本發(fā)明涉及一種dna片段，特別涉及一種巨大芽孢桿菌具有啟動子功能的dna片段及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在上世紀(jì)60年代，在枯草芽孢桿菌bacillussubtilis之前，巨大芽孢桿菌bacillus.megaterium被定義為深入研究芽孢生成機制的“模式微生物”。分類學(xué)上，在上世紀(jì)90年代，b.megaterium被分為枯草芽孢桿菌屬，盡管巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在基因組結(jié)構(gòu)上有很大的差別。

巨大芽孢桿菌是一種在醫(yī)藥和食品工業(yè)都有廣泛用途的重要的工業(yè)微生物生產(chǎn)菌株之一。目前在巨大芽孢桿菌中高效生產(chǎn)高附加值的蛋白酶仍有許多限制，提高重組蛋白對于科研和工業(yè)生產(chǎn)都有非常重要的作用。其中的一個重要的特點便是需要高強度、高選擇性的啟動子。啟動子的通常具有的兩個特點是：1.轉(zhuǎn)錄強度高，能夠有效地啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄；2.在不需要表達(dá)時受嚴(yán)緊的調(diào)控，而在需要表達(dá)時可以用簡單、廉價的方法進(jìn)行誘導(dǎo)。在早期的研究中發(fā)現(xiàn)，適合在b.subtilis中利用其它的啟動子同樣可以實現(xiàn)在b.megaterium表達(dá)外源基因，如papre和pp43。目前在b.megaterium中研究較多的是木糖啟動子、蔗糖啟動子、淀粉啟動子和t7啟動子。而關(guān)于巨大芽孢桿菌的啟動子的挖掘和應(yīng)用都較少，需要挖掘更多優(yōu)良性狀的不同啟動子運用于工業(yè)化生產(chǎn)中。因此，研究啟動子功能對于了解生物生長發(fā)育、探討生物適應(yīng)環(huán)境的機制及實現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)等均有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種巨大芽孢桿菌具有啟動子功能的dna片段。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述巨大芽孢桿菌具有啟動子功能的dna片段的用途。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種巨大芽孢桿菌具有啟動子功能的dna片段，所述dna片段為如下任一序列：

(a)如seqidno.1所示的核苷酸序列或者其互補序列；

(b)對如seqidno.1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個核苷酸取代、缺失或添加所獲得的，具有與seqidno.1所示的核苷酸序列相同的作為啟動子功能的核苷酸序列或者其互補序列；

(c)對如seqidno.1所示的核苷酸序列添加一個或多個核糖體結(jié)合位點的序列。

所述核糖體結(jié)合位點的序列為如seqidno.2所示的核苷酸序列。

所述的巨大芽孢桿菌具有啟動子功能的dna片段在蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。

一種載體，包含如seqidno.1所示的核苷酸序列和如seqidno.2所示的核糖體結(jié)合位點的序列。

所述的載體優(yōu)選為質(zhì)粒載體；所述的載體含有如seqidno.7所示的核苷酸序列。

一種表達(dá)質(zhì)粒，包含上述載體以及與該載體可操作連接的位于所述具有啟動子功能的dna片段下游編碼異源蛋白質(zhì)核苷酸序列。

所述的異源蛋白質(zhì)核苷酸序列為好熱地芽孢桿菌(geobacilluskaustophilus)編碼的耐熱β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，或為茂原鏈霉菌(streptomycesmobaraensia)編碼的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的核苷酸序列。

一種重組工程細(xì)胞，為上述載體或者上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞得到的細(xì)胞株。

所述的宿主細(xì)胞為芽孢桿菌。

所述的宿主細(xì)胞為枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

1、本發(fā)明提供了一種dna片段，該dna是一啟動子，具有很強的特異表達(dá)活性，在不需要添加誘導(dǎo)物的條件下即能實現(xiàn)外源基因的高表達(dá)，特別是為枯草芽孢桿菌表達(dá)外源基因提供了有效的工具。

2、本發(fā)明涉及運用rna-seq技術(shù)測定巨大芽孢桿菌在對數(shù)生長后期的全基因轉(zhuǎn)錄組，篩選高表達(dá)的基因，在巨大芽孢桿菌中找到一個轉(zhuǎn)錄活性高的基因?？寺∷Y選的高表達(dá)基因?qū)?yīng)的啟動子序列，并應(yīng)用于耐熱β-半乳糖苷酶基因(bgab)的表達(dá)，通過測定bgab的活性，證明篩選的啟動子在枯草芽孢桿菌中具有高活性。應(yīng)用于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mtg)的表達(dá)，通過sds-page電泳圖驗證其蛋白表達(dá)。

附圖說明

圖1是實施例2中生長對數(shù)后期的巨大芽孢桿菌提取總rna電泳圖；其中，泳道1和2分別為生長對數(shù)后期的巨大芽孢桿菌提取總rna。

圖2是實施例3中擴增psoda的pcr產(chǎn)物電泳圖；其中，泳道m(xù)為dnamarker，泳道1和2為psoda的pcr擴增產(chǎn)物。

圖3是實施例4表達(dá)質(zhì)粒pbe-psoda-samyq-bgab的構(gòu)建示意圖。

圖4是實施例5中擴增psoda+samyq片段電泳圖；其中，泳道m(xù)為dnamarker，泳道1為psoda+samyq擴增產(chǎn)物。

圖5是實施例5表達(dá)質(zhì)粒pbe-psoda-samyq-promtg的構(gòu)建示意圖。

圖6是實施例6b.subtilisatcc6051(pbe-psoda-samyq-promtg)轉(zhuǎn)化子mtg表達(dá)的sds-page電泳膠圖；其中，泳道m(xù)為蛋白marker，泳道1為枯草芽孢桿菌b.subtilisatcc6051胞外分泌蛋白，泳道2為b.subtilisatcc6051(pbe-psoda-samyq-promtg)胞外分泌蛋白，箭頭表示目的蛋白mtg的位置。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

以下實施例中所采用的分子生物學(xué)實驗技術(shù)包括pcr擴增、質(zhì)粒提取、dna片段酶切、連接、凝膠電泳等具體參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(sambrookj,russelldw,janssenk,argentinej.黃培堂等譯，2002，北京：科學(xué)出版社)。

從一株巨大芽孢桿菌(bacillusmegateriumdsm319，購于dsmz(德國菌種保藏中心)培養(yǎng)的生產(chǎn)對數(shù)后期階段提取細(xì)菌rna。對細(xì)菌rna進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序建庫，去掉核糖體rna，對mrna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄建立cdna文庫。對細(xì)菌全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，根據(jù)代表基因轉(zhuǎn)錄水平的rpkm值判斷其表達(dá)量水平較高的基因，然后分析其啟動子區(qū)。將所選的啟動子接入載體，測定啟動子在枯草芽孢桿菌中的活性。

實施例1

細(xì)菌的培養(yǎng)：將巨大芽孢桿菌(b.megateriumdsm319)從-80℃甘油管取出劃線于lb固體平板上37℃培養(yǎng)16～24h，挑取單菌落于10ml的1％終濃度玉米淀粉的lb液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)至od60020～25(分光光度計,日本hitachi公司)。

實施例2

細(xì)菌總rna的提取、轉(zhuǎn)錄組文庫的建立及rna-seq測序：收集實施例1得到的細(xì)胞培養(yǎng)液1ml于8000g快速離心1min，用于提取細(xì)菌總rna(見圖1)。具體的提取方法參考o(jì)megabio-tek公司的細(xì)菌總rna提取試劑盒。用于rna-seq測序文庫制備的樣品經(jīng)agilenttechnologies2100bioanalyzer檢測合格，經(jīng)過dnasei(rnasefree)處理混入的dna分子，用ribo-zero(gram-positivebacteria)kit(usa)去掉占總rna絕大多數(shù)的rrna，純化得到的mrna。將mrna先打斷為合適大小的片段，以片段化的mrna為模板，加入反轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物，合成雙鏈cdna，然后用試劑盒qiaquickpcrpurificationkit(qiagen)純化合成的cdna。補平cdna的粘性末端，然后在一條鏈上加上一個腺嘌呤核苷酸，以這個突出的a配對含有突出的t的一級接頭序列。在分別能配對一級接頭兩端的引物存在的條件下進(jìn)行pcr擴增，經(jīng)過多次循環(huán)，將pcr結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳并切膠回收預(yù)定大小的膠帶，這時得到的加上二級接頭的序列組成的文庫進(jìn)行上機測序(按專利文獻(xiàn)：潘力等.一種具有啟動子功能的dna片段與應(yīng)用.cn201510074949.0[p].2015.方法)。rna-seq文庫的測序由廣州基迪奧生物科技有限公司提供測序服務(wù)。測序時分別將兩端向中心的100bp的序列信息讀出(pe100)，稱為reads，將這些reads比對到細(xì)菌基因組上就可以進(jìn)行注釋及表達(dá)量計算等后續(xù)生物信息學(xué)分析。

實施例3

篩選并克隆啟動子片段：通過rna-seq測序數(shù)據(jù)分析巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)及全基因組分析含有轉(zhuǎn)錄起始位置的基因，通過rpkm量化，篩選一株表達(dá)量高的基因，其核苷酸序列如下所示：

ttataaggttggaggaatacccaagtccggctgaagggatcggtcttgaaaaccgacaggggtgttaaagcccgcgggggttcgaatccctcttcctccgccatactattgtctattcaaagcttcttttgagaaaaagaagctttttttatgtttaaaagaatagcgaatgggaattaggtaaatataaatcatggattaggaactttttatttgaaacagtagggtaaatttgctaatctaaacgtatatggtgctttcgcgccaaaatgcttacatattttgaaggaggaattattc。

以巨大芽孢桿菌(b.megateriumdsm319)的基因組dna為模板，引物f-psoda(5’-cggaattcttataaggttggaggaataccc-3’)和r-psoda(5’-ggactagtgaataattcctccttcaaaatatg-3’)進(jìn)行擴增300bp大小的dna片段，即psoda啟動子片段(見圖2)，與目的產(chǎn)物大小相符。引入酶切位點ecori，spei。

實施例4

構(gòu)建bgab表達(dá)質(zhì)粒：以質(zhì)粒pbe-rbs-samyq-bgab(按專利文獻(xiàn)：潘力等.一種具有啟動子功能的dna片段及其應(yīng)用.cn201610430767.7[p].2016.構(gòu)建)為表達(dá)質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶ecori和spei在酶切位點切開成線性質(zhì)粒，將實施例3中得到帶ecori，spei酶切位點的psoda啟動子片段經(jīng)過酶切、純化后插入該線性質(zhì)粒構(gòu)建得到目的啟動子的bgab基因胞外表達(dá)質(zhì)粒pbe-psoda-samyq-bgab(見圖3)。

實施例5

構(gòu)建mtg表達(dá)質(zhì)粒：以質(zhì)粒pbep43-promtg(按專利文獻(xiàn)：潘力等.一株重組的枯草芽孢桿菌及其生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法.cn201210052578.2[p].2012.構(gòu)建)為表達(dá)質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和bamhⅰ的酶切位點。以pbe-psoda-samyq-bgab質(zhì)粒為模板，引物f-psoda(5’-cggaattcttataaggttggaggaataccc-3’)、r-samyq(5’-aaggatccggctgatgtttttgtaatcg-3’)擴增5’端帶有ecorⅰ酶切位點，3’端帶有bamhⅰ酶切位點的約450bppsoda-samyq片段(見圖4)。用限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和bamhⅰ消化psoda-samyq片段，回收，純化后插入用相同內(nèi)切酶酶切位置的質(zhì)粒pbep43-promtg，構(gòu)建得到mtg表達(dá)胞外質(zhì)粒pbe-psoda-samyq-promtg(見圖5)。其中：psoda-samyq核苷酸序列為：

ttataaggttggaggaatacccaagtccggctgaagggatcggtcttgaaaaccgacaggggtgttaaagcccgcgggggttcgaatccctcttcctccgccatactattgtctattcaaagcttcttttgagaaaaagaagctttttttatgtttaaaagaatagcgaatgggaattaggtaaatataaatcatggattaggaactttttatttgaaacagtagggtaaatttgctaatctaaacgtatatggtgctttcgcgccaaaatgcttacatattttgaaggaggaattattccaattataggtaagagaggaatgtcgacatgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagcc。

實施例6

啟動子表達(dá)水平的檢測：將構(gòu)建好的目的啟動子的bgab表達(dá)質(zhì)粒pbe-psoda-samyq-bgab和mtg表達(dá)質(zhì)粒pbe-psoda-samyq-promtg以及質(zhì)粒pbep43-promtg(按專利文獻(xiàn)：潘力等.一株重組的枯草芽孢桿菌及其生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法.cn201210052578.2[p].2012.構(gòu)建)先用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(e.colijm110)，得到陽性克隆子，經(jīng)測序后提取質(zhì)粒，用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌b.subtilisatcc6051，具體方法參考非專利文獻(xiàn)記錄nataliap，zakataeva，oksanavetal.asimplemethodtointroducemarker-freegeneticmodificationintochromosomeofnaturallynontransformablebacillusamyloliquefaciensstrains[j].applmicrobiolbiotechnol.2010,85:1201-1209)，得轉(zhuǎn)化菌株b.subtilisatcc6051(pbe-psoda-samyq-bgab)、b.subtilisatcc6051(pbe-psoda-samyq-promtg)和b.subtilisatcc6051(pbep43-promtg)。

將得到的轉(zhuǎn)化子b.subtilisatcc6051(pbe-psoda-samyq-bgab)、b.subtilisatcc6051(pbe-psoda-samyq-promtg)和b.subtilisatcc6051(pbep43-promtg)培養(yǎng)于10mllb培養(yǎng)基中(卡那霉素20μg/ml)，37℃，200rpm活化12h，將活化的種子液接種于50mllb培養(yǎng)基中(卡那霉素20μg/ml，1％(w/w)玉米淀粉)接種量為1％(體積比)，37℃，200rpm總發(fā)酵48h，每隔12小時取樣。

β-葡萄糖半乳糖苷酶酶活的測定：將32μl發(fā)酵上清液與288μl0.25％onpg(o-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside，鄰硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷)混合，55℃下溫育15min，反應(yīng)終止加入320μl的10％(w/w)na2co3。反應(yīng)呈顯色反應(yīng)，在405nm波長下測定吸光值。對照菌株b.subtilisatcc6051(pbe-rbs-samyq-bgab)無顯色反應(yīng)，在405nm波長下測定吸光值與空白對照(lb)差不多，無β-葡萄糖半乳糖苷酶活性。結(jié)果表明啟動子psoda啟動β-葡萄糖半乳糖苷酶表達(dá)，36h達(dá)到最高酶活20.06u/ml。

sds-page：將36h發(fā)酵液離心取上清，上清液跑sds-page電泳，與野生型枯草芽孢桿菌b.subtilisatcc6051作為對照，蛋白膠圖顯示在44-46kda有條帶和mtg蛋白大小一致，而野生型對照在此大小范圍內(nèi)無條帶，實驗結(jié)果說明mtg蛋白酶原得到表達(dá)(見圖6)。

mtg酶活的測定：取0.2ml發(fā)酵上清液，加入50μl0.1％的胰蛋白酶，混勻后37℃水浴10min，即得到成熟的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。酶活測定采用crossowicz比色法，以n-α-cbz-gln-gly作為底物，將150μl的底物與50μl激活后的成熟酶混勻后37℃反應(yīng)10min，然后迅速加入200μl的反應(yīng)終止劑鹽酸-氯化鐵-三氯乙酸(3moll/的鹽酸、12％(v/v)三氯乙酸和5％(w/v)氯化鐵按1:1:1的比例混合。)同時以l-谷氨酸-γ-單羥肟酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用酶標(biāo)儀測量反應(yīng)液在525nm下的吸光值。酶活力單位定義為：37℃時1min催化n-α-cbz-gln-gly生成1μmoll-谷氨酸-γ-單羥肟酸所需要的酶量。野生菌株b.subtilisatcc6051無顯色反應(yīng)，吸光值與空白對照(lb)差不多，沒有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。結(jié)果表明啟動子psoda表達(dá)mtg，36h達(dá)到最高酶活101.56u/ml，相比傳統(tǒng)強啟動子p43表達(dá)mtg在36h的酶活61.59u/ml高了1.6倍。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南理工大學(xué)

<120>一種巨大芽孢桿菌具有啟動子功能的dna片段及其應(yīng)用

<130>1

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>300

<212>dna

<213>巨大芽孢桿菌（bacillusmegaterium）

<400>1

ttataaggttggaggaatacccaagtccggctgaagggatcggtcttgaaaaccgacagg60

ggtgttaaagcccgcgggggttcgaatccctcttcctccgccatactattgtctattcaa120

agcttcttttgagaaaaagaagctttttttatgtttaaaagaatagcgaatgggaattag180

gtaaatataaatcatggattaggaactttttatttgaaacagtagggtaaatttgctaat240

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<210>2

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<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>核糖體結(jié)合位點的序列

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<223>psoda-samyq

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c421

<210>7

<211>328

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>dna片段+核糖體結(jié)合序列

<400>7

ttataaggttggaggaatacccaagtccggctgaagggatcggtcttgaaaaccgacagg60

ggtgttaaagcccgcgggggttcgaatccctcttcctccgccatactattgtctattcaa120

agcttcttttgagaaaaagaagctttttttatgtttaaaagaatagcgaatgggaattag180

gtaaatataaatcatggattaggaactttttatttgaaacagtagggtaaatttgctaat240

ctaaacgtatatggtgctttcgcgccaaaatgcttacatattttgaaggaggaattattc300

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