本發(fā)明屬于殘余石油利用
技術領域：
，具體涉及一種厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群的篩選方法。
背景技術：
：對老油田進行深度開發(fā)，提高石油采收率已成為當前老油田開發(fā)的中心任務?，F(xiàn)有提高采收率的技術存在的主要問題是提高幅度有限，大量的殘余石油滯留地下。而怎樣利用大量殘存在油藏中的石油又成為一項重要課題。通過微生物降解石油產(chǎn)甲烷，從而對殘余石油進行利用，成為一條有效途徑。微生物厭氧降解石油產(chǎn)甲烷過程是多種菌群參與的多步驟反應，在整個降解過程中，影響反應速率的因素非常多。油藏中的實驗也證實了在有機質(zhì)(特別是殘余石油)降解過程中，公認的降解終端產(chǎn)物是甲烷，而電子受體耗盡是甲烷產(chǎn)生的基礎，具體來說產(chǎn)甲烷古菌和其它功能菌群協(xié)同作用，最終使殘余石油得到降解并產(chǎn)生甲烷。而地質(zhì)學的研究也表明，在數(shù)千年來，油藏內(nèi)部一直自發(fā)進行著微生物降解石油產(chǎn)甲烷，因為地球內(nèi)部的厭氧環(huán)境有利于這一過程的進行。有研究表明：油藏中的微生物群體是由微好氧菌群和兼性厭氧型以及嚴格厭氧型細菌組成的，烴類提供了它們存活的基礎條件，其可能原因是隨著油藏的開采，會大量注入水和其它物質(zhì)，這改變了油藏本來的環(huán)境。目前，還沒有一種簡單有效的，篩選厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群的方法出現(xiàn)。技術實現(xiàn)要素：為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群的篩選方法，本發(fā)明以油田采出液和含油污泥作為樣品，對其中的菌群進行厭氧培養(yǎng)，在不加入碳源的情況下，菌群只能利用石油烴作為碳源，進而培育篩選出能夠利用石油烴作為碳源的菌群，同時為了得到適應性更強的降解石油烴混合菌群；另外，本發(fā)明同時使用油田采出液和含油污泥作為樣品，并根據(jù)油田采出液和含油污泥中菌群的不同屬性分別篩選出產(chǎn)氣量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的樣品，進而將其混合，得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物；最后，本發(fā)明同時還考慮了最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液的混合比例，從而確保最終得到的混合菌群具有優(yōu)秀的降解能力。本發(fā)明的技術方案是，一種厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群的篩選方法，包括以下步驟：s1、取樣：分別從油田的不同區(qū)域采集油田采出液和含油污泥，作為樣品；s2、厭氧培養(yǎng)：將所述油田采集液和含油污泥分別按照厭氧條件培養(yǎng)；s3、培養(yǎng)結(jié)果測定：一段時間后，測量油田采出液和含油污泥的甲烷產(chǎn)量；s4：菌種混合：篩選油田采集液中產(chǎn)氣量大于0.4μmol/d和含油污泥中產(chǎn)氣量大于1.15μmol/d的樣品，取培養(yǎng)液分別作為最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液，并將最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液進行混合，將最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液分別以體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和2∶1、3∶1、5∶1進行混合，作為樣品分別按照厭氧條件培養(yǎng)，測量甲烷產(chǎn)量，篩選出甲烷產(chǎn)氣量最大培養(yǎng)液，即得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。所述篩選方法以油田采出液和含油污泥作為樣品，對其中的菌群進行厭氧培養(yǎng)，在不加入碳源的情況下，菌群只能利用石油烴作為碳源，進而培育篩選出能夠利用石油烴作為碳源的菌群，同時為了得到適應性更強的降解石油烴混合菌群；另外，本發(fā)明同時使用油田采出液和含油污泥作為樣品，并根據(jù)油田采出液和含油污泥中菌群的不同屬性分別篩選出產(chǎn)氣量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的樣品，進而將其混合，得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物；最后，本發(fā)明同時還考慮了最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液的混合比例，從而確保最終得到的混合菌群具有優(yōu)秀的降解能力。為保證樣品質(zhì)量和多樣性，優(yōu)選的，步驟s1中，所述油田采出液的原油密度為0.87-0.93g/cm3，原油粘度為61.6-169.3mpas，采集所述油田采出液后，使用氮氣密封保存；取距地面30cm以下被石油污染的含油率為5.8-11.3％的含油污泥，取樣后在-5℃下厭氧保存。在油田的不同區(qū)域采集油田采出液或含油污泥，并將不同的樣品分別按照厭氧條件培養(yǎng)；厭氧培養(yǎng)為：取30-40g的油田采出液或含油污泥，和60ml第一無機鹽富集培養(yǎng)基充入到120ml無菌瓶中，30℃下富集培養(yǎng)直到培養(yǎng)瓶中能檢測到穩(wěn)定的甲烷產(chǎn)量，培養(yǎng)結(jié)束。本發(fā)明中，使用的所述第一無機鹽富集培養(yǎng)基的成分及含量為：kh2po45.0g，k2hpo45.0g，nh4cl5.0g，nacl1.0g，mgcl22.0g，cacl20.1g，酵母粉0.5g，l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，硫酸亞鐵銨0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1l。所述第一無機鹽富集培養(yǎng)基能夠滿足菌群生長的需要，保證菌群的正常生長。為使菌群生長的更好，優(yōu)選的，所述第一無機鹽富集培養(yǎng)基中還包括維生素水溶液5ml，所述維生素水溶液中維生素的成分及濃度為：維生素h2.0mg/l，維生素b92.0mg/l，維生素b610mg/l，維生素b15.0mg/l，維生素b25.0mg/l，維生素b120.1mg/l，硫辛酸5.0mg/l。進一步的，所述第一無機鹽富集培養(yǎng)基中還包括微量元素水溶液5ml，所述微量元素水溶液中的成分及濃度為：次氮基三乙酸1.5g/l，氯化鈷0.1g/l，無水氯化錳0.1g/l，氯化亞鐵0.1g/l，六水氯化鈷0.18g/l，氯化鋅0.1g/l，五水硫酸銅0.01g/l，十二水硫酸鋁鉀0.02g/l，硼酸0.01g/l，兩水鉬酸鈉0.01g/l，六水氯化鎳0.025g/l。所述第一無機鹽富集培養(yǎng)基的配制方法為：將培養(yǎng)基中除刃天青、維生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他組分混合，加熱煮沸的同時不斷通入氮氣，直到培養(yǎng)基由粉色變?yōu)闊o色，停止加熱，待體系冷卻后，加入維生素水溶液和微量元素水溶液，滅菌后加入最終質(zhì)量比為0.03％的九水硫化鈉、最終質(zhì)量比為0.02％的碳酸氫鈉，以及刃天青，密封保存。其中，刃天青需要現(xiàn)用現(xiàn)配。由于含油污泥的粘度和濃度較大，為便于后續(xù)的厭氧培養(yǎng)，優(yōu)選的，在對所述含油污泥進行厭氧培養(yǎng)之前，向所述含油污泥中加入10倍重量的第一無機鹽富集培養(yǎng)基進行初級培養(yǎng)6-8小時，初級培養(yǎng)結(jié)束后取上清液繼續(xù)進行厭氧培養(yǎng)。本發(fā)明中，使用色譜儀對生成的甲烷產(chǎn)量進行測定，其中fid的溫度為200℃，氣化進樣器的溫度為150℃；色譜柱的初溫為35℃，保持15min后以5℃/min的升溫速度升溫至200℃，并保持5min，取樣時使用氣體收集器從樣品上方收集氣體，然后再用密封注射器取樣和進樣，進樣體積為0.3ml。步驟s4中，取按不同比例混合后的樣品的上清液15ml，并加入第二無機鹽富集培養(yǎng)基60ml，培養(yǎng)260天。所述第二無機鹽富集培養(yǎng)基的成分及含量為：kh2po45.0g，k2hpo45.0g，nh4cl5.0g，nacl1.0g，mgcl22.0g，cacl20.1g，酵母粉0.5g，l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，硫酸亞鐵銨0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1l。所述第二無機鹽富集培養(yǎng)基中還包括維生素水溶液5ml，所述維生素水溶液中維生素的成分及濃度為：維生素h2.0mg/l，維生素b92.0mg/l，維生素b610mg/l，維生素b15.0mg/l，維生素b25.0mg/l，維生素b120.1mg/l，硫辛酸5.0mg/l。所述第二無機鹽富集培養(yǎng)基中還包括微量元素水溶液5ml，所述微量元素水溶液中的成分及濃度為：次氮基三乙酸1.5g/l，氯化鈷0.1g/l，無水氯化錳0.1g/l，氯化亞鐵0.1g/l，六水氯化鈷0.18g/l，氯化鋅0.1g/l，五水硫酸銅0.01g/l，十二水硫酸鋁鉀0.02g/l，硼酸0.01g/l，兩水鉬酸鈉0.01g/l，六水氯化鎳0.025g/l。所述第二無機鹽富集培養(yǎng)基的配制方法為：將培養(yǎng)基中除刃天青、維生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他組分混合，加熱煮沸的同時不斷通入氮氣，直到培養(yǎng)基由粉色變?yōu)闊o色，停止加熱，待體系冷卻后，加入維生素水溶液和微量元素水溶液，滅菌后加入最終質(zhì)量比為0.03％的九水硫化鈉、最終質(zhì)量比為0.02％的碳酸氫鈉，以及刃天青，密封保存。為了驗證最終產(chǎn)生的氣體為油田采集液或含油污泥中的菌群產(chǎn)生，優(yōu)選的，所述篩選方法還包括使用滅菌組對培養(yǎng)結(jié)果進行驗證：使用滅菌后的樣品按照所述厭氧條件培養(yǎng)，若最終滅菌后的樣品經(jīng)厭氧條件培養(yǎng)后無甲烷產(chǎn)生，則證明甲烷氣體由樣品中的菌群產(chǎn)生。如果若最終滅菌后的樣品經(jīng)厭氧條件培養(yǎng)后有甲烷產(chǎn)生，則證明甲烷氣體不全由樣品中的菌群產(chǎn)生，此時需要重新采用，重復以上步驟，以得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。得到含有降解石油烴混合菌群的混合物，對其中的菌群進行分離，即可得到厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷的菌群。本發(fā)明的有益效果為：所述篩選方法以油田采出液和含油污泥作為樣品，對其中的菌群進行厭氧培養(yǎng)，在不加入碳源的情況下，菌群只能利用石油烴作為碳源，進而培育篩選出能夠利用石油烴作為碳源的菌群，同時為了得到適應性更強的降解石油烴混合菌群；另外，本發(fā)明同時使用油田采出液和含油污泥作為樣品，并根據(jù)油田采出液和含油污泥中菌群的不同屬性分別篩選出產(chǎn)氣量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的樣品，進而將其混合，得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物；最后，本發(fā)明同時還考慮了最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液的混合比例，從而確保最終得到的混合菌群具有優(yōu)秀的降解能力。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明的技術方案進行詳細的描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬于本發(fā)明所保護的范圍。實施例1一種厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群的篩選方法，包括以下步驟：s1、取樣：分別從油田的不同區(qū)域采集油田采出液和含油污泥，作為樣品；本步驟中，采集某油田區(qū)塊的六口油井采出液調(diào)研取樣，將數(shù)個塑料桶裝滿(約5l)，取樣之前通入氮氣密封，取樣后迅速運回實驗室，低溫保存，編號為yh1-yh6；取4份距地面30cm以下被石油污染的含油率為5.8-11.3％的含油污泥，取樣后在-5℃下厭氧保存，分別編號為th1-th6；其中，yh1-yh6的理化性質(zhì)如表1所示。表1：yh1-yh6的理化性質(zhì)附注1：yh代表厭氧培養(yǎng)油田采出液，后面的編號為取樣地油井編號s2、厭氧培養(yǎng)：將所述油田采集液和含油污泥分別按照厭氧條件培養(yǎng)；將不同的樣品分別按照厭氧條件培養(yǎng)，厭氧培養(yǎng)為：取30-40g的油田采出液或含油污泥，和60ml第一無機鹽富集培養(yǎng)基充入到120ml無菌瓶中，30℃下富集培養(yǎng)直到培養(yǎng)瓶中能檢測到穩(wěn)定的甲烷產(chǎn)量，培養(yǎng)結(jié)束。使用的所述第一無機鹽富集培養(yǎng)基的成分及含量為：kh2po45.0g，k2hpo45.0g，nh4cl5.0g，nacl1.0g，mgcl22.0g，cacl20.1g，酵母粉0.5g，l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，硫酸亞鐵銨0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1l。所述第一無機鹽富集培養(yǎng)基中還包括維生素水溶液5ml，所述維生素水溶液中維生素的成分及濃度為：維生素h2.0mg/l，維生素b92.0mg/l，維生素b610mg/l，維生素b15.0mg/l，維生素b25.0mg/l，維生素b120.1mg/l，硫辛酸5.0mg/l。所述第一無機鹽富集培養(yǎng)基中還包括微量元素水溶液5ml，所述微量元素水溶液中的成分及濃度為：次氮基三乙酸1.5g/l，氯化鈷0.1g/l，無水氯化錳0.1g/l，氯化亞鐵0.1g/l，六水氯化鈷0.18g/l，氯化鋅0.1g/l，五水硫酸銅0.01g/l，十二水硫酸鋁鉀0.02g/l，硼酸0.01g/l，兩水鉬酸鈉0.01g/l，六水氯化鎳0.025g/l。將培養(yǎng)基中除刃天青、維生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他組分混合，加熱煮沸的同時不斷通入氮氣，直到培養(yǎng)基由粉色變?yōu)闊o色，停止加熱，待體系冷卻后，加入維生素水溶液和微量元素水溶液，滅菌后加入最終質(zhì)量比為0.03％的九水硫化鈉、最終質(zhì)量比為0.02％的碳酸氫鈉，以及刃天青，密封保存。其中，刃天青需要現(xiàn)用現(xiàn)配。由于含油污泥的粘度和濃度較大，為便于后續(xù)的厭氧培養(yǎng)，在對所述含油污泥進行厭氧培養(yǎng)之前，向所述含油污泥中加入10倍重量的第一無機鹽富集培養(yǎng)基進行初級培養(yǎng)6-8小時，初級培養(yǎng)結(jié)束后取上清液繼續(xù)進行厭氧培養(yǎng)。s3、培養(yǎng)結(jié)果測定：培養(yǎng)400天后，測量油田采出液和含油污泥的甲烷產(chǎn)量；本發(fā)明中，使用色譜儀對生成的甲烷產(chǎn)量進行測定，其中fid的溫度為200℃，氣化進樣器的溫度為150℃；色譜柱的初溫為35℃，保持15min后以5℃/min的升溫速度升溫至200℃，并保持5min，取樣時使用氣體收集器從樣品上方收集氣體，然后再用密封注射器取樣和進樣，進樣體積為0.3ml。具體來說，本實施例中甲烷的產(chǎn)氣測定的具體操作為：氣體組分：安捷倫氣相色譜儀。檢測器：fid200℃；氣化進樣器150℃；色譜柱：pona彈性石英毛細柱(50m×0.2mm×0.5μm)；柱溫：初溫35℃，15min；5℃/min升溫至200℃，5min。取樣時先用氣體收集器從上方收集氣體，然后再用密封注射器取樣，進樣體積：0.3ml，將標準氣體用高純氮氣稀釋成不同濃度，在上述條件下進行分析，修正的面積歸一法定量氣體含量。本實施例中，各樣品的產(chǎn)氣量詳見表2所示表2：各樣品的產(chǎn)氣量結(jié)果表樣品編號yh1yh2yh3yh4yh5yh6產(chǎn)氣量(μmol)70.599.261.7108.3246.90樣品編號th1th2th3th4th5th6產(chǎn)氣量(μmol)68.546625.692.560.730.8s4：菌種混合：篩選油田采集液中產(chǎn)氣量大于0.4μmol/d和含油污泥中產(chǎn)氣量大于1.15μmol/d的樣品，取培養(yǎng)液分別作為最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液，并將最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液進行混合，將最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液分別以體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和2∶1、3∶1、5∶1進行混合，作為樣品分別按照厭氧條件培養(yǎng)，測量甲烷產(chǎn)量，篩選出甲烷產(chǎn)氣量最大培養(yǎng)液，即得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。從表2中能夠得知，yh5和th2符合要求，所以yh5和th2分別作為最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液，將yh5和th2分別以體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和2∶1、3∶1、5∶1進行混合，作為樣品分別按照厭氧條件培養(yǎng)，測量甲烷產(chǎn)量。取按不同比例混合后的樣品的上清液15ml，并加入第二無機鹽富集培養(yǎng)基60ml，培養(yǎng)260天。所述第二無機鹽富集培養(yǎng)基的成分及含量為：kh2po45.0g，k2hpo45.0g，nh4cl5.0g，nacl1.0g，mgcl22.0g，cacl20.1g，酵母粉0.5g，l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，硫酸亞鐵銨0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1l。所述第二無機鹽富集培養(yǎng)基中還包括維生素水溶液5ml，所述維生素水溶液中維生素的成分及濃度為：維生素h2.0mg/l，維生素b92.0mg/l，維生素b610mg/l，維生素b15.0mg/l，維生素b25.0mg/l，維生素b120.1mg/l，硫辛酸5.0mg/l。所述第二無機鹽富集培養(yǎng)基中還包括微量元素水溶液5ml，所述微量元素水溶液中的成分及濃度為：次氮基三乙酸1.5g/l，氯化鈷0.1g/l，無水氯化錳0.1g/l，氯化亞鐵0.1g/l，六水氯化鈷0.18g/l，氯化鋅0.1g/l，五水硫酸銅0.01g/l，十二水硫酸鋁鉀0.02g/l，硼酸0.01g/l，兩水鉬酸鈉0.01g/l，六水氯化鎳0.025g/l。所述第二無機鹽富集培養(yǎng)基的配制方法為：將培養(yǎng)基中除刃天青、維生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他組分混合，加熱煮沸的同時不斷通入氮氣，直到培養(yǎng)基由粉色變?yōu)闊o色，停止加熱，待體系冷卻后，加入維生素水溶液和微量元素水溶液，滅菌后加入最終質(zhì)量比為0.03％的九水硫化鈉、最終質(zhì)量比為0.02％的碳酸氫鈉，以及刃天青，密封保存。取按不同比例混合后的樣品的甲烷產(chǎn)量見表3表3：不同比例混合后的樣品的甲烷產(chǎn)量從上表能夠看出，當yh5和th2的體積比為1∶1時，甲烷的產(chǎn)生效率最高。為了驗證最終產(chǎn)生的氣體為油田采集液或含油污泥中的菌群產(chǎn)生，所述篩選方法還包括使用滅菌組對培養(yǎng)結(jié)果進行驗證：使用滅菌后的樣品按照所述厭氧條件培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是油田采集液還是含油污泥，其最終產(chǎn)生的甲烷的量均為0，由此能夠得出，本實施例中，甲烷氣體均由樣品中的菌群產(chǎn)生，并且使用本實施例中的方法，得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。當前第1頁12