本發(fā)明涉及基因高通量測序技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種基于psp的適用于高通量測序中elrna文庫構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

在二代和三代測序技術(shù)中，構(gòu)建高質(zhì)量的測序文庫是高通量測序的關(guān)鍵因素。測序文庫的質(zhì)量直接決定測序產(chǎn)出的數(shù)據(jù)質(zhì)量，進(jìn)而對數(shù)據(jù)分析有著莫大的關(guān)聯(lián)。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，各大試劑公司，高通量測序在動物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域得到了極大的應(yīng)用。高通量測序的建庫方法也逐漸被開發(fā)、成熟、應(yīng)用；面對的樣品類型越來越復(fù)雜，例如單個細(xì)胞、cfdna等，這類樣品的獲得相當(dāng)不容易，難以滿足高通量測序文庫構(gòu)建的要求。

外泌體為細(xì)胞分泌到胞外的囊性小泡，囊泡直徑大小在30-100nm，其內(nèi)包含多種物種，有dna、rna、蛋白質(zhì)。經(jīng)多國科學(xué)家研究，證實外泌體內(nèi)含物能夠一定程度上反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)生理變化，可以作為細(xì)胞生理活動的一種指標(biāo)，也即，外泌體內(nèi)含物是細(xì)胞生理活動的一種標(biāo)記物。外泌體內(nèi)含物在醫(yī)學(xué)上有著重要的意義，尤其是在腫瘤方面，需要更進(jìn)一步地研究。高通量測序方法在這一領(lǐng)域具備技術(shù)條件，是研究外泌體內(nèi)rna種類、含量等方面重要的舉措。

但是，外泌體內(nèi)含物的量非常低，對利用高通量測序技術(shù)對外泌體內(nèi)rna的科研造成一定的影響，具體影響到高通量測序中的建庫成功率。通俗講，文庫構(gòu)建不成功，就無法進(jìn)行高通量測序，也就無法進(jìn)行相關(guān)研究。對此，本發(fā)明就在外泌體內(nèi)含物含量無法增加的情況下，借助于psp(pcr-sort-pcr)文庫富集技術(shù)，引入一種適用于高通量測序中elrna文庫構(gòu)建方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于psp的適用于高通量測序中elrna文庫構(gòu)建方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種基于psp的適用于高通量測序中elrna文庫構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)以elrna為樣品來源；

(2)采用去除核糖體方法進(jìn)行文庫構(gòu)建至pcr反應(yīng)之前；

(3)采用psp文庫富集技術(shù)進(jìn)行兩輪pcr擴(kuò)增。

本發(fā)明方法適用于來源于外泌體包裹的大rna，即elrna。外泌體來源于種類不限，但其包裹物中必須含有elrna。

步驟(1)所述的elrna為外泌體中非小rna，可以簡單界定為rna長度大于或等于200nt。

步驟(3)所述的psp文庫富集技術(shù)依次包括第一輪pcr擴(kuò)增、片段分選或dna純化、第二輪pcr擴(kuò)增三個步驟。

上述第一輪pcr擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)為建庫流程中建議循環(huán)數(shù)的一半，上述第二輪pcr擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)為建庫流程中建議循環(huán)數(shù)的另一半。所述建庫流程中的建議循環(huán)數(shù)為常規(guī)建庫試劑盒給出的pcr條件中的pcr循環(huán)數(shù)。

本發(fā)明技術(shù)方案的關(guān)鍵為：在文庫構(gòu)建過程中將pcr擴(kuò)增由一步擴(kuò)增設(shè)計為兩輪pcr擴(kuò)增，并在兩輪擴(kuò)增中間添加片段分選或dna純化步驟，采用該方法可以在首輪pcr之后，樣品總量有所提高的情況下，利用純化或者片段分選的方式對所得核酸進(jìn)行限定，以期達(dá)到片段分布相對集中的文庫，并且能夠有效避免文庫片段類型的丟失，保證了文庫的片段類型的豐度；另外，通過純化或者片段分選，將首輪pcr產(chǎn)品進(jìn)行除雜，為第二輪pcr提供更加純凈的模板，進(jìn)而提高第二輪pcr的反應(yīng)效率。因此，本發(fā)明技術(shù)可以成功構(gòu)建elrna文庫，而實驗過程中采用一步擴(kuò)增卻無法成功構(gòu)建elrna文庫。

依次包括第一輪pcr擴(kuò)增、片段分選或dna純化、第二輪pcr擴(kuò)增三個步驟。

上述的片段分選為采用磁珠法進(jìn)行核酸片段范圍分選或者采用切取瓊脂糖凝膠的方法進(jìn)行核酸片段范圍分選。上述dna純化的方法包含但不限于磁珠法、過柱法。

步驟(2)中采用去除核糖體方法進(jìn)行文庫構(gòu)建至pcr反應(yīng)之前的過程包括以下步驟：

(ⅰ)對外泌體totalrna進(jìn)行核糖體rna去除；

(ⅱ)對步驟(ⅰ)所得rna進(jìn)行高溫、高鹽打斷；

(ⅲ)對步驟(ⅱ)所得產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cdna，并進(jìn)行純化；

(ⅳ)對步驟(ⅲ)所得產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)、3`末端加a、加接頭，并進(jìn)行純化。

步驟(3)中第一輪pcr擴(kuò)增所用模板為步驟(2)中獲得的純化產(chǎn)物。

步驟(3)中第二輪pcr擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物應(yīng)進(jìn)行純化，所述純化的方式包含但不限于磁珠法、過柱法等。

上述的方法在構(gòu)建高通量測序文庫中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種基于psp的適用于高通量測序中elrna文庫構(gòu)建方法，最優(yōu)選技術(shù)方案具體包括以下步驟：

(1)以elrna為樣品來源；

(2)采用去除核糖體方法進(jìn)行文庫構(gòu)建至pcr反應(yīng)之前；

(ⅰ)利用核糖體rna去除試劑盒對外泌體totalrna進(jìn)行核糖體rna去除；

(ⅱ)利用試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄模塊緩沖液對步驟(ⅰ)所得rna進(jìn)行高溫、高鹽打斷；

(ⅲ)利用試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄模塊對步驟(ⅱ)所得產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cdna，并進(jìn)行純化；

(ⅳ)利用試劑盒提供的建庫模塊對步驟(ⅲ)所得產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)、3`末端加a、加接頭，并進(jìn)行純化；

(3)按照試劑盒提供的溫度條件，對純化后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行首輪pcr擴(kuò)增；然后利用dna純化磁珠對首輪pcr產(chǎn)物進(jìn)行分選或者純化；最后按照試劑盒提供的溫度條件，對分選或純化后的pcr產(chǎn)物進(jìn)行二輪pcr擴(kuò)增。

步驟(ⅲ)和(ⅳ)中所述純化的方法為磁珠純化，但不限于此。

本發(fā)明方法中，步驟(2)所述的文庫構(gòu)建至pcr之前，是指含有單次pcr擴(kuò)增的文庫構(gòu)建流程中的pcr反應(yīng)之前。進(jìn)一步地，若某一建庫流程存在多次pcr反應(yīng)，使用本專利的停靠點應(yīng)結(jié)合實際情況安排。

本發(fā)明的實施例中，使用agilent公司出品的2100核酸檢測儀及相關(guān)試劑，或者perkinelmer公司提供的labchipgxtouch及相關(guān)試劑進(jìn)行樣品片段范圍檢測。建庫試劑為南京諾唯贊生物科技有限公司(vazyme)提供的vahtstotalrna-seq(h/m/r)libraryprepkitfor(#nr603)及配套使用的接頭與引物試劑盒vahtstmdnaadaptersforillumina(#n801-n812)。實驗過程中使用的dna純化磁珠為vahtstmdnacleanbeads(#n412)。

本發(fā)明方法中，步驟(ⅰ)中核糖體rna去除試劑盒為市場上銷售的相應(yīng)試劑盒，去除原理不盡相同，適應(yīng)物種不同，本發(fā)明建議結(jié)合物種，選擇合適的試劑盒。例如本發(fā)明使用的是適用于人類，利用核酸酶消化原理的南京諾唯贊生物科技有限公司提供的nr603試劑盒。

本發(fā)明方法中，步驟(ⅱ)-步驟(ⅳ)按照nr603試劑盒或者類似的試劑盒提供的相關(guān)試劑、條件進(jìn)行。

本發(fā)明方法中，步驟(3)中按照試劑盒給出的pcr溫度條件，將pcr循環(huán)數(shù)調(diào)節(jié)至一半，進(jìn)行首輪pcr擴(kuò)增。

本發(fā)明方法中，步驟(3)中所說的片段分選是對首輪pcr擴(kuò)增獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行磁珠分選，分選產(chǎn)物可以用于第二輪pcr擴(kuò)增。在不需要進(jìn)行分選的文庫構(gòu)建流程中，可以更改為純化。

步驟(2)所述的去核糖體進(jìn)行文庫構(gòu)建的方法為市面上提供的常規(guī)方法，但不限于此。

步驟(3)所述pcr溫度、時間條件應(yīng)與步驟(2)提供的建庫方法所述pcr條件一致，但不限于此，可以根據(jù)實際條件進(jìn)行調(diào)整。

發(fā)明的適用于高通量測序的低起始量文庫構(gòu)建時文庫富集技術(shù)，具有以下優(yōu)點及有益效果：

(1)本發(fā)明針對于含量極低的elrna進(jìn)行文庫構(gòu)建，目的性強(qiáng)；

(2)方法簡易可行、易于實際執(zhí)行；

(3)能夠獲得較多、均一的文庫。

本發(fā)明應(yīng)用新潮，能夠解決最為前沿的elrna樣品文庫構(gòu)建的困難。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中文獻(xiàn)給出的外泌體總rna檢測結(jié)果圖，圖中可以看出大于200nt的樣品含量極低；

圖2為本發(fā)明實施例中自行提取的外泌體總rna檢測結(jié)果圖，圖中可以看出大于200nt的樣品含量極低；

圖3為本發(fā)明實施例中最終文庫使用labchipgxtouch檢測的結(jié)果圖，圖中能夠明顯看到，存在300-500bp范圍內(nèi)的正態(tài)分布的文庫；

具體實施方式

以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；實施例中所用的試劑為市售商品。核酸檢測儀器及試劑為agilent公司出品的2100核酸檢測儀及相關(guān)試劑，或者perkinelmer公司提供的labchipgxtouch及相關(guān)試劑進(jìn)行樣品片段范圍檢測。建庫試劑為南京諾唯贊生物科技有限公司(vazyme)提供的vahtstotalrna-seq(h/m/r)libraryprepkitfor(#nr603)及配套使用的接頭與引物試劑盒vahts^tmdnaadaptersforillumina(#n801-n812)。實驗過程中使用的dna純化磁珠為vahts^tmdnacleanbeads(#n412)。

實施例1本發(fā)明的適用于極低含量的elrna高通量建庫的技術(shù)實例

1.使用2100核酸檢測儀將提取后的外泌體總rna進(jìn)行質(zhì)控，結(jié)果如圖1；

2.在pcr管中加入10ng外泌體總rna；

3.按照建庫試劑盒提供的方法、步驟建庫至連接產(chǎn)物純化后；具體步驟如(ⅰ)～(ⅳ)所示：

(ⅰ)利用核糖體rna去除試劑盒對外泌體totalrna進(jìn)行核糖體rna去除；

(ⅱ)利用試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄模塊緩沖液對步驟(ⅰ)所得rna進(jìn)行高溫、高鹽打斷；

(ⅲ)利用試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄模塊對步驟(ⅱ)所得產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cdna，并用磁珠純化；

(ⅳ)利用試劑盒提供的建庫模塊對步驟(ⅲ)所得產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)、3`末端加a、加接頭，并用磁珠純化；

4.按照建庫試劑盒給出的pcr條件，將cycles調(diào)節(jié)至9，進(jìn)行第一輪pcr反應(yīng)；

5.在pcr反應(yīng)后進(jìn)行磁珠分選，分選出范圍在450-500bp的片段；

6.分選產(chǎn)物進(jìn)行第二輪9cycles的pcr反應(yīng)，pcr產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化；

7.使用qubit對最終產(chǎn)物進(jìn)行濃度測定，結(jié)果為13.01ng/ul，并取8μl，用perkinelmer公司提供的labchipgxtouch進(jìn)行文庫片段范圍檢測，保存圖片(圖3)；

8.通過對最終文庫濃度、片段分布分析，可以得出本發(fā)明在elrna建庫中有效應(yīng)用，能夠獲得滿足上機(jī)條件的文庫，解決了極低含量的elrna建庫難題。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。