本發(fā)明涉及一種對(duì)花生病害有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌的篩選及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

b.amyloliquefaciens最早是由日本科學(xué)家fukumoto于1943年從土壤中分離到的，因分泌解淀粉酶故命名為“解淀粉芽孢桿菌”(fukumoto，1943)。b.amyloliquefaciens屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，可以刺激植物生長(zhǎng)和產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物抑制植物病原物。其代表株系fzb42的基因組大小為3918kb，約包含3693個(gè)編碼區(qū)域(chenetal.，2008)。b.amyloliqueffaciens拮抗活性首先表現(xiàn)在抗真菌活性上，權(quán)春善(2006)從堆肥中分離到植物病原菌尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporum)具有強(qiáng)烈抗菌活性的b.amyloliquefaciensq-12。陳士云(2005)從土壤中分離到b.amyloliquefaciensch-2，能抑制油菜核盤(pán)菌(sclerotiniasclerotiorum)菌絲生長(zhǎng)和菌核形成，并初步認(rèn)定活性物質(zhì)為抗菌蛋白活多肽。pyoungilkim(2004)報(bào)道b.amyloliquefaciensmet0908分泌抗真菌蛋白能有效控制番茄炭疽病菌(colletotrichumlagenarium)。soada.algam1(2004)報(bào)道b.amyloliquefaciens能促進(jìn)植株生長(zhǎng)，有效控制由勞爾青枯病菌ralstoniasolanacearum引起的煙草青枯病。yoshidaetal.，(2002)從桑樹(shù)上分離到的b.amyloliquefaciensrc-2具有抑制桑樹(shù)炭疽病原菌(colletotrichumdematium)、白紋羽菌(rosellinianecatrix)、稻瘟病菌(pyriculariaoryzae)、根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)和水稻白葉枯病(xanthomonascampestris)等植物病原真菌和細(xì)菌，并分離到的一種環(huán)肽類(lèi)化合物伊枯草菌素a(iturin)。b.amyloliquefaciensfzb45具有肌醇六磷酸酶(phytase)活性，可以在缺磷的條件下刺激植物生長(zhǎng)(idrissetal.，2002)。2003年murphy對(duì)部分土壤桿菌研究表明，b.amyloliquefaciens可以通過(guò)刺激植物生長(zhǎng)來(lái)抑制黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicviius，cmv)的侵染。

但是目前，由于花生種植土壤的環(huán)境因素，尚未有報(bào)道可用于花生病害拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌。申請(qǐng)者從根際土壤中篩選了一株對(duì)花生病害有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)lx-17。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明從根際土壤中篩選了一株對(duì)花生病害有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)。

一種解淀粉芽孢桿菌，對(duì)花生病害有拮抗作用，所述解淀粉芽孢桿菌保藏名稱(chēng)解淀粉芽孢桿菌lx17，保藏編號(hào)cgmcc12360，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

本發(fā)明還提供了所述解淀粉芽孢桿菌lx17的應(yīng)用，其在拮抗花生病害中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述解淀粉芽孢桿菌lx17也可廣泛用于沙土種植中，植物病害的防治。

所述應(yīng)用包括其單獨(dú)制備為菌制劑，也包括以其為成分在沙土病害防治中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌lx17，對(duì)沙土種植的植物病害尤其是花生病害具有顯著的防治作用，環(huán)保，且有效作用時(shí)間長(zhǎng)。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀下文優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，各種其他的優(yōu)點(diǎn)和益處對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實(shí)施方式的目的，而并不認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖116srdna擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖；

圖2基于16srdna序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例1拮抗菌株的鑒定方法

1.1菌株的生理生化鑒定(方中達(dá)，1998)，結(jié)果見(jiàn)表1。

(1)取純化后的菌株接種于na培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)18-24h后，取純培養(yǎng)物涂片，分別進(jìn)行革蘭氏染色及運(yùn)動(dòng)力檢測(cè)。

革蘭氏反應(yīng)：用3％氫氧化鉀(koh)來(lái)測(cè)定細(xì)菌革蘭氏染色反應(yīng)。用牙簽挑取菌落放在載玻片上與3％氫氧化鉀液滴攪拌，1min后，慢慢拉出，若拉出絲狀物為革蘭氏陰性菌，反之，則為革蘭氏陽(yáng)性菌。

運(yùn)動(dòng)力檢測(cè)：制備半固體培養(yǎng)基，高壓滅菌后倒入試管約10ml，從培養(yǎng)及頂部針刺接種，若細(xì)菌能運(yùn)動(dòng)則從接種點(diǎn)向下生長(zhǎng)。

(2)將純化的單菌落進(jìn)行生理生化鑒定，包括碳素化合物利用和分解、氮素化合物利用和分解、大分子化合物的分解及其好氧性和是否產(chǎn)生熒光等的鑒定。

碳素化合物利用和分解：將細(xì)菌接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上，28℃培養(yǎng)18～24h，檸檬酸鹽培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色，表示檸檬酸被利用；將細(xì)菌接種于蛋白胨葡萄糖磷酸鹽培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)后，加入甲基紅指示劑，培養(yǎng)液變?yōu)榧t色則為陽(yáng)性反應(yīng)。

氮素化合物利用和分解：將細(xì)菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)來(lái)測(cè)定是否有亞硝酸鹽的生成；將細(xì)菌接種于肉汁凍培養(yǎng)基測(cè)定吲哚有無(wú)產(chǎn)生，從而得出該細(xì)菌對(duì)色氨酸的利用情況。

大分子化合物的分解：利用明膠培養(yǎng)柱穿刺接種細(xì)菌，培養(yǎng)一段時(shí)間觀(guān)察明膠的分解液化情況；將細(xì)菌劃線(xiàn)接種在加入2％可溶性淀粉的肉汁凍培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)一段時(shí)間后加一層碘液，菌落周?chē)霈F(xiàn)無(wú)色透明圈則淀粉被水解。

精氨酸雙水解試驗(yàn)：細(xì)菌穿刺接種，用滅菌的凡士林封管培養(yǎng)，培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為紅色者為陽(yáng)性。

好氧性則通過(guò)半固體穿刺法對(duì)細(xì)菌的好氧性進(jìn)行測(cè)定，如果該菌沿著穿刺線(xiàn)只在開(kāi)管的上部有明顯的擴(kuò)散帶，說(shuō)明該菌是專(zhuān)性好氧菌；在開(kāi)管的上下部都能生長(zhǎng)為兼性厭氧性細(xì)菌；只能在開(kāi)管的下部和閉管中生長(zhǎng)為厭氧性細(xì)菌。

過(guò)氧化氫酶反應(yīng)測(cè)定：將一滴新鮮的細(xì)菌放在潔凈的載玻片上，加一滴過(guò)氧化氫，有氣泡產(chǎn)生為陽(yáng)性反應(yīng)。

熒光性：菌株在金氏b培養(yǎng)基(kba)上產(chǎn)生黃綠色熒光色素，則具有熒光性。

表1活性菌株lx-17的生理生化特征

注：“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)

*參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》。

通過(guò)生理生化測(cè)定，lx-17為好氧菌，厭氧條件下生長(zhǎng)微弱，可以利用檸檬酸鹽做碳源；可以利用無(wú)機(jī)氮源硝酸鹽；v-p實(shí)驗(yàn)為紅色，為陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)合該菌的形態(tài)特征和測(cè)定的生理生化指標(biāo)，初步鑒定該菌為解淀粉芽孢桿菌。

1.2菌株dna提取

進(jìn)行基因組dna的提取，其提取方法主要參照tiangentianampbacteriadnakit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并略加修改，步驟如下：

(1)取細(xì)菌培養(yǎng)液1ml，10000rpm離心1min，盡量吸凈上清；

(2)向菌體沉淀中加入200μl緩沖液ga，震蕩至菌體徹底懸??；

(3)加入4μlrnaase(100mg/ml)溶液，震蕩15s，室溫放置5min；

(4)向管中加入20μl蛋白酶k溶液，混勻；

(5)加入220μl緩沖液gb，震蕩15s，70℃放置10min，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

(6)加入220μl無(wú)水乙醇，充分震蕩混勻15s，此時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

(7)將上一步所得的溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱gb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱cb3中放入收集管中；

(8)向吸附柱cb3中放入500μl緩沖液gd(使用前檢查是否加收入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱cb3中放入收集管中；

(9)向吸附柱cb3中放入700μl漂洗液pw(使用前檢查是否加收入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱cb3中放入收集管中；

(10)向吸附柱cb3中放入500μl漂洗液pw，12000rpm離心30s，倒掉廢液將吸附柱cb3中放入收集管中；

(11)將吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱cb3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

(12)將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液te，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中，-20℃保存。

1.3pcr與序列測(cè)定

(1)提取的dna參照takara公司的16srdnabacterialidentificationpcrkit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，其中正向引物為：5’-agagtttgatcatggctcag-3’(seqidn0.1)，反向引物為：3’-cgcttaccttgttacgactt-5’(seqidno.2)。pcr擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min；53℃退火1min；72℃延伸90s；72℃后延伸5min，共30個(gè)循環(huán)。pcr產(chǎn)物采用1％瓊脂糖凝膠電泳分離，eb染色后置于3uvtmtransilluminator(uvp，usa)下進(jìn)行觀(guān)察，結(jié)果見(jiàn)圖1。

(2)根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的引物與預(yù)期擴(kuò)增片段大小，結(jié)合marker，目的片段在紫外燈下切割下來(lái)，用回收試劑盒silicabeaddnagelextractionkit進(jìn)行dna的回收。16srdna序列測(cè)定由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。通過(guò)blast程序?qū)y(cè)定的序列與genbank(ncbi，網(wǎng)站http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中的序列比較，然后從genbank中獲得和試驗(yàn)菌株序列相近種、屬的16srdna序列進(jìn)行確定。

基于16srdna序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

對(duì)菌株16s進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到約1500bp的基因片斷，提交genebank進(jìn)行blast分析，與已經(jīng)報(bào)道的菌株16srdna進(jìn)行同源比較。結(jié)果顯示該活性菌株的16srdna序列與genbank基因庫(kù)中芽孢桿菌屬的細(xì)菌菌株的解淀粉芽孢桿菌的16srdna序列高度同源，同源率達(dá)99％。結(jié)合傳統(tǒng)的生理生化特性鑒定以及16srdna序列分析的結(jié)果，判定菌株lx-17為解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)。

實(shí)施例2對(duì)花生病害的防治

試驗(yàn)田18畝，劃分為3個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域各6畝，分別為1號(hào)田、2號(hào)田、3號(hào)田，每塊田內(nèi)分為三組，每2畝為一組，各組間設(shè)有隔斷。其中，1號(hào)田只噴灑水，二號(hào)田使用本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌lx17，3號(hào)田噴灑多菌靈水溶液。

所述解淀粉芽孢桿菌lx17配置及使用為采用灌根的方法，震蕩培養(yǎng)菌濃度0d值達(dá)到0.4-0.6后，分別在播種期、播種后10d、20d利用lx17發(fā)酵液1000倍灌根。對(duì)照用50％多菌靈800倍液和清水。花生冠腐病于花生出苗后開(kāi)始調(diào)查，至始花期結(jié)束?；ㄉㄉ　⒒ㄉ捉伈【诨ㄉ斋@前20d進(jìn)行調(diào)查。

病株率＝發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100％

病情指數(shù)＝∑(發(fā)病級(jí)代表值×各級(jí)病株數(shù))×100/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)發(fā)病代表值)

防治效果＝[(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)]×100％

用lx17菌株處理花生菌株，田間試驗(yàn)均表明對(duì)花生冠腐病、根腐病和白絹病均有明顯防治效果，結(jié)果見(jiàn)表2-4。。

表2對(duì)田間對(duì)花生冠腐病的防治效果

表3對(duì)田間對(duì)花生根腐病的防治效果

表4對(duì)田間對(duì)花生白絹病的防治效果

雖然當(dāng)前發(fā)明參考特定的示例被描述，其只是為了解釋的目的而不是對(duì)本發(fā)明的限制，對(duì)實(shí)施方式的改變，增加和/或刪除可以被做出而不脫離本發(fā)明的范圍。