本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種山桃醇腈酶pdhnl2及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

醇腈酶(hydroxynitrilelyase,hnl；e.c.4.1.2.x)是一種廣泛存在于高等植物中的裂解酶，也是植物用來(lái)抵御外敵的關(guān)鍵酶，在生理?xiàng)l件下，hnl參與植物的生氰作用或氨基酸的合成代謝。作為一種生物催化劑，hnl還能高度選擇性的可逆催化由氫氰酸(hydrogencyanide,hcn)和醛(或酮)生成r或s型手性氰醇的反應(yīng)，還可轉(zhuǎn)化成羥基化合物、胺基合成物、羧基化合物等多種重要手性中間體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成多種手性藥物。例如，利用hnl催化產(chǎn)生的鄰氯扁桃腈，可以進(jìn)一步合成(r)-鄰氯扁桃酸；(r)-鄰氯扁桃酸可以合成新型安全高效的抗血小板聚集藥物氯吡格雷(clopidogrel)。氯吡格雷在臨床上用于治療動(dòng)脈粥狀硬化疾病、中風(fēng)、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、預(yù)防心肌梗塞和血栓性并發(fā)癥等。

hnl在自然界中是廣泛存在的，主要分為兩類(lèi)：r構(gòu)型和s構(gòu)型。薔薇科植物包括杏(prunusarmeniaca)、枇杷(eriobotryajaponica)和扁桃(prunusamygdalus)等果實(shí)的核仁中hnl的含量豐富，易提純，已成為工業(yè)生物合成的r型羥腈化合物的主要酶源，而高梁、木薯、三葉膠中的hnl均能立體專(zhuān)一性催化脂肪族、芳香族和雜環(huán)族s型羥腈化合物的合成。因此，在不對(duì)稱(chēng)合成領(lǐng)域中，hnl已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

另一方面，利用生物體系(各種細(xì)胞和酶)作催化劑實(shí)現(xiàn)有機(jī)物的生物轉(zhuǎn)化和生物合成，是當(dāng)今手性有機(jī)合成化學(xué)的研究熱點(diǎn)(patel2002,2003,2004)。生物催化劑作為手性催化劑進(jìn)行反應(yīng)，具有反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少、光學(xué)純度高、立體選擇性和專(zhuān)一性高以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)環(huán)境及社會(huì)發(fā)展，對(duì)綠色化工產(chǎn)業(yè)的建立都有極其重要的應(yīng)用意義和前景。其中，通過(guò)克隆許多物種的hnl基因，包括三葉膠(hbhnl)、木薯(mehnl,)、扁桃(pahnl)、亞麻(luhnl)和擬南芥(athnl)等，分別在大腸桿菌(escherichiacoli)、畢赤酵母(pichiapastoris)及枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)等微生物宿主菌中進(jìn)行表達(dá)，為利用基因工程菌合成手性羥腈化合物奠定了基礎(chǔ)。不過(guò)，山桃醇腈酶及其編碼基因尚未被分離與克隆因此，本領(lǐng)域有必要開(kāi)發(fā)山桃的醇腈酶。該蛋白及其編碼基因可通過(guò)植物轉(zhuǎn)基因和異源表達(dá)的方式進(jìn)行手性醇腈的合成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種山桃醇腈酶pdhnl2及其編碼基因與應(yīng)用。

本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)pdhnl2來(lái)自山桃(prunusdavidiana)，具有醇腈酶的功能，為如下(a)、(b)或(c)的蛋白質(zhì)：

(a)由seqidno.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將seqidno.1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基取代和/或缺和/或添加且具有醇腈酶功能的由seqidno.1衍生的序列相似度大于90％的蛋白質(zhì)；

(c)包括由(a)或(b)添加了標(biāo)簽序列、信號(hào)序列或分泌信號(hào)序列后所形成的融合蛋白質(zhì)。

上述蛋白質(zhì)pdhnl2可人工合成，也可以先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

本發(fā)明的另一目的是提供該山桃醇腈酶pdhnl2蛋白的編碼基因，具體的，該蛋白的編碼基因序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明通過(guò)rt-pcr方法克隆了山桃醇腈酶基因pdhnl2，其最大開(kāi)放閱讀框序列含有1740bp，編碼seqidno.1所示的579個(gè)氨基酸殘基。

對(duì)于e.coli表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明采用e.coli表達(dá)系統(tǒng)載體，如pet28a(+)。將山桃醇腈酶基因pdhnl2插入e.coli表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體。將獲得的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化e.coli表達(dá)系統(tǒng)，如e.colibl21(de3)表達(dá)載體，獲得可表達(dá)山桃醇腈酶pdhnl2的e.coli重組表達(dá)菌株。本發(fā)明優(yōu)選質(zhì)粒為pet28a(+)，優(yōu)選表達(dá)宿主為e.colibl21(de3)。

對(duì)于p.pastoris表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明采用p.pastoris表達(dá)系統(tǒng)載體，如ppiczαa。將本發(fā)明的山桃醇腈酶基因pdhnl2插入至表達(dá)載體相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，使其核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接，獲得重組表達(dá)載體。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選試驗(yàn)方案，優(yōu)選將山桃醇腈酶基因pdhnl2插入到表達(dá)載體質(zhì)粒ppiczαa，使該核苷酸序列位于aox1啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，獲得可重組p.pastoris表達(dá)質(zhì)粒ppiczαa-pdhnl2。本發(fā)明還提供了包含上述山桃醇腈酶基因pdhnl2的重組菌株，優(yōu)選所述表達(dá)菌株為p.pastorisx33，優(yōu)選為重組菌株p.pastorisx33/pdhnl2。

本發(fā)明的又一目的是提供該山桃醇腈酶pdhnl2的應(yīng)用，用于合成扁桃腈或鄰氯扁桃腈。

本發(fā)明還提供了一種制備山桃醇腈酶pdhnl2的方法，包括以下步驟：

1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到重組表達(dá)菌株；

2)培養(yǎng)重組表達(dá)菌株，誘導(dǎo)(如果是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、過(guò)量表達(dá)重組山桃醇腈酶pdhnl2。

3)回收并純化所表達(dá)的山桃醇腈酶pdhnl2。

本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)山桃醇腈酶pdhnl2、重組菌及山桃醇腈酶pdhnl2制備方法為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)山桃醇腈酶提供了有效途徑。

附圖說(shuō)明

圖1是pdhnl2基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2是本發(fā)明蛋白質(zhì)pdhnl2在e.colibl21(de3)重組表達(dá)菌株中表達(dá)后的聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)圖譜。其中：1，蛋白marker；2，含有空載體pet28a(+)的e.colibl21(de3)誘導(dǎo)6h；3，含有重組表達(dá)載體pet28a-pdhnl2的e.colibl21(de3)誘導(dǎo)6h；4，含有重組表達(dá)載體pet28a-pdhnl2的e.colibl21(de3)誘導(dǎo)12h。

圖3是本發(fā)明蛋白質(zhì)pdhnl2在p.pastorisx33重組表達(dá)菌株中表達(dá)后的聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)圖譜。其中：1，蛋白marker；2，含有重組表達(dá)載體ppiczαa-pdhnl2的p.pastorisx33誘導(dǎo)表達(dá)上清液；3，含有ppiczαa空載體的p.pastorisx33誘導(dǎo)表達(dá)上清液；4，p.pastorisx33誘導(dǎo)表達(dá)上清液。

圖4是山桃醇腈酶pdhnl2的體外活性檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例并附圖，進(jìn)一步詳細(xì)地闡述本發(fā)明。

以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1山桃醇腈酶基因pdhnl2的克隆

以山桃(prunusdavidiana)幼嫩新鮮葉片為材料，提取rna，并反轉(zhuǎn)錄成cdna作為模板，利用具有序列表中seqidno.3和seqidno.4的核苷酸引物序列，pcr擴(kuò)增編碼區(qū)片段。

對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1。切下目標(biāo)dna條帶純化回收，將回收的dna片段連接到pmd19-t載體上，轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐抗性篩選后挑取單克隆子進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證。陽(yáng)性克隆子經(jīng)測(cè)序利用blast軟件進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入的片段與桃(prunuspersica)醇腈酶基因一致性高達(dá)99％。

pdhnl2編碼基因具有序列表中seqidno.2的核苷酸序列。自seqidno.2的5’-端第1-1740位核苷酸為pdhnl2的開(kāi)放閱讀框(openreadingframe,orf)，自seqidno.2的5’-端的第1-3位核苷酸為pdhnl2編碼基因的起始密碼子atg，自seqidno.2的5’-端的第1738-1740位核苷酸為pdhnl2編碼基因的終止密碼子tag。山桃醇腈酶基因pdhnl編碼一個(gè)含有579個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)pdhnl2，具有seqidno.1的氨基酸序列，用軟件預(yù)測(cè)到該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為62.9kda，等電點(diǎn)pi為4.57。

實(shí)施例2山桃醇腈酶pdhnl2基因在e.coli中的異源表達(dá)

一、攜帶pdhnl2基因e.coli表達(dá)系統(tǒng)重組載體的構(gòu)建

以山桃cdna為模板，根據(jù)序列seqidno.2設(shè)計(jì)引物，pcr擴(kuò)增山桃pdhnl2基因編碼區(qū)的dna序列。引物兩端分別引入ncoi和noti酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示。

對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶純化回收，將回收的dna片段連接到pmd19-t載體上，轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐抗性篩選，挑取克隆子進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證后提取質(zhì)粒測(cè)序，得到含有ncoi和noti酶切位點(diǎn)及編碼pdhnl2基因的質(zhì)粒pmd19t-pdhnl2。

將質(zhì)粒pmd19t-pdhnl28和空載體質(zhì)粒pet28a(+)分別在30℃條件下用ncoi和noti雙酶切12h后，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳分析，回收，用t4dna連接酶4℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取卡那霉素抗性的單克隆，提取質(zhì)粒，以seqidno.5和seqidno.6引物進(jìn)行pcr鑒定，并將pcr鑒定正確的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的含有seqidno.1序列并與6×組氨酸(his)融合的重組載體命名為pet28a-pdhnl2。

二、重組表達(dá)載體pet28a-pdhnl2轉(zhuǎn)化宿主、陽(yáng)性克隆鑒定

將步驟一中構(gòu)建的重組表達(dá)載體pet28a-pdhnl2轉(zhuǎn)化e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)將pet28a空載體e.colibl21(de3)，作為對(duì)照菌。挑取卡那霉素抗性的單克隆，以seqidno.5和seqidno.6引物進(jìn)行pcr檢測(cè)。將菌落pcr驗(yàn)證陽(yáng)性的陽(yáng)性克隆克隆子，用于蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

三、pdhnl2基因的原核表達(dá)

將步驟二中鑒定正確的克隆培養(yǎng)過(guò)夜，再將細(xì)菌100倍稀釋于含有卡那霉素(50mg/l)的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液生長(zhǎng)至od600為0.6-0.8時(shí)，加入iptg(終濃度為0.1mm)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，16℃誘導(dǎo)12h，同時(shí)將含有pet28a(+)空載體e.colibl21(de3)作為對(duì)照菌。取誘導(dǎo)過(guò)的菌液1ml，離心收集菌體(4000rpm，10min)，菌體蛋白進(jìn)行12％sds-page電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，在iptg誘導(dǎo)下，含有重組表達(dá)載體pet28a-pdhnl2的e.colibl21(de3)中成功表達(dá)了pdhnl2蛋白，且表達(dá)pdhnl2蛋白的表觀分子量與理論分子量相近(圖2)。

實(shí)施例3山桃醇腈酶pdhnl2基因在p.pastoris中的異源表達(dá)

一、攜帶pdhnl2基因p.pastoris表達(dá)系統(tǒng)重組載體的構(gòu)建

以山桃cdna為模板，根據(jù)序列seqidno.2設(shè)計(jì)引物，pcr擴(kuò)增山桃pdhnl2基因編碼區(qū)的dna序列。引物兩端分別引入kpni和noti酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；引物序列如seqidno.7和seqidno.8所示。

對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶純化回收，將回收的dna片段連接到pmd19-t載體上，轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐抗性篩選，挑取克隆子進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證后提取質(zhì)粒測(cè)序，得到含有kpni和noti酶切位點(diǎn)及編碼pdhnl2基因的質(zhì)粒pmd19t-pdhnl2-1。

將質(zhì)粒pmd19t-pdhnl28和空載體質(zhì)粒ppiczαa分別在30℃條件下用kpni和noti雙酶切12h后，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳分析，回收，用t4dna連接酶4℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取博來(lái)霉素抗性的單克隆，提取質(zhì)粒，以seqidno.7和seqidno.8引物進(jìn)行pcr鑒定，并將pcr鑒定正確的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的含有seqidno.1序列的重組載體命名為ppiczαa-pdhnl2。

二、重組表達(dá)載體ppiczαa-pdhnl2轉(zhuǎn)化宿主、陽(yáng)性克隆鑒定

將步驟一中構(gòu)建的重組表達(dá)載體ppiczαa-pdhnl2經(jīng)drai酶切線性化后，回收，電轉(zhuǎn)化p.pastorisx33感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)將ppiczαa空載體p.pastorisx33，作為對(duì)照菌。挑取博來(lái)霉素抗性的單克隆，以seqidno.7和seqidno.8引物進(jìn)行pcr檢測(cè)。將菌落pcr驗(yàn)證陽(yáng)性的陽(yáng)性克隆克隆子，用于蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

三、pdhnl2基因的酵母表達(dá)

將步驟二中鑒定正確的克隆培養(yǎng)過(guò)夜，再將細(xì)菌100倍稀釋于bmgy液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液生長(zhǎng)至od600為2-6時(shí)，加入甲醇(終濃度為1％)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，30℃誘導(dǎo)96h，同時(shí)將含有ppiczαa空載體p.pastorisx33作為對(duì)照菌。取誘導(dǎo)過(guò)的菌液1ml，離心收集上清液(8000rpm，10min)，菌體蛋白進(jìn)行12％sds-page電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，在甲醇誘導(dǎo)下，含有重組表達(dá)載體ppiczαa-pdhnl2的p.pastorisx33中成功表達(dá)了pdhnl2蛋白，且表達(dá)pdhnl2蛋白的表觀分子量與理論分子量相近(圖3)。

實(shí)施例4pdhnl2降解扁桃腈生成苯甲醛活性檢測(cè)

采用檸檬酸磷酸緩沖液(100mm，ph5.5)進(jìn)行pdhnl2的3ml酶促反應(yīng)，底物為扁桃腈(4.2mm)，將實(shí)施例2和3的得到的e.coli誘導(dǎo)破碎液和p.pastoris上清液，加入底物中，反應(yīng)時(shí)間為10min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。比活力定義為：在反應(yīng)條件下，1min內(nèi)每mg蛋白分解底物生成苯甲醛(消光系數(shù)為18.777mlμmol^-1cm^-1)的摩爾量。結(jié)合圖4，結(jié)果表明，e.coli表達(dá)系統(tǒng)pdhnl2重組蛋白酶活為13.31μmolmin^-1mg^-1protein；p.pastoris表達(dá)系統(tǒng)pdhnl2重組蛋白酶活為71.43μmolmin^-1mg^-1protein；而在對(duì)照(山桃葉片提取液)中的酶活為14.95μmolmin^-1mg^-1protein。

實(shí)施例5pdhnl2合成(r)-鄰氯扁桃腈檢測(cè)

將含有重組pdhnl2蛋白的e.colibl21(de3)和p.pastorisx33工程菌進(jìn)行大量培養(yǎng)，并分別在iptg和甲醇誘導(dǎo)后，離心收集菌體沉淀和上清液。其中，收集的e.colibl21(de3)細(xì)胞用50mm磷酸鹽緩沖液(ph7.5)重懸，并進(jìn)行超聲破碎。待細(xì)胞破碎后，10,000g離心，收集上清液。p.pastorisx33則直接收集上清液。

稱(chēng)取4.9g(0.1mol)nacn加入10ml去離子水和25ml甲基叔丁基醚不斷混合的溶液中。低溫下(4℃條件下)將這兩相充分混合15分鐘。之后，緩慢的加入10ml30％的hcl溶液，同時(shí)將混合溶液慢慢的升至室溫(25℃，25min)。待溶液分層后，保留水相。

將e.colibl21(de3)和p.pastorisx33上清液(20ml)，分別加入足量的hcn水相和1ml0.5mol/l鄰氯苯甲醛。充分混勻并不斷的進(jìn)行攪拌1-2h。分離有機(jī)相，并進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)(hplc)。結(jié)果表明，e.colibl21(de3)和p.pastorisx33菌重組pdhnl2蛋白催化鄰氯苯甲醛生成(r)-鄰氯扁桃腈的轉(zhuǎn)化率分別為54.2％和83.5％。

序列表

<110>江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所

<120>一種山桃醇腈酶pdhnl2及其編碼基因與應(yīng)用

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>579

<212>prt

<213>山桃（prunusdavidiana）

<400>1

metvallysserthrmetseralaileleuvalservalleuhis

51015

leuphevalleuhisleuglntyrsergluvalhisserleuala

202530

asnthrseralahisaspphesertyrleugluphevaltyrasp

354045

alaasnaspthrgluleugluglythrtyrasptyrileileval

505560

glyglyglythralaglycysproleualaalathrleuserala

657075

asntyrservalleuvalleugluargglythrleuprothrglu

808590

tyrproasnleuleuthrseraspglypheiletyrasnleugln

95100105

glngluaspaspgluglnthrprovalgluargphevalsergly

110115120

aspglyileaspasnvalargglyargvalleuglyglythrser

125130135

metileasnalaglyvaltyrvalargalaasnthrserphephe

140145150

asnglnthrglyileglutrpaspmetaspleuvalasnlysthr

155160165

tyrasptrpvalgluaspthrilevalphelysproaspphegln

170175180

phetrpglnasnleuthrglythralapheleugluvalglyile

185190195

leuproaspasnglypheserleuasphisilegluglythrarg

200205210

leuthrglyserthrpheaspasnasnglythrarghisalaser

215220225

aspgluleuleuasnlysglyaspproasnasnleulysvalala

230235240

valhisalaalavalglulysileilepheserserasnserser

245250255

glyvalthralaileglyvaliletyrthraspserasnglythr

260265270

thrhisglnalaphevalargglygluglygluvalileleuser

275280285

alaglyproileglyserproglnleuleuleuleuserglyval

290295300

glyproglusertyrleuthrserleuasnileservalvalala

305310315

serhisprotyrvalglyglntyriletyraspasnproargasn

320325330

pheileasnileleuproproasnproilegluproserthrval

335340345

thrvalleuglyilethrseraspphetyrglncysserleuser

350355360

serleupropheserilealapropheserphepheproilepro

365370375

thrtyrproleuproasnthrthrphealahisilevalasnlys

380385390

valproglyproleuserhisglythrvalthrleuglnserthr

395400405

seraspvalargvalalaproasnvalthrpheasntyrtyrser

410415420

asnserthraspleualahiscysvalserglymetlysargile

425430435

glyglupheleuserseraspalaleulysprotyrlysvalglu

440445450

aspleuproglyilegluglypheaspileleuglyileproleu

455460465

progluasnglnthraspaspalaalaphegluthrphecysgln

470475480

glualavalalasertyrtrphistyrhisglyglycysleuval

485490495

glygluvalleuaspaspasppheargvalthrglyileasnala

500505510

leuargvalvalaspglyserthrpheproserthrproalaser

515520525

hisproglnglyphetyrleumetleuglyargtyrvalglyser

530535540

lysileleuglngluargleualasergluglualaleuhislys

545550555

serthrileglnprolysileleugluserleugluseralaleu

560565570

serphealapheaspthralaalaala

575

<210>2

<211>1740

<212>dna

<213>山桃（prunusdavidiana）

<400>2

atggtgaaatcaacaatgtcagctatactagtatcggtgctgcacctttttgttctacat60

cttcaatattcagaggttcattcgcttgccaatacctctgctcatgattttagctacttg120

gaatttgtttacgatgccaatgacacagagttggaaggaacatacgactacattattgtt180

ggtggaggaacagcagggtgtccattggcagcaactttgtcagcaaactactcggtgctt240

gttctggaaaggggcactcttcctacagaatatccaaacctgttgacttcagacgggttt300

atatataatctgcagcaagaagatgatgaacagacaccagtcgaaaggttcgtgtctgga360

gatggtattgacaatgtaagagggagggtcctcggtggcacgagcatgatcaatgccggg420

gtctacgtaagagctaacacctcgttctttaatcaaacagggattgaatgggatatggat480

ctggttaataagacatatgactgggttgaagacactattgtgttcaagccggatttccaa540

ttttggcaaaatcttacaggaactgcgttcttggaggttggtattcttccagacaatgga600

tttagtttggatcacatagaaggaactagactcaccggctcaactttcgacaataacgga660

accagacatgcatctgatgaactgcttaataaaggagacccaaacaacttgaaagttgca720

gttcatgccgcagtagagaagatcatcttctcttccaattcatcaggtgtgacagctata780

ggagtaatatatactgattcgaacggaacgactcatcaggcatttgtacgtggtgaggga840

gaagttatattgagtgcagggccaattgggtcccctcaacttctactacttagtggtgtt900

ggcccagagtcttacctaacatctctcaacatttcagttgttgcttcccatccatacgtc960

gggcagtatatatatgacaatcctcgtaatttcattaacattttgcccccaaatccaata1020

gaaccctcaactgtaaccgttctaggcattacaagcgacttctaccaatgttctctatca1080

agcttgccattttctattgcaccctttagtttttttcctattccaacttatcccctgcca1140

aatacgactttcgctcacattgttaacaaagttccgggaccattatctcacggtactgtc1200

acgctgcaatcaacctctgatgtgagagtcgctccaaatgtcacattcaactactattcg1260

aattcaactgaccttgctcattgtgttagcggcatgaagaggattggtgaattcttgagc1320

tcagacgcattaaaaccatataaagtggaagatttgccgggcatagaaggttttgatatt1380

ttgggaatacctttgccagagaaccagacagatgatgcagccttcgaaacattttgccaa1440

gaggcagtagcgtcgtactggcattaccacggtggatgccttgtcggggaggtgcttgat1500

gatgatttccgtgttacagggatcaacgcattgcgtgttgttgatggctccaccttccct1560

tccacaccagcgagccatccacagggcttctatctgatgttagggaggtacgtgggctct1620

aaaattttgcaagaaagattagcttcagaggaggctcttcataagtcaacaatccaaccc1680

aaaatcttggagtcgcttgagtcagcattatcctttgcgtttgatactgcggccgcttag1740

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

atggtgaaatcaacaatgtc20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agcggccgcagtatcaaac20

<210>5

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tagaccatggtccttgccaatacctctgct30

<210>6

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctaagcggccgcagtatcaaacgcaaaggat31

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cggggtaccatggtgaaatcaaca24

<210>8

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cattgcggccgccagtatcaaacgc25