Na+轉(zhuǎn)運(yùn)體HbSOS1互作的鑒定。圖5為HbSOS1表達(dá)及功能受HbSCaBP10-HbCIPK2調(diào)控的分析。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。Fe-EDTA溶液：稱(chēng)取7.45gNa2-EDTA和5.57gFeSO4.7H2O，溶解于200mL蒸餾水中，加熱攪拌使其溶解，蒸餾水定容至1L。A-Z溶液：稱(chēng)取H3BO32.80mg，CuSO4·5H2O0.08mg，ZnSO4·7H2O0.22mg，MgCl2·6H2O81mg，HMoO·4H2O0.09mg，蒸餾水定容至1L。1/2Hoagland培養(yǎng)液：0.51gKNO3、0.82gCa(NO3)2、0.49gMgSO4.7H2O、0.136gKH2PO4，蒸餾水定容至1L；再加入lmLFe-EDTA溶液；然后加入lmLA-Z溶液。擬南芥突變體sos3：在http://www.arabidopsis.org網(wǎng)站的突變體編號(hào)為CS3864。參考文獻(xiàn)：LiuJP&ZhuJKJ.AnArabidopsismutantthatrequiresincreasedcalciumforpotassiumnutritionandsalttolerance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94：14960-14964；公眾可以從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。野大麥：參考文獻(xiàn)：LiRF，ZhangJW，WuGY，WangHZ，ChenYJ，WeiJH.HbCIPK2，anovelCBL-interactingproteinkinasefromhalophyteHordeumbrevisubulatum，conferssaltandosmoticstresstolerance.Plant，CellandEnvironment，2012，35(9)：1582-1600.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥：參考文獻(xiàn)：LiRF，ZhangJW，WuGY，WangHZ，ChenYJ，WeiJH.HbCIPK2，anovelCBL-interactingproteinkinasefromhalophyteHordeumbrevisubulatum，conferssaltandosmoticstresstolerance.Plant，CellandEnvironment，2012，35(9)：1582-1600.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。p35S：GFP：參考文獻(xiàn)：LiRF，ZhangJW，WuGY，WangHZ，ChenYJ，WeiJH.HbCIPK2，anovelCBL-interactingproteinkinasefromhalophyteHordeumbrevisubulatum，conferssaltandosmoticstresstolerance.Plant，CellandEnvironment，2012，35(9)：1582-1600.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。pGreen0029載體：天恩澤公司，網(wǎng)址：http://www.tiandz.com/product/4017.html。pBT3-STE載體：北京達(dá)科為公司。pPR3-STE載體：北京達(dá)科為公司。pUC-SPYCE載體：德國(guó)MünsterInstitutfürBotanik。pUC-SPYNE載體：德國(guó)MünsterInstitutfürBotanik。pcDNA3.1(+)質(zhì)粒：Invitrogen公司。pDR195載體：參考文獻(xiàn)：Rentsch，D.，Laloi，M.，Rouhara，I.，Schmelzer，E.，Delrot，S.&Frommer，W.B.V(1995)NTR1encodesahighaffinityoligopeptidetransporterinArabidopsis.FEBSLett.370，264-268.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。p424pMA1載體：參考文獻(xiàn)：MumbergD，MüllerR，F(xiàn)unkM.1994.RegulatablepromotersofSaccharomycescerevisiae：comparisonoftranscriptionalactivityandtheiruseforheterologousexpression.NucleicAcidsResearch25：5767-5768.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。pYPGE15載體：參考文獻(xiàn)：QuinteroFJ，OhtaM，ShiH，ZhuJ-KandPardoJM.ReconstitutioninyeastoftheArabidopsisSOSsignalingpathwayforNahomeostasis.PNAS，2002，99(13)：9061-9066).；公眾可以從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。農(nóng)桿菌GV3101：上海北諾生物科技有限公司，網(wǎng)址：http://www.app17.com/c76211/products/d4152051.html。酵母敏鹽突變菌株AXT3K：參考文獻(xiàn)：QuinteroFJ，OhtaM，ShiH，ZhuJK，PardoJM.2002.ReconstitutioninyeastoftheArabidopsisSOSsignalingpathwayforNa+homeostasis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，USA99(13)：9061-9066.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。LipofectaminTM2000：Invitrogen公司。以下實(shí)施例中所涉及的HbCIPK2基因的cDNA序列如序列表中序列5所示，其中第68-1426位為編碼序列(ORF)。序列5編碼序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)(HbCIPK2蛋白)，由452個(gè)氨基酸殘基組成。實(shí)施例1、耐鹽相關(guān)蛋白的獲得一、HbSOS1蛋白及其編碼基因的獲得對(duì)野大麥基因組進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)一種Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)體，將其命名為HbSOS1蛋白，如序列表的序列2所示。將編碼HbSOS1蛋白的基因命名HbSOS1基因，HbSOS1基因全長(zhǎng)cDNA如序列表的序列1所示，序列1自5’端第71-3490位為開(kāi)放閱讀框。二、HbSCaBP10蛋白及其編碼基因的獲得對(duì)野大麥基因組進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)一種鈣離子感受器，將其命名為HbSCaBP10蛋白，如序列表的序列4所示。將編碼HbSCaBP10蛋白的基因命名HbSCaBP10基因，HbSCaBP10基因全長(zhǎng)cDNA如序列表的序列3所示，序列3自5’端第1-783位為開(kāi)放閱讀框。實(shí)施例2、HbSCaBP10和HbSOS1表達(dá)分析及亞細(xì)胞定位一、表達(dá)分析1、取野大麥種子，置于去離子水中，室溫浸泡12h，然后置于4℃冰箱中過(guò)夜。2、取步驟1處理的種子，用滅菌的去離子水沖洗3遍，置放有濕潤(rùn)紗布的培養(yǎng)皿中，25℃萌芽。經(jīng)過(guò)4-5天待種子大部分發(fā)芽之后，轉(zhuǎn)移至滅菌的盛有1/2Hoagland培養(yǎng)液的玻璃瓶中(玻璃瓶用不透光的紙包住)培養(yǎng)(溫度22-23℃，光照強(qiáng)度2000μmolm-2s-1，光照12h/黑暗12h)，待幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)取材。3、將步驟2長(zhǎng)至兩葉一心的幼苗，分別進(jìn)行如下分組處理：組I：將幼苗置于含有350mMNaCl的1/2Hoagland培養(yǎng)液中，室溫培養(yǎng)6h。組II：將幼苗置于含有350mM甘露醇的1/2Hoagland培養(yǎng)液中，室溫培養(yǎng)6h。組III：將幼苗置于含有10％(體積百分比)PEG6000的1/2Hoagland培養(yǎng)液中，室溫培養(yǎng)6h。組IV：將幼苗置于1/2Hoagland培養(yǎng)液中，4℃培養(yǎng)12h。對(duì)照組：將幼苗置于1/2Hoagland培養(yǎng)液中，室溫培養(yǎng)6h。4、完成步驟3中，取所述幼苗的根和葉，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR的方法檢測(cè)HbSCaBP10和HbSOS1的表達(dá)情況(以Cyclophilin基因?yàn)閮?nèi)參基因)，采用引物F1和引物R1組成的引物對(duì)檢測(cè)HbSCaBP10基因的表達(dá)，采用引物F2和引物R2組成的引物對(duì)檢測(cè)HbSOS1基因的表達(dá)。采用引物F3和引物R3組成的引物對(duì)檢測(cè)Cyclophilin基因的表達(dá)。F1：5’-CATTGAGCGTGAAGAGGTGA-3’；R1：5’-TGACAGATGGATGCTGCAAT-3’；F2：5’-CAGGGTGGTAGCAGGTGATAACT-3’；R2：5’-TCAACAACAACAAAATATCGGTACA-3’；F3：5’-CCTGTCGTGTCGTCGGTCTAAA-3’；R3：5’-ACGCAGATCCAGCAGCCTAAAG-3’。HbSCaBP10的檢測(cè)結(jié)果如圖1b所示。結(jié)果表明，HbSCaBP10主要在地上部(莖葉)表達(dá)，在模擬干旱和低溫脅迫下地上部表達(dá)均下降，而在高鹽脅迫下根部表達(dá)顯著增加。從表達(dá)特性來(lái)看，HbSCaBP10在高鹽脅迫下表達(dá)均顯著增加，說(shuō)明HbSCaBP10與鹽脅迫有關(guān)，可能參與耐鹽性調(diào)控。HbSOS1的檢測(cè)結(jié)果如圖5a所示。結(jié)果表明，HbSOS1主要在野大麥根部表達(dá)，在NaCl脅迫下根部表達(dá)極顯著增加。說(shuō)明HbSOS1受鹽脅迫表達(dá)，其功能與耐鹽性調(diào)控有關(guān)。二、亞細(xì)胞定位1、GFP：：HbSCaBP10融合基因達(dá)載體：將序列表的序列3自5’端第1-783位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入p35S：GFP的BamHI和MfeI酶切位點(diǎn)之間，得到GFP：：HbSCaBP10融合基因表達(dá)載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。2、取生長(zhǎng)5周的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉片，參照文獻(xiàn)：SheenJ.SignalTransductioninMaizeandArabidopsisMesophyllProtoplasts[J].PlantPhysiology，2001，127(4)：1466-1475.中的方法制備擬南芥原生質(zhì)體。3、取步驟1得到的GFP：：HbSCaBP10融合基因表達(dá)載體，通過(guò)PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化步驟2制備的擬南芥原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在23℃培養(yǎng)12-18h，然后使用Confocal激光共聚焦顯微鏡(Nikon，TE2000-E/C1，Japan)觀察GFP的表達(dá)部位。4、取p35S：GFP為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化步驟2制備的擬南芥原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在23℃培養(yǎng)12-18h，然后使用Confocal激光共聚焦顯微鏡(Nikon，TE2000-E/C1，Japan)觀察GFP的表達(dá)部位。結(jié)果如圖1c所示。結(jié)果表明，HbSCaBP10主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，其定位與功能直接相關(guān)。實(shí)施例3、HbSCaBP10在調(diào)控植物耐鹽性中的應(yīng)用一、轉(zhuǎn)基因株系的獲得1、pGreen0029-HbSCaBP10過(guò)表達(dá)載體：將序列表的序列3自5’端第1-783位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pGreen0029載體的BamHI和MfeI酶切位點(diǎn)之間，得到pGreen0029-HbSCaBP10過(guò)表達(dá)載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。2、將步驟1制備的pGreen0029-HbSCaBP10過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌HbSCaBP10。3、采用蘸花法(方法參照文獻(xiàn)：CloughS.J.&BentA.F.，1998.Floraldip：asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.ThePlantJournal16，735-743)用步驟2得到的重組農(nóng)桿菌HbSCaBP10侵染擬南芥突變體sos3，得到T0代種子。在含50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選，在T3代得到突變體sos3轉(zhuǎn)HbSCaBP10基因純合株系。4、采用pGreen0029載體替代pGreen0029-HbSCaBP10過(guò)表達(dá)載體，按照步驟2-3進(jìn)行操作，得到突變體sos3轉(zhuǎn)空載體擬南芥。二、轉(zhuǎn)基因株系檢測(cè)待測(cè)材料為：擬南芥突變體sos3種子、突變體sos3轉(zhuǎn)HbSCaBP10基因純合株系(10s-14、10s-16、10s-121)的T3代種子、突變體sos3轉(zhuǎn)空載體擬南芥的T3代種子。1、取待測(cè)種子(每個(gè)株系60粒)消毒處理后，接種于含有不同濃度(0mM、100mM、125mM、150mM)NaCl的MS平板上，22-23℃培養(yǎng)2天(光照強(qiáng)度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)，再垂直放置生長(zhǎng)7天，記錄各株系發(fā)芽率。2、取待測(cè)種子(每個(gè)株系60粒)消毒處理后，接種于MS平板上培養(yǎng)，取發(fā)芽5天的幼苗，轉(zhuǎn)接至含有不同濃度(0mM、100mM、125mM、150mM、175mM)NaCl的MS平板上，垂直生長(zhǎng)2周(22-23℃、光照強(qiáng)度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)后觀察幼苗的生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)幼苗的主根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)。3、取待測(cè)種子(每個(gè)株系60粒)消毒處理后，接種于營(yíng)養(yǎng)缽(1質(zhì)量份花卉土和1質(zhì)量份跖石混合)，溫室中生長(zhǎng)3周(22-23℃、光照強(qiáng)度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的幼苗進(jìn)行如下分組處理：鹽處理組：第1天：每缽澆30mL含有50mMNaCl的蒸餾水；第3天：每缽澆30mL含有100mMNaCl的蒸餾水；第5天：每缽澆30mL含有150mMNaCl的蒸餾水；第7天：每缽澆30mL含有200mMNaCl的蒸餾水；第9天：每缽澆30mL含有250mMNaCl的蒸餾水。對(duì)照組：第1天：每缽澆30mL蒸餾水；第3天：每缽澆30mL蒸餾水；第5天：每缽澆30mL蒸餾水；第7天：每缽澆30mL蒸餾水；第9天：每缽澆30mL蒸餾水。第16天，記錄各株系萎蔫和抽苔實(shí)情況，并拍照。4、取待測(cè)種子(每個(gè)株系60粒)消毒處理后，接種于MS平板上，發(fā)芽后垂直放置生長(zhǎng)2周(22-23℃、光照強(qiáng)度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)，然后轉(zhuǎn)移至含有不同濃度(0mM、125mM)NaCl的MS平板上1周(22-23℃、光照強(qiáng)度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)。觀察幼苗表型，收集根部和莖葉，用去離子水沖洗5次，吸干，記錄鮮重，用日立Z-8000原子吸收儀測(cè)定Na+、K+含量(單位：mg·g-1DW)。5、取待測(cè)種子(每個(gè)株系60粒)消毒處理后，接種于MS平板上，發(fā)芽后垂直放置生長(zhǎng)3周(22-23℃、光照強(qiáng)度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)，采用Northernblotting檢測(cè)HbSCaBP10表達(dá)情況：提取總RNA，1％甲醛變性凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；擴(kuò)增HbSCaBP10基因完整CDS序列為探針；參照DigDectionstarterKitII(Roche，11585614910)操作說(shuō)明，洗膜和免疫學(xué)檢測(cè)；雜交膜直接在光學(xué)成像系統(tǒng)(FUJILAS-4000，Japan)曝光拍照。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。圖2a為步驟5的檢測(cè)結(jié)果。圖2b為步驟1的檢測(cè)結(jié)果。圖2c為步驟2的表型觀察結(jié)果。圖2d為步驟3的表型觀察結(jié)果。圖2e和圖2f為步驟2的檢測(cè)結(jié)果。圖2g和圖2h為步驟4的檢測(cè)結(jié)果。轉(zhuǎn)基因株系在125-150mMNaCl脅迫下株系的發(fā)芽率顯著高于突變體sos3，因?yàn)樵诖藵舛认峦蛔凅wsos3基本不發(fā)芽(圖2b)。幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，在含不同NaCl平板上轉(zhuǎn)基因株系的幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)(圖2c)、主根長(zhǎng)(圖2e)和側(cè)根數(shù)(圖2f)均顯著優(yōu)于突變體sos3。轉(zhuǎn)基因株系莖葉和根部K+含量均顯著高于突變體sos3(圖2g)，兩部位Na+含量均顯著低于突變體sos3(圖2h)。生長(zhǎng)3周溫室盆栽苗脅迫實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，HbSCaBP10可互補(bǔ)突變體sos3的耐鹽性(圖2d)。HbSCaBP10主要在莖葉發(fā)揮耐鹽調(diào)控作用。實(shí)施例4、HbSCaBP10與蛋白激酶HbCIPK2相互作用分析一、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)1、pBT3-STE-HbCIPK2載體：將序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pBT3-STE載體的SfiI酶切位點(diǎn)之間，得到pBT3-STE-HbCIPK2載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。2、pPR3-STE-HbSCaBP10載體：將序列表的序列3自5’端第1-738位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pPR3-STE載體的SfiI酶切位點(diǎn)之間，得到pPR3-STE-HbSCaBP10載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。3、根據(jù)酵母雙雜交試劑盒DUALmembranestarterkits(Switzerland，P01201-P01229)操作說(shuō)明，以步驟1構(gòu)建的pBT3-STE-HbCIPK2載體為誘餌載體，采用步驟2構(gòu)建的pPR3-STE-HbSCaBP10載體為捕獲載體，轉(zhuǎn)化酵母NMY51菌株(試劑盒中提供)，觀察菌斑生長(zhǎng)情況，同時(shí)根據(jù)操作說(shuō)明進(jìn)行β-Gal染色分析。采用試劑盒中提供的陽(yáng)性對(duì)照載體作為陽(yáng)性對(duì)照。設(shè)置采用pPR3-STE載體為捕獲載體的陰性對(duì)照。結(jié)果如圖3a所示。酵母菌斑在選擇性培養(yǎng)基梯度稀釋生長(zhǎng)和β-Gal染色分析結(jié)果表明，HbSCaBP10分別與HbCIPK2互作。二、雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)1、HbSCaBP10：：SPYCE融合基因載體：將序列表的序列3自5’端第1-738核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pUC-SPYCE載體的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)之間，得到HbSCaBP10：：SPYCE融合基因載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。2、SPYNE：：HbCIPK2融合基因載體：將序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pUC-SPYNE載體的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)之間，得到SPYNE：：HbCIPK2融合基因載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。3、取生長(zhǎng)5周的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉片，參照文獻(xiàn)：SheenJ.SignalTransductioninMaizeandArabidopsisMesophyllProtoplasts[J].PlantPhysiology，2001，127(4)：1466-1475.中的方法制備擬南芥原生質(zhì)體。4、取步驟1得到的HbSCaBP10：：SPYCE融合基因載體和步驟2得到的SPYNE：：HbCIPK2融合基因載體進(jìn)行分組，通過(guò)PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化步驟3制備的擬南芥原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在23℃培養(yǎng)12-18h，然后使用Confocal激光共聚焦顯微鏡(Nikon，TE2000-E/C1，Japan)觀察。組I：5μgHbSCaBP10：：SPYCE融合基因載體和5μgSPYNE：：HbCIPK2融合基因載體；組II：5μgpUC-SPYCE載體和5μgSPYNE：：HbCIPK2融合基因載體。結(jié)果如圖3b所示。結(jié)果表明，HbSCaBP10與HbCIPK2在細(xì)胞質(zhì)膜上互作。三、免疫共沉淀(CoIP)1、pcDNA3.1-HbSCaBP10-HA質(zhì)粒：人工合成序列3所示的雙鏈DNA分子。以所述雙鏈DNA分子為模板，采用引物F4和引物R4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)之間，得到pcDNA3.1-HbSCaBP10-HA質(zhì)粒(測(cè)序驗(yàn)證正確)。F4：5’-CGGGATCCGCCACCATGGACCCCT-3’：R4：5’-GCTCTAGATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACATGTCTTCGACT-3’：引物R4中，下劃線部分為HA序列。2、pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒：人工合成序列5所示的雙鏈DNA分子。以所述雙鏈DNA分子為模板，采用引物F5和引物R5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，得到pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒(測(cè)序驗(yàn)證正確)。F5：5’-CGGGATCCGCCACCATGGGGGAGC-3’；R5：5’-GGAATTCTTACAGGTCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCATTGATGCCATACATGGTTGC-3’；引物R5中，下劃線部分為myc序列。3、將HEK293T細(xì)胞接種至24孔板(每孔接種5-10×104個(gè)細(xì)胞)，采用DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，37℃靜置培養(yǎng)直至細(xì)胞長(zhǎng)至40-60％。4、完成步驟3后，取所述24孔板，進(jìn)行如下分組處理：組1：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復(fù)合物A，輕微搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h；組2：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復(fù)合物B，輕微搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h；組3：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復(fù)合物C，輕微搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染復(fù)合物A：將1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。轉(zhuǎn)染復(fù)合物B：將1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒和1.2μg的pcDNA3.1-HbSCaBP10-HA質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。轉(zhuǎn)染復(fù)合物C：將1.2μg的pcDNA3.1-HbSCaBP10-HA質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。5、完成步驟4后，收集細(xì)胞，用冷PBS洗一遍，再用細(xì)胞裂解液[150mMNaCl，50mMTris(pH7.6)，1％(v/v)NP40，10％(v/v)甘油]裂解30min，4℃、12000rpm離心15min，收集上清液。6、將步驟5的上清液進(jìn)行蛋白定量，取等量的蛋白分別與小鼠單克隆HAM5抗體(1∶2000，Sigma)和c-Myc抗體(1∶2000，SantaCruz)在4℃孵育3h，然后4℃添加蛋白G/A瓊脂糖磁珠(GEHealthcare公司)孵育1h。然后用細(xì)胞裂解液清洗磁珠3次，結(jié)合蛋白用2×上樣緩沖液(Bio-rad公司)洗脫下來(lái)，在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用相應(yīng)的二抗雜交，用化學(xué)發(fā)光劑(購(gòu)自Thermo公司)在X-光片上曝光。結(jié)果如圖3c所示。結(jié)果表明，免疫共沉淀(CoIP)技術(shù)從生化水平進(jìn)一步證明HbSCaBP10與HbCIPK2存在互作關(guān)系。實(shí)施例5、蛋白激酶HbCIPK2與HbSOS1蛋白相互作用一、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)1、pBT3-STE-HbSOS1載體：將序列表的序列1自5’端第71-3490位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pBT3-STE載體的SfiI酶切位點(diǎn)之間，得到pBT3-STE-HbSOS1載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。2、pPR3-STE-HbCIPK2載體：將序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pPR3-STE載體的SfiI酶切位點(diǎn)之間，得到pPR3-STE-HbCIPK2載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。3、根據(jù)酵母雙雜交試劑盒DUALmembranestarterkits(Switzerland，P01201-P01229)操作說(shuō)明，以步驟2構(gòu)建的pBT3-STE-HbCIPK2載體為誘餌載體，采用步驟1構(gòu)建的pPR3-STE-HbSOS1載體為捕獲載體，轉(zhuǎn)化酵母NMY51菌株(試劑盒中提供)，觀察菌斑生長(zhǎng)情況，同時(shí)根據(jù)操作說(shuō)明進(jìn)行β-Gal染色分析。采用試劑盒中提供的陽(yáng)性對(duì)照載體作為陽(yáng)性對(duì)照。設(shè)置采用pPR3-STE載體為捕獲載體的陰性對(duì)照。結(jié)果如圖4a所示。酵母菌斑在選擇性培養(yǎng)基梯度稀釋生長(zhǎng)和β-Gal染色分析結(jié)果表明，HbSOS1與HbCIPK2互作。二、免疫共沉淀(CoIP)1、pcDNA3.1-HbSOS1-Flag質(zhì)粒：人工合成序列1所示的雙鏈DNA分子。以所述雙鏈DNA分子為模板，采用引物F6和引物R6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的KpnI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，得到pcDNA3.1-HbSOS1-Flag質(zhì)粒(測(cè)序驗(yàn)證正確)。F6：5’-GGGGTACCGCCACCATGGAGGAGG-3’；R6：5’-GCTCTAGATTACTTGTCATCGTCTTTGTAGTCCATGTTGCCTCGT-3’；引物R6中，下劃線部分為Flag序列。2、pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒：人工合成序列5所示的雙鏈DNA分子。以所述雙鏈DNA分子為模板，采用引物F5和引物R5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，得到pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒(測(cè)序驗(yàn)證正確)。F5：5’-CGGGATCCGCCACCATGGGGGAGC-3’；R5：5’-GGAATTCTTACAGGTCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCATTGATGCCATACATGGTTGC-3’；引物R5中，下劃線部分為myc序列。3、將HEK293T細(xì)胞接種至24孔板(每孔接種5-10×104個(gè)細(xì)胞)，采用DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，37℃靜置培養(yǎng)直至細(xì)胞長(zhǎng)至40-60％。4、完成步驟4后，取所述24孔板，進(jìn)行如下分組處理：組1：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復(fù)合物A，輕微搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h；組2：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復(fù)合物B，輕微搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h；組3：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復(fù)合物C，輕微搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染復(fù)合物A：將1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。轉(zhuǎn)染復(fù)合物B：將1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒和1.2μg的pcDNA3.1-HbSOS1-Flag質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。轉(zhuǎn)染復(fù)合物C：將1.2μg的pcDNA3.1-HbSOS1-Flag質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。5、完成步驟4后，收集細(xì)胞，用冷PBS洗一遍，再用細(xì)胞裂解液[150mMNaCl，50mMTris(pH7.6)，1％(v/v)NP40，10％(v/v)甘油]裂解30min，4℃、12000rpm離心15min，收集上清液。6、將步驟5的上清液進(jìn)行蛋白定量，取等量的蛋白分別與Flag抗體(1∶2000，SantaCruz)和c-Myc抗體(1：2000，SantaCruz)在4℃孵育3h，然后4℃添加蛋白G/A瓊脂糖磁珠(GEHealthcare公司)孵育1h。然后用細(xì)胞裂解液清洗磁珠3次，結(jié)合蛋白用2×上樣緩沖液(Bio-rad公司)洗脫下來(lái)，在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用相應(yīng)的二抗雜交，用化學(xué)發(fā)光劑(購(gòu)自Thermo公司)在X-光片上曝光。結(jié)果如圖4b所示。結(jié)果表明，免疫共沉淀(CoIP)技術(shù)從生化水平進(jìn)一步證明HbSOS1與HbCIPK2存在互作關(guān)系。實(shí)施例6、HbSCaBP10、蛋白激酶HbCIPK2和HbSOS1蛋白調(diào)控耐鹽性1、p424pMA1載體：以pDR195載體為模板，采用引物pMA1-SacI-F和引物pMA1-XbaI-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用擴(kuò)增產(chǎn)物取代p424GALL載體SacI和XbaI酶切位點(diǎn)之間的片段，得到p424pMA1載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。pMA1-SacI-F：5’-TGAGCTCCCTGAAACGGAGAAACATAAAC-3’：pMA1-XbaI-R：5’-CTCTAGAGCTGGGGTATATTTTTTTTCTTTCTTTTG-3’；引物pMA1-SacI-F和引物pMA1-XbaI-R中，下劃線部分分別為SacI和XbaI酶切位點(diǎn)。2、p424pMA1-HbSOS1載體：將序列表的序列1自5’端第71-3490位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入步驟1制備的p424pMA1載體的SpeI和SalI酶切位點(diǎn)之間，得到p424pMA1-HbSOS1酵母表達(dá)載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。3、pDR195-HbCIPK2載體：將序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pDR195載體的XhoI和BamHI酶切位點(diǎn)之間，得到pDR195-HbCIPK2酵母表達(dá)載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)。4、pYPGE15-HbSCaBP10載體：將序列表的序列3自5’端第1-738位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pYPGE15載體的BamHI和MfeI酶切位點(diǎn)之間，得到pYPGE15-HbSCaBP10酵母表達(dá)載體(測(cè)序驗(yàn)證正確)5、將載體分組轉(zhuǎn)化至酵母敏鹽突變菌株AXT3K中，對(duì)于單個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的在單缺選擇培養(yǎng)基(SD/-Trp，Clontech公司)上培養(yǎng)至菌液OD600nm＝0.8；對(duì)于兩個(gè)以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的在雙缺選擇培養(yǎng)基(SD/-Trp-Ura，Clontech公司)上培養(yǎng)至菌液OD600nm＝0.8，離心，將沉淀用無(wú)菌水洗滌3次，最后重懸于無(wú)菌水中，按10倍梯度稀釋?zhuān)謩e取3μL原液和各稀釋液滴在含有不同濃度(0mM、75mM、100mM)NaCl的AP培養(yǎng)基(10mM精氨酸、8mM磷酸、2％葡萄糖、2mMMgSO4、1mMKCl、0.2mMCaCl2，500ng/mlH38O4，50ng/mlCuSO4，100ng/mlKI，400ng/mlMnSO4，200ng/mlNa2MoO4，400ng/mlZnSO4，10ng/ml生物素，0.4ng/ml煙草酸，2ug/ml肌醇，0.4ng/ml泛酸鈣)上，在30℃培養(yǎng)3天觀察菌斑生長(zhǎng)情況。組I：5μgp424pMA1載體；組II：5μgp424pMA1-HbSOS1載體；組III：5μgpDR195-HbCIPK2載體和5μgp424pMA1-HbSOS1載體；組IV：5μgpYPGE15-HbSCaBP10載體、5μgpDR195-HbCIPK2載體和5μgp424pMA1-HbSOS1載體。結(jié)果如圖5b所示。將HbSOS1單獨(dú)在AXT3K突變體中表達(dá)后可以在含75mMNaCl的AP平板上生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)空載體的菌株不能生長(zhǎng)。HbSOS1與HbCIPK2組合表達(dá)與HbSOS1單獨(dú)表達(dá)沒(méi)有差別。HbSCaBP10組合HbCIPK2、HbSOS1表達(dá)后，該菌株不僅在含75mMNaCl的AP平板上生長(zhǎng)，還可以在含100mMNaCl平板上生長(zhǎng)。<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院<120>植物耐鹽相關(guān)蛋白HbSCaBP10及其編碼基因與應(yīng)用<160>6<210>1<211>3652<212>DNA<213>野大麥（Hordeumbrevisubulatum）<400>1aagcagtggtatcaacgcagagtacatggggactgaaagagcagtccacctcgcctcatc60cacgccggcgatggaggaggaggccggcgccccgagccccgacgacgccgtgctcttctt120cggggtgtccctcgtgctgggcatcgcctcccgccacctcctccgcggcacccgcgtccc180ctacaccgtcgccctcctcgtcctcggcgtcgccctcggcggcctcgagtacgggaccaa240gcacggcctgggcaagctcggaaatggcattcgcatctgggcggccataaatcccgatct300acttctggccgttttcctccccgccctcctcttcgaaagctccttctcaatggaagtcca360ccaaatcaagaaatgcatggcacagatggtgttacttgctgttccaggtgtggtgatctc420aacagttttgcttggcactgctgtaaagcttacttttccatacgactggaactggaaaac480atcgttcttgtttagtggactgcttagtgcaacagaccctgttgctgtggtcgctcttct540aaaagatctaggagcaagcaaaaagctcagtacaataattgaaggagaatccttaatgaa600tgatgggactgctattgttgtctatcagttattctatcgaatggtgcttggaagaacttt660tgatgcagggtccataattaagttcttgtcagaagtttcacttggagctgttgctctagg720ccttgcatttggagttgcatcagtattatggctgggatttattttcaatgatacaatcat780agagatttcacttacccttgctgtcagctatattgctttcttcactgcgcaagatgcatt840ggagatctctggtgttttggccgtcatgaccttggggatgttctatgctgctttcgcaaa900aactgcttttaagggtgacagccaggaaagtttgcatcatttctgggaaatggtggctta960cattgcgaacacacttattttcatactgagtggggttgttattgcagatggtgtactaca1020agataatattcattttgagaggcatggcacatcatgggggttccttcttctgctctatgt1080gtttgtgcaaatatcgcgtgctgtagttgtcggtgttttgtatccattattgagtcactt1140tggatatggtatggacgtcaaagaagccacagttcttgtttggtcagggctgcgaggggc1200tgttgctctatcactctctctgtctgttaaacgtgctagtgattcagttcaatcttatct1260gaaaccagaagttggaacaatgtttgtgttcttcacaggtggtatcgtgtttctgacatt1320gattttgaatggttccaccacacaatttttgttgcacctgcttggcttgggaaaattgtc1380agcaacaaagcttcgtgtattgaagtatacacggtatgaaatgctaaacaaggcattgga1440ggcttttggtgatctcagggatgatgaggaacttgggcctgctgattggattactgtgaa1500gaaacatatcacatgtttgaataacttggaagatgaacaagcacatccccatgatgttcc1560tgacaaggatgatcacgtacataccatgaatttggaggatactcgagtgcggcttttgaa1620tggtgtgcaagctgcttactggggaatgcttgaagaggggcgaataactcaatctacagc1680aaatatgttaatgagatcggttgatgaggctatggatcttgtttctagccaatcattatg1740cgactggaatggtttgcggtccagtgttcatttcccaaagtattataggttccttcagat1800gagcagattgccacgaaagcttgtcacatacttcacggtagaaagattggagttaggatg1860ttacatctgtgcggcatttctccgtgctcatagaatcgcgaggagacaactacatgattt1920tcttggtgatagtgatattgcaagaatcgtcatcaatgaaagtaccgctgcgggggagga1980agctaaaaagtttctggaagatgttcgtgttacatttcctcaggtgcttcgtgtattaaa2040gactcgacaagtaacttatgcggtattgacacacttgagcgagtatattcaagacctcgg2100gaagacagggttgctcgaggaaaaggaaatagttcatctcgatgatgctttgcagacaga2160cttgaagaaacttaagaggaacccaccactggtgaaaatgccaagaattagcgaacttct2220aaacacccatcctttagttggtgcactgcctgctgctgctcgtgatccgttattaagtaa2280tacaaaagaatcaataaaagtacatggaacgatcctttacagagaaggctcaaggccgac2340tggtatatggcttgtttcgactggaattgtaaagtggacaagtcagagactcagcaccag2400gcattcactggatccaatattgtcacatggaagtactttgggtctatacgaggcattaat2460tggaaagccatatatttgtgacattattacagaatcggtggtgcattgtttcttcattga2520agcggagaaaatagagcaactgcgccagtctgatccttctattgaggatttcatgtggca2580ggaaagtgctctagttattgcaaggatgtttctcccccagatatttgagaaaatggcaat2640gcgtgagatgagggttctcatttctgaaagatccagtatgaaaatctacattaagggtga2700agacattgaactcgggcctaattacatcggcatcttattggaaggattcctgaagacaga2760gaaccgaaattcgatcaaacatccagctgtgctgctgccgtcgaacactgatttgaattc2820atttggcttgcagtcttcagccttgaacattatagactactgctatactgcatcgagtta2880tcaggtggaagctagatcaagggctatcttgtttgaaatagggagggccgatatggaagc2940cgatgtacaaagaagtgcatcaatgctgtctcccacccttggaccaccacgaacgcagag3000caaggagcatgttggtttgctcaggtggccggaaaattctgggagatccagagggcctgg3060aaatccaagcttagctgaaatcagaaaccagcctggtaacttctctgctaaagccttgca3120agtcagcatgtacgggggcatgatggatgacatgctccctgctcagcggcggcaaccgag3180gtttgatcatgtagaaggaaaccagaagcacagcttatcctatccagaggtgccttcaag3240ggcatccaacacgcggtctctgctttctgtgaagtcggcgggtcccagtgtgatgaacag3300aaaatctgctcccgctcaagctccggctcctgagattgcccccttttcaccccaagcagc3360tggccgggtacgcagggtggtagcaggtgataactcgagtgacgattccgagggggaaga3420cgttgtcagagtggactctcccggcatgctctctctccatccaccctctggcccacgacg3480aggcaactgacggatgcagcatgtaccgatattttgttgttgttgaataagaacttccaa3540aaaatggcagcatgtatatctctatatgtgtaaaatatacgataataacatcttttgtgg3600aacttgagggtgcaaagttggtggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3652<210>2<211>1139<212>PRT<213>野大麥（Hordeumbrevisubulatum）<400>2MetGluGluGluAlaGlyAlaProSerProAspAspAlaValLeuPhe151015PheGlyValSerLeuValLeuGlyIleAlaSerArgHisLeuLeuArg202530GlyThrArgValProTyrThrValAlaLeuLeuValLeuGlyValAla354045LeuGlyGlyLeuGluTyrGlyThrLysHisGlyLeuGlyLysLeuGly505560AsnGlyIleArgIleTrpAlaAlaIleAsnProAspLeuLeuLeuAla65707580ValPheLeuProAlaLeuLeuPheGluSerSerPheSerMetGluVal859095HisGlnIleLysLysCysMetAlaGlnMetValLeuLeuAlaValPro100105110GlyValValIleSerThrValLeuLeuGlyThrAlaValLysLeuThr115120125PheProTyrAspTrpAsnTrpLysThrSerPheLeuPheSerGlyLeu130135140LeuSerAlaThrAspProValAlaValValAlaLeuLeuLysAspLeu145150155160GlyAlaSerLysLysLeuSerThrIleIleGluGlyGluSerLeuMet165170175AsnAspGlyThrAlaIleValValTyrGlnLeuPheTyrArgMetVal180185190LeuGlyArgThrPheAspAlaGlySerIleIleLysPheLeuSerGlu195200205ValSerLeuGlyAlaValAlaLeuGlyLeuAlaPheGlyValAlaSer210215220ValLeuTrpLeuGlyPheIlePheAsnAspThrIleIleGluIleSer225230235240LeuThrLeuAlaValSerTyrIleAlaPhePheThrAlaGlnAspAla245250255LeuGluIleSerGlyValLeuAlaValMetThrLeuGlyMetPheTyr260265270AlaAlaPheAlaLysThrAlaPheLysGlyAspSerGlnGluSerLeu275280285HisHisPheTrpGluMetValAlaTyrIleAlaAsnThrLeuIlePhe290295300IleLeuSerGlyValValIleAlaAspGlyValLeuGlnAspAsnIle305310315320HisPheGluArgHisGlyThrSerTrpGlyPheLeuLeuLeuLeuTyr325330335ValPheValGlnIleSerArgAlaValValValGlyValLeuTyrPro340345350LeuLeuSerHisPheGlyTyrGlyMetAspValLysGluAlaThrVal355360365LeuValTrpSerGlyLeuArgGlyAlaValAlaLeuSerLeuSerLeu370375380SerValLysArgAlaSerAspSerValGlnSerTyrLeuLysProGlu385390395400ValGlyThrMetPheValPhePheThrGlyGlyIleValPheLeuThr405410415LeuIleLeuAsnGlySerThrThrGlnPheLeuLeuHisLeuLeuGly420425430LeuGlyLysLeuSerAlaThrLysLeuArgValLeuLysTyrThrArg435440445TyrGluMetLeuAsnLysAlaLeuGluAlaPheGlyAspLeuArgAsp450455460AspGluGluLeuGlyProAlaAspTrpIleThrValLysLysHisIle465470475480ThrCysLeuAsnAsnLeuGluAspGluGlnAlaHisProHisAspVal485490495ProAspLysAspAspHisValHisThrMetAsnLeuGluAspThrArg500505510ValArgLeuLeuAsnGlyValGlnAlaAlaTyrTrpGlyMetLeuGlu515520525GluGlyArgIleThrGlnSerThrAlaAsnMetLeuMetArgSerVal530535540AspGluAlaMetAspLeuValSerSerGlnSerLeuCysAspTrpAsn545550555560GlyLeuArgSerSerValHisPheProLysTyrTyrArgPheLeuGln565570575MetSerArgLeuProArgLysLeuValThrTyrPheThrValGluArg580585590LeuGluLeuGlyCysTyrIleCysAlaAlaPheLeuArgAlaHisArg595600605IleAlaArgArgGlnLeuHisAspPheLeuGlyAspSerAspIleAla610615620ArgIleValIleAsnGluSerThrAlaAlaGlyGluGluAlaLysLys625630635640PheLeuGluAspValArgValThrPheProGlnValLeuArgValLeu645650655LysThrArgGlnValThrTyrAlaValLeuThrHisLeuSerGluTyr660665670IleGlnAspLeuGlyLysThrGlyLeuLeuGluGluLysGluIleVal675680685HisLeuAspAspAlaLeuGlnThrAspLeuLysLysLeuLysArgAsn690695700ProProLeuValLysMetProArgIleSerGluLeuLeuAsnThrHis705710715720ProLeuValGlyAlaLeuProAlaAlaAlaArgAspProLeuLeuSer725730735AsnThrLysGluSerIleLysValHisGlyThrIleLeuTyrArgGlu740745750GlySerArgProThrGlyIleTrpLeuValSerThrGlyIleValLys755760765TrpThrSerGlnArgLeuSerThrArgHisSerLeuAspProIleLeu770775780SerHisGlySerThrLeuGlyLeuTyrGluAlaLeuIleGlyLysPro785790795800TyrIleCysAspIleIleThrGluSerValValHisCysPhePheIle805810815GluAlaGluLysIleGluGlnLeuArgGlnSerAspProSerIleGlu820825830AspPheMetTrpGlnGluSerAlaLeuValIleAlaArgMetPheLeu835840845ProGlnIlePheGluLysMetAlaMetArgGluMetArgValLeuIle850855860SerGluArgSerSerMetLysIleTyrIleLysGlyGluAspIleGlu865870875880LeuGlyProAsnTyrIleGlyIleLeuLeuGluGlyPheLeuLysThr885890895GluAsnArgAsnSerIleLysHisProAlaValLeuLeuProSerAsn900905910ThrAspLeuAsnSerPheGlyLeuGlnSerSerAlaLeuAsnIleIle915920925AspTyrCysTyrThrAlaSerSerTyrGlnValGluAlaArgSerArg930935940AlaIleLeuPheGluIleGlyArgAlaAspMetGluAlaAspValGln945950955960ArgSerAlaSerMetLeuSerProThrLeuGlyProProArgThrGln965970975SerLysGluHisValGlyLeuLeuArgTrpProGluAsnSerGlyArg980985990SerArgGlyProGlyAsnProSerLeuAlaGluIleArgAsnGlnPro99510001005GlyAsnPheSerAlaLysAlaLeuGlnValSerMetTyrGlyGly101010151020MetMetAspAspMetLeuProAlaGlnArgArgGlnProArgPhe102510301035AspHisValGluGlyAsnGlnLysHisSerLeuSerTyrProGlu104010451050ValProSerArgAlaSerAsnThrArgSerLeuLeuSerValLys105510601065SerAlaGlyProSerValMetAsnArgLysSerAlaProAlaGln107010751080AlaProAlaProGluIleAlaProPheSerProGlnAlaAlaGly108510901095ArgValArgArgValValAlaGlyAspAsnSerSerAspAspSer110011051110GluGlyGluAspValValArgValAspSerProGlyMetLeuSer111511201125LeuHisProProSerGlyProArgArgGlyAsn11301135<210>3<211>783<212>DNA<213>野大麥（Hordeumbrevisubulatum）<400>3atggacccctcccgctcatccaacgcccttgggtcgagaagctctctgacgctcggggag60ctcgcgtgcatggcattgttcccggtgctcgccgtggtggacgcggtcgccctcgccgcc120gcgcactgcttccagaagcgcccgcccgccctccgtgcccacgcgcgccagcgccaccga180gcccgcggccgcctcacgttccgtgagctcgccgacgagtcatgctgcttctcggtgaac240gaggtggaggccctgtacgagctgtacaagaaaatcagctgctccatcgtcaacgacggc300ctgatccataaggaggagctgcagctagctttgtttatgacaccgtcaggcaagaatctg360ttcttagatagggttttcgatctttttgatgaaaagaaaaattctgttattgaattcgaa420gagtttatccatgcaataagtgtgtttcatccaaatgctcccatggaagataaaattaat480ttttcgttcagattatacgatttgaggcaaactggtttcattgagcgtgaagaggtgaag540caaatggttgttgctactttattggagtcacaggttgagctgtctgatgagcttgttgaa600gcgatactagacaagacatttgaggatgctgataccgatggggacaacaggattagcaga660caggagtggaaagcttttgtattgcagcatccatctgtcataaagaagatgacactgcct720tccctcaaggacactacgtcggcgttccccagcttcgttttcaacacacaagtcgaagac780tag783<210>4<211>260<212>PRT<213>野大麥（Hordeumbrevisubulatum）<400>4MetAspProSerArgSerSerAsnAlaLeuGlySerArgSerSerLeu151015ThrLeuGlyGluLeuAlaCysMetAlaLeuPheProValLeuAlaVal202530ValAspAlaValAlaLeuAlaAlaAlaHisCysPheGlnLysArgPro354045ProAlaLeuArgAlaHisAlaArgGlnArgHisArgAlaArgGlyArg505560LeuThrPheArgGluLeuAlaAspGluSerCysCysPheSerValAsn65707580GluValGluAlaLeuTyrGluLeuTyrLysLysIleSerCysSerIle859095ValAsnAspGlyLeuIleHisLysGluGluLeuGlnLeuAlaLeuPhe100105110MetThrProSerGlyLysAsnLeuPheLeuAspArgValPheAspLeu115120125PheAspGluLysLysAsnSerValIleGluPheGluGluPheIleHis130135140AlaIleSerValPheHisProAsnAlaProMetGluAspLysIleAsn145150155160PheSerPheArgLeuTyrAspLeuArgGlnThrGlyPheIleGluArg165170175GluGluValLysGlnMetValValAlaThrLeuLeuGluSerGlnVal180185190GluLeuSerAspGluLeuValGluAlaIleLeuAspLysThrPheGlu195200205AspAlaAspThrAspGlyAspAsnArgIleSerArgGlnGluTrpLys210215220AlaPheValLeuGlnHisProSerValIleLysLysMetThrLeuPro225230235240SerLeuLysAspThrThrSerAlaPheProSerPheValPheAsnThr245250255GlnValGluAsp260<210>5<211>1689<212>DNA<213>野大麥（Hordeumbrevisubulatum）<400>5cccggtttgttcccgacatcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgatt60tggatccatgggggagcagaaggggaatattctgatgcacaagtacgagatggggaagat120gctcgggcaggggacctttgccaaggtctaccatgcccgcaacatcgagacctcgcagag180cgtcgccatcaaggtgaccgacaaggagaaggttatgaagggtgggctcacagatcagat240caagcgcgagatctctgtgatgaagctggtgaagcaccctaacattgttcagatgtatga300ggtcatggcaaccaaaacaaagatttactttgtgttggagcatgtcaagggcggtgagct360gtttaacaaggttcagagaggaaggctcaaggaagacgctgcaaggaagtacttccagca420gctgatctgcgcagttgacttttgtcacagcaggggcgtctatcaccgtgatttgaagcc480ggagaaccttcttcttgatgagaacagcaacctgaaggtttcagatttcggtctgagcac540catttctgaatgcagaaggcttgacgggctgctccacacatcctgcggcactcctgctta600tgttgcccctgaagtgatcaataggaaaggctatgacggcgccaaggctgacatctggtc660ttgtggggtgatcctctttgttcttttggctgggtatctccctttccaggataagaattt720gatgaacatgtataagaagattgggaaagcagagttcaaatgcccgagctggttctcttc780agatatccgaaggcttctgctaaggattctcgatcctaaccccagcacaaggatctcgat840tgaaagaatcatggaacatccttggttcaggaagggtctggatgcaaagctgctcagata900caatttacaagcaaaagatgctgtccctgctgctgacatgactgtgacttctgattcccc960tagcagcagcaactcagcaattgaaggcaaggaacaagaagcgaaaaagctctccaactt1020gaatgcctttgatataatctccctctcaaatggactcgacctctccggtatgtttgagga1080caacgacaagaagagggagtccaagttcacgtccaccaactcggcttcgacgatcgtatc1140caagatcgaggacatcgcaaagggcatgcgactgaagctcgtcaagaaagatggtggcat1200gttgaagatggaaggctccaagcccggaaggaaaggtgtcatgtctattgatgctgagat1260attcgaggtcacccctgacttccatctcgtggagttgaagaagacaaacggcgacactct1320ggagtaccagagggtcttgaaccaggagatgaggccagcgctgaaggacatagtctgggc1380ttggcaaggcgagccgcagccgcagccgcagcagcaaccatgttgatgttgagaagaact1440gtgccaagtgcgacattttactagctgagtcaattaccaggcgttcgtgtgtttctgtaa1500tttttattatcccagtttgttattcgtttccattcccttcccttcgtgatgtctgtgtaa1560acttcagttatcatcttttgatgaagacttatttaaaagcatgctgtctccagaacagat1620gccaagtcgttcaatgctttttcatggacagcgcgtttgttaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1680aaaaaaaaa1689<210>6<211>452<212>PRT<213>野大麥（Hordeumbrevisubulatum）<400>6MetGlyGluGlnLysGlyAsnIleLeuMetHisLysTyrGluMetGly151015LysMetLeuGlyGlnGlyThrPheAlaLysValTyrHisAlaArgAsn202530IleGluThrSerGlnSerValAlaIleLysValThrAspLysGluLys354045ValMetLysGlyGlyLeuThrAspGlnIleLysArgGluIleSerVal505560MetLysLeuValLysHisProAsnIleValGlnMetTyrGluValMet65707580AlaThrLysThrLysIleTyrPheValLeuGluHisValLysGlyGly859095GluLeuPheAsnLysValGlnArgGlyArgLeuLysGluAspAlaAla100105110ArgLysTyrPheGlnGlnLeuIleCysAlaValAspPheCysHisSer115120125ArgGlyValTyrHisArgAspLeuLysProGluAsnLeuLeuLeuAsp130135140GluAsnSerAsnLeuLysValSerAspPheGlyLeuSerThrIleSer145150155160GluCysArgArgLeuAspGlyLeuLeuHisThrSerCysGlyThrPro165170175AlaTyrValAlaProGluValIleAsnArgLysGlyTyrAspGlyAla180185190LysAlaAspIleTrpSerCysGlyValIleLeuPheValLeuLeuAla195200205GlyTyrLeuProPheGlnAspLysAsnLeuMetAsnMetTyrLysLys210215220IleGlyLysAlaGluPheLysCysProSerTrpPheSerSerAspIle225230235240ArgArgLeuLeuLeuArgIleLeuAspProAsnProSerThrArgIle245250255SerIleGluArgIleMetGluHisProTrpPheArgLysGlyLeuAsp260265270AlaLysLeuLeuArgTyrAsnLeuGlnAlaLysAspAlaValProAla275280285AlaAspMetThrValThrSerAspSerProSerSerSerAsnSerAla290295300IleGluGlyLysGluGlnGluAlaLysLysLeuSerAsnLeuAsnAla305310315320PheAspIleIleSerLeuSerAsnGlyLeuAspLeuSerGlyMetPhe325330335GluAspAsnAspLysLysArgGluSerLysPheThrSerThrAsnSer340345350AlaSerThrIleValSerLysIleGluAspIleAlaLysGlyMetArg355360365LeuLysLeuValLysLysAspGlyGlyMetLeuLysMetGluGlySer370375380LysProGlyArgLysGlyValMetSerIleAspAlaGluIlePheGlu385390395400ValThrProAspPheHisLeuValGluLeuLysLysThrAsnGlyAsp405410415ThrLeuGluTyrGlnArgValLeuAsnGlnGluMetArgProAlaLeu420425430LysAspIleValTrpAlaTrpGlnGlyGluProGlnProGlnProGln435440445GlnGlnProCys450當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3