本發(fā)明涉及一種微生物培養(yǎng)方法，尤其涉及一種高純度、耐常溫貯存屎腸球菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)工藝。
背景技術(shù)：
屎腸球菌是我國(guó)農(nóng)業(yè)部允許使用的16種可直接飼喂的飼料微生物品種之一。屎腸球菌作為乳酸菌家族成員之一，在提高幼年畜禽體增重、提高動(dòng)物免疫力、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，提高營(yíng)養(yǎng)吸收、減少腹瀉率、降低死亡率等方面均有很好的效果，加之其對(duì)部分抗生素也具備很好的耐受性。因此，在目前的微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)特別是飼料添加劑企業(yè)中，是深受眾多廠家親睞的一類乳酸菌產(chǎn)品。
目前，市場(chǎng)上常見(jiàn)的屎腸球菌是以液態(tài)發(fā)酵所得，產(chǎn)品活菌數(shù)雖高（可達(dá)200億/g以上）但由于此類產(chǎn)品售價(jià)較高、易失活、保存條件苛刻，從而極大制約其產(chǎn)品在市場(chǎng)推廣應(yīng)用。
中國(guó)專利cn105132321a公開(kāi)了一種屎腸球菌及其高密度固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基及方法，培養(yǎng)基成分(質(zhì)量百分比)：麥麩15~25%，豆粕19~29%，甘蔗糖密3~5%，，活性炭2~4%，碳酸鈣2~6%，β-環(huán)狀糊精2~6%和水35~45%。該方法為：將屎腸球菌菌種按2~4%v/v的接種量接種到培養(yǎng)基中，于30-40℃的條件下密閉發(fā)酵，再將發(fā)酵產(chǎn)物于45-60℃烘干即可。但，該方法培養(yǎng)出來(lái)的屎腸球菌含較多的雜菌較多，不易常溫貯存。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種雜菌少，易常溫貯存的高純度、耐常溫貯存屎腸球菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)工藝。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明一種高純度、耐常溫貯存屎腸球菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特征在于該工藝包括下述順序的步驟：
(1)菌株的篩選馴化：無(wú)菌操作取少量屎腸球菌凍干菌粉置于改良mrs培養(yǎng)基中，劃線，37℃培養(yǎng)24h，分別挑取3-5個(gè)典型屎腸球菌單菌落分別劃線mrs培養(yǎng)基中，連續(xù)純化傳代復(fù)壯3次，最后挑取復(fù)壯后屎腸球菌進(jìn)行生理生化鑒定，待鑒定為屎腸球菌后，選取最優(yōu)屎腸球菌單菌落，作為種子菌株，做一級(jí)種子液菌種；
(2)一級(jí)種子液培養(yǎng)：無(wú)菌操作挑取篩選馴化后屎腸球菌單菌落接種于一級(jí)種子培養(yǎng)液中，以30-40℃溫度在搖床中培養(yǎng)8-24h，培養(yǎng)結(jié)束后即得一級(jí)種子液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)二級(jí)種子液培養(yǎng)：以5%-10%v/v接種量將制備好的一級(jí)種子液接種到二級(jí)種子培養(yǎng)液中，以30-40℃溫度在無(wú)菌環(huán)境下的種子罐培養(yǎng)8-24h獲得二級(jí)種子液；
(4)固態(tài)發(fā)酵：以5%-20%v/v接種量將制備好的二級(jí)種子液均勻接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30-40℃無(wú)菌環(huán)境下發(fā)酵培養(yǎng)12-72h；
(5)烘干粉碎：發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵產(chǎn)物置于30-50℃下烘干1-5h，再粉碎至50目即為屎腸球菌固態(tài)發(fā)酵成品；
(6)屎腸球菌檢測(cè)計(jì)數(shù)：取上述粉碎產(chǎn)品用滅菌生理鹽水按梯度逐級(jí)稀釋，制成10-8的菌懸液，在滅菌平皿中注入250μl稀釋后的菌懸液，再倒入適量的已熔化并冷至45℃左右的屎腸球菌檢測(cè)用mrs培養(yǎng)基，與菌液混勻，冷卻、待凝固后，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，待長(zhǎng)出菌落后，計(jì)數(shù)。
改良mrs培養(yǎng)基配方（質(zhì)量百分比）：葡萄糖1~2%，蛋白胨0.5~1.5%，牛肉膏0.5~1.5%，酵母浸粉0.2~1%，氯化鈉0.2~0.8%，瓊脂粉1~3%，碳酸鈣0.1~3%，檸檬酸二銨0.1~1%，吐溫800.01~0.1%，硫酸鎂0.02~0.1%，硫酸錳0.01~0.05%，純化水85.95~96.36%。
一級(jí)種子培養(yǎng)液配方（質(zhì)量百分比）：蔗糖1~2%，葡萄糖1~2%，蛋白胨0.5~1.5%，碳酸鈣1~5%，酵母浸粉0.2~1%，氯化鈉0.2~0.8%，牛肉膏0.5~1.5%，硫酸鎂0~0.8%，硫酸錳0.1~0.8%，磷酸氫二鉀0.8~3.5%，純化水86~95%。
二級(jí)種子液培養(yǎng)基配方（質(zhì)量百分比）：蔗糖2~3%，葡萄糖0~1.5%，蛋白胨0.5~1.5%，碳酸鈣1~5%，酵母浸粉0.2~1%，氯化鈉0.2~0.8%，牛肉膏0.5~1.5%，硫酸鎂0~0.8%，硫酸錳0.1~0.8%，磷酸氫二鉀0.8~3.5%，純化水86~95%。
固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配制（質(zhì)量百分比）：豆粕10~40%、米糠2~10%，麩皮10~25%，碳酸鈣1~10%，酵母浸粉0.1~2%，活性炭1~5%，硫酸鎂0~1%，硫酸錳0~1%，純化水40~75.9%，ph6.0~7.5，混合均勻，滅菌溫度為110-121℃，滅菌時(shí)間1-30分鐘，滅菌完成后待培養(yǎng)基溫度降至40℃即可接種。
屎腸球菌檢測(cè)用mrs培養(yǎng)基配方（質(zhì)量百分比）：葡萄糖1~2%，蛋白胨0.5~1.5%，牛肉膏0.5~1.5%，碳酸鈣1~5%，酵母浸粉0.2~1%，氯化鈉0.2~0.8%，瓊脂粉1~3%，純化水86~95%。
典型屎腸球菌篩選馴化標(biāo)準(zhǔn)為：菌落形態(tài)為乳白色、圓形、表面光滑凸起、邊緣整齊、直徑0.5-2.0mm，菌落周圍有一圈透明溶鈣圈，溶鈣圈越大越好，菌落大小均一，遺傳性能穩(wěn)定的菌株。
屎腸球菌生理生化鑒定：觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)陰性，革蘭氏染色、葡萄糖、麥芽糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖試驗(yàn)陽(yáng)性。
搖床轉(zhuǎn)速為120-240r/min。
種子罐轉(zhuǎn)速為200-300r/min。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
1.雜菌率低，純度高：≤2%；
2.可在常溫中儲(chǔ)存，耐貯存，方便運(yùn)輸：常溫中保存1年，其活性還有85%，活性高；
3.耐高溫：在40℃下保存，衰減率低；100℃下烘干，死亡率低。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。
實(shí)施例一：
一種高純度、耐常溫貯存屎腸球菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)工藝，包括下述順序的步驟：
(1)菌株的篩選馴化：無(wú)菌操作取少量屎腸球菌凍干菌粉置于包括葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母浸粉0.2%，氯化鈉0.2%，瓊脂粉1%，碳酸鈣0.1%，檸檬酸二銨0.1%，吐溫800.01%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.01%，純化水96.36%的改良mrs培養(yǎng)基中，劃線，37℃培養(yǎng)24h，分別挑取3-5個(gè)典型屎腸球菌單菌落分別劃線mrs培養(yǎng)基中，連續(xù)純化傳代復(fù)壯3次，最后挑取復(fù)壯后屎腸球菌進(jìn)行生理生化鑒定，待鑒定為屎腸球菌后，選取最優(yōu)屎腸球菌單菌落，作為種子菌株，做一級(jí)種子液菌種；
(2)一級(jí)種子液培養(yǎng)：無(wú)菌操作挑取篩選馴化后屎腸球菌單菌落接種于包括蔗糖1%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，碳酸鈣1%，酵母浸粉0.2%，氯化鈉0.2%，牛肉膏0.5%，硫酸鎂0%，硫酸錳0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，純化水95%的一級(jí)種子培養(yǎng)液中，以30-40℃溫度在轉(zhuǎn)速為120-240r/min的搖床中培養(yǎng)8-24h，培養(yǎng)結(jié)束后即得一級(jí)種子液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)二級(jí)種子液培養(yǎng)：以5%-10%v/v接種量將制備好的一級(jí)種子液接種到包括蔗糖2%，葡萄糖0%，蛋白胨0.5%，碳酸鈣1%，酵母浸粉0.2%，氯化鈉0.2%，牛肉膏0.5%，硫酸鎂0%，硫酸錳0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，純化水95%的二級(jí)種子培養(yǎng)液中，以30-40℃溫度在無(wú)菌環(huán)境下的轉(zhuǎn)速為200-300r/min的種子罐培養(yǎng)8-24h獲得二級(jí)種子液；
(4)固態(tài)發(fā)酵：以5%-20%v/v接種量將制備好的二級(jí)種子液均勻接種到包括豆粕10%、米糠2%，麩皮10%，碳酸鈣1%，酵母浸粉0.1%，活性炭1%，硫酸鎂0%，硫酸錳0%，純化水75.9%的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30-40℃無(wú)菌環(huán)境下發(fā)酵培養(yǎng)12-72h；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基ph6.0~7.5，配制時(shí)需混合均勻，滅菌溫度為110-121℃，滅菌時(shí)間1-30分鐘，滅菌完成后待培養(yǎng)基溫度降至40℃即可接種；
(5)烘干粉碎：發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵產(chǎn)物置于30-50℃下烘干1-5h，再粉碎至50目即為屎腸球菌固態(tài)發(fā)酵成品；
(6)屎腸球菌檢測(cè)計(jì)數(shù)：取上述粉碎產(chǎn)品用滅菌生理鹽水按梯度逐級(jí)稀釋，制成10-8的菌懸液，在滅菌平皿中注入250μl稀釋后的菌懸液，再倒入適量的已熔化并冷至45℃左右的包括葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，碳酸鈣1%，酵母浸粉0.2%，氯化鈉0.2%，瓊脂粉1%，純化水95%的屎腸球菌檢測(cè)用mrs培養(yǎng)基，與菌液混勻，冷卻、待凝固后，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，待長(zhǎng)出菌落后，計(jì)數(shù)。
典型屎腸球菌篩選馴化標(biāo)準(zhǔn)為：菌落形態(tài)為乳白色、圓形、表面光滑凸起、邊緣整齊、直徑0.5-2.0mm，菌落周圍有一圈透明溶鈣圈，溶鈣圈越大越好，菌落大小均一，遺傳性能穩(wěn)定的菌株。
屎腸球菌生理生化鑒定：觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)陰性，革蘭氏染色、葡萄糖、麥芽糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖試驗(yàn)陽(yáng)性。
實(shí)施例二：
一種高純度、耐常溫貯存屎腸球菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)工藝，包括下述順序的步驟：
(1)菌株的篩選馴化：無(wú)菌操作取少量屎腸球菌凍干菌粉置于包括葡萄糖2%，蛋白胨1.5%，牛肉膏1.5%，酵母浸粉1%，氯化鈉0.8%，瓊脂粉3%，碳酸鈣3%，檸檬酸二銨1%，吐溫800.1%，硫酸鎂0.1%，硫酸錳0.05%，純化水85.95%的改良mrs培養(yǎng)基中，劃線，37℃培養(yǎng)24h，分別挑取3-5個(gè)典型屎腸球菌單菌落分別劃線mrs培養(yǎng)基中，連續(xù)純化傳代復(fù)壯3次，最后挑取復(fù)壯后屎腸球菌進(jìn)行生理生化鑒定，待鑒定為屎腸球菌后，選取最優(yōu)屎腸球菌單菌落，作為種子菌株，做一級(jí)種子液菌種；
(2)一級(jí)種子液培養(yǎng)：無(wú)菌操作挑取篩選馴化后屎腸球菌單菌落接種于包括蔗糖2%，葡萄糖2%，蛋白胨1.5%，碳酸鈣5%，酵母浸粉1%，氯化鈉0.8%，牛肉膏1.5%，硫酸鎂0.8%，硫酸錳0.8%，磷酸氫二鉀3.5%，純化水86%的一級(jí)種子培養(yǎng)液中，以30-40℃溫度在轉(zhuǎn)速為120-240r/min的搖床中培養(yǎng)8-24h，培養(yǎng)結(jié)束后即得一級(jí)種子液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)二級(jí)種子液培養(yǎng)：以5%-10%v/v接種量將制備好的一級(jí)種子液接種到包括蔗糖3%，葡萄糖1.5%，蛋白胨1.5%，碳酸鈣5%，酵母浸粉1%，氯化鈉0.8%，牛肉膏1.5%，硫酸鎂0.8%，硫酸錳0.8%，磷酸氫二鉀3.5%，純化水86%的二級(jí)種子培養(yǎng)液中，以30-40℃溫度在無(wú)菌環(huán)境下的轉(zhuǎn)速為200-300r/min的種子罐培養(yǎng)8-24h獲得二級(jí)種子液；
(4)固態(tài)發(fā)酵：以5%-20%v/v接種量將制備好的二級(jí)種子液均勻接種到包括豆粕40%、米糠10%，麩皮25%，碳酸鈣10%，酵母浸粉2%，活性炭5%，硫酸鎂1%，硫酸錳1%，純化水40%的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30-40℃無(wú)菌環(huán)境下發(fā)酵培養(yǎng)12-72h；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配制需混合均勻，滅菌溫度為110-121℃，滅菌時(shí)間1-30分鐘，滅菌完成后待培養(yǎng)基溫度降至40℃即可接種；
(5)烘干粉碎：發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵產(chǎn)物置于30-50℃下烘干1-5h，再粉碎至50目即為屎腸球菌固態(tài)發(fā)酵成品；
(6)屎腸球菌檢測(cè)計(jì)數(shù)：取上述粉碎產(chǎn)品用滅菌生理鹽水按梯度逐級(jí)稀釋，制成10-8的菌懸液，在滅菌平皿中注入250μl稀釋后的菌懸液，再倒入適量的已熔化并冷至45℃左右的包括葡萄糖2%，蛋白胨1.5%，牛肉膏1.5%，碳酸鈣5%，酵母浸粉1%，氯化鈉0.8%，瓊脂粉3%，純化水86%的屎腸球菌檢測(cè)用mrs培養(yǎng)基，與菌液混勻，冷卻、待凝固后，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，待長(zhǎng)出菌落后，計(jì)數(shù)。
實(shí)施例三
一種高純度、耐常溫貯存屎腸球菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)工藝，包括下述順序的步驟：
(1)菌株的篩選馴化：無(wú)菌操作取少量屎腸球菌凍干菌粉置于包括葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母浸粉0.6%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉2%，碳酸鈣2%，檸檬酸二銨0.5%，吐溫800.05%，硫酸鎂0.06%，硫酸錳0.025%，純化水90%的改良mrs培養(yǎng)基中，劃線，37℃培養(yǎng)24h，分別挑取3-5個(gè)典型屎腸球菌單菌落分別劃線mrs培養(yǎng)基中，連續(xù)純化傳代復(fù)壯3次，最后挑取復(fù)壯后屎腸球菌進(jìn)行生理生化鑒定，待鑒定為屎腸球菌后，選取最優(yōu)屎腸球菌單菌落，作為種子菌株，做一級(jí)種子液菌種；
(2)一級(jí)種子液培養(yǎng)：無(wú)菌操作挑取篩選馴化后屎腸球菌單菌落接種于包括蔗糖1.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，碳酸鈣3%，酵母浸粉0.6%，氯化鈉0.5%，牛肉膏1%，硫酸鎂0.4%，硫酸錳0.35%，磷酸氫二鉀2%，純化水90%的一級(jí)種子培養(yǎng)液中，以30-40℃溫度在轉(zhuǎn)速為120-240r/min的搖床中培養(yǎng)8-24h，培養(yǎng)結(jié)束后即得一級(jí)種子液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)二級(jí)種子液培養(yǎng)：以5%-10%v/v接種量將制備好的一級(jí)種子液接種到包括蔗糖2.5%，葡萄糖0.5%，蛋白胨1%，碳酸鈣3%，酵母浸粉0.6%，氯化鈉0.5%，牛肉膏1%，硫酸鎂0.4%，硫酸錳0.35%，磷酸氫二鉀2%，純化水90%的二級(jí)種子培養(yǎng)液中，以30-40℃溫度在無(wú)菌環(huán)境下的轉(zhuǎn)速為200-300r/min的種子罐培養(yǎng)8-24h獲得二級(jí)種子液；
(4)固態(tài)發(fā)酵：以5%-20%v/v接種量將制備好的二級(jí)種子液均勻接種到包括豆粕25%、米糠6%，麩皮12.5%，碳酸鈣6%，酵母浸粉1%，活性炭3%，硫酸鎂0.5%，硫酸錳0.5%，純化水55%的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30-40℃無(wú)菌環(huán)境下發(fā)酵培養(yǎng)12-72h；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配制需混合均勻，滅菌溫度為110-121℃，滅菌時(shí)間1-30分鐘，滅菌完成后待培養(yǎng)基溫度降至40℃即可接種；
(5)烘干粉碎：發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵產(chǎn)物置于30-50℃下烘干1-5h，再粉碎至50目即為屎腸球菌固態(tài)發(fā)酵成品；
(6)屎腸球菌檢測(cè)計(jì)數(shù)：取上述粉碎產(chǎn)品用滅菌生理鹽水按梯度逐級(jí)稀釋，制成10-8的菌懸液，在滅菌平皿中注入250μl稀釋后的菌懸液，再倒入適量的已熔化并冷至45℃左右的包括葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，碳酸鈣3%，酵母浸粉0.6%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉2%，純化水90%的屎腸球菌檢測(cè)用mrs培養(yǎng)基，與菌液混勻，冷卻、待凝固后，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，待長(zhǎng)出菌落后，計(jì)數(shù)。
以上實(shí)施例效果：
由于屎腸球菌在培養(yǎng)過(guò)程中分泌乳酸將培養(yǎng)基中的碳酸鈣溶解，使得菌落的周圍形成一個(gè)透明圈，因此，在計(jì)數(shù)時(shí)有透明圈的菌落即為屎腸球菌，而無(wú)透明圈的菌落為雜菌。每克粉碎產(chǎn)品活菌數(shù)計(jì)算公式：同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù)平皿菌落平均數(shù)×108×4單位：cfu/g
1.常溫下儲(chǔ)存衰減實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)選取3個(gè)不同生產(chǎn)批次的屎腸球菌產(chǎn)品，用鋁箔袋封口，放置于室內(nèi)避光常溫條件下存儲(chǔ)（說(shuō)明：該存放地為福建龍巖，夏季室內(nèi)最高溫度達(dá)35℃，冬季室內(nèi)溫度最低在5℃以上），每天早晚記錄室內(nèi)溫濕度，每隔3個(gè)月取樣做平皿活菌計(jì)數(shù)，觀察統(tǒng)計(jì)衰減情況。
表1.常溫下保存1年衰減情況統(tǒng)計(jì)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)中3個(gè)樣品都是在2-3月陸續(xù)開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明存放3個(gè)月本發(fā)明屎腸球菌產(chǎn)品衰減在0-2%之間，在存放6個(gè)月、9個(gè)月衰減最嚴(yán)重在5-12%之間（夏季高溫乳酸菌衰減加劇有關(guān)），最后三個(gè)月衰減率為2%-3%之間（冬季溫度較低乳酸菌衰減緩慢）。說(shuō)明本專利產(chǎn)品在經(jīng)過(guò)一年常溫條件下保存，衰亡損失率≤15%。
2.高溫衰減試驗(yàn)：
實(shí)驗(yàn)方法1：從市場(chǎng)上挑取不同廠家生產(chǎn)的固態(tài)、液態(tài)屎腸球菌與本發(fā)明產(chǎn)品做40℃高溫保存對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表：
表2.40℃恒溫培養(yǎng)箱中保存7天衰減情況統(tǒng)計(jì)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：從上表可以得出本發(fā)明專利產(chǎn)品屎腸球菌在40℃高溫環(huán)境下保存7天其衰減率遠(yuǎn)低于上述固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵屎腸球菌。
實(shí)驗(yàn)方法2：從市場(chǎng)上挑取不同廠家生產(chǎn)的固態(tài)、液態(tài)屎腸球菌與本發(fā)明產(chǎn)品做100℃高溫抗逆性對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表：
表3.100℃高溫抗逆性對(duì)比情況統(tǒng)計(jì)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：從上表可以得出本發(fā)明專利產(chǎn)品屎腸球菌在100℃高溫環(huán)境下抗逆性遠(yuǎn)高于上述固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵屎腸球菌。