本發(fā)明涉及基因檢測技術領域，尤其涉及itga4基因甲基化檢測試劑、試劑盒及檢測方法。

背景技術：

糞便dna實驗(fit-dna)在2016年被美國預防服務工作組(uspstf)列入了結直腸癌的篩查方法之中。該實驗的原理之一就是檢測糞便中脫落細胞特定基因的甲基化水平。選擇針對腸癌靈敏度和特異度都非常高的dna甲基化標志物是該實驗的基礎。目前研究表明檢測itga4基因甲基化在組織和糞便標本中對腸癌有很高的檢測靈敏度和特異度。

研究顯示，甲基化的itga4在糞便標本中對腺瘤的檢測靈敏度是69％(9/13)，特異度是79％(22/28)。另有一項研究顯示，在糞便標本中檢測甲基化的itga4，當特異度為100％(31/31)時，對結直腸癌和結直腸腺瘤的檢出率分別為36.7％(11/30)、16％(4/25)。這些研究結果提示該基因在糞便標本中對腸癌和腺瘤的檢測靈敏度、特異度還有很大的提升空間。

影響標志物檢測靈敏性、特異性的關鍵因素在于引物的序列，因此，進一步涉及具有高靈敏性、特異性的itga4基因甲基化的檢測引物具有十分重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供itga4基因甲基化檢測試劑盒及檢測方法。本發(fā)明提供的定量、定性試劑盒皆能夠?qū)崿F(xiàn)對itga4基因甲基化的特異、靈敏檢測。

本發(fā)明提供了：

一種itga4基因甲基化定性檢測試劑盒，其以糞便、組織或細胞為待測樣品，包括itga4基因捕獲試劑和itga4基因甲基化定性檢測試劑。

本發(fā)明實施例中，所述itga4基因捕獲試劑包括磁珠探針復合物。一些具體實施例中，所述探針的序列如seqidno:1所示。

所述itga4基因甲基化定性檢測試劑包括檢測引物，所述檢測引物的核苷酸序列如seqidno:2～3所示。

本發(fā)明還提供了一種itga4基因甲基化定量檢測試劑盒，以糞便、組織或細胞為待測樣品，包括itga4基因捕獲試劑和itga4基因甲基化定量檢測試劑。

本發(fā)明實施例中，所述itga4基因捕獲試劑包括磁珠探針復合物。一些具體實施例中，所述探針的序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明實施例中，所述itga4基因甲基化定量檢測試劑包括檢測引物和檢測探針，所述檢測引物核苷酸序列如seqidno:4～5所示；所述檢測探針的核苷酸序列如seqidno:6所示。

本發(fā)明還提供了一種itga4基因甲基化檢測試劑盒，以糞便、組織或細胞為待測樣品，包括itga4基因捕獲試劑、itga4基因甲基化定性檢測試劑、itga4基因甲基化定量檢測試劑。

所述itga4基因捕獲試劑包括磁珠探針復合物；所述磁珠探針復合物中，探針的核苷酸序列如seqidno:1所示；

所述itga4基因甲基化定性檢測試劑包括檢測引物；所述檢測引物的核苷酸序列如seqidno:2～3所示；

所述itga4基因甲基化定量檢測試劑包括檢測引物和檢測探針；所述檢測引物的核苷酸序列如seqidno:4～5所示，所述檢測探針的核苷酸序列如seqidno:6所示。

采用seqidno:1所示核苷酸序列的捕獲序列在糞便標本中捕獲出itga4基因，在240例糞便標本中(80例腸癌、77例大于等于1cm腺瘤、83例正常)，檢測itga4的甲基化水平，結果顯示，在特異性為95.2％時，甲基化的itga4對腸癌和腺瘤的敏感性分別為83.8％和41.6％。

采用述qmsp實驗的引物和探針，在105對配對腸癌組織、109例≧1cm腺瘤組織、和41例正常腸上皮組織中檢測itga4的甲基化水平，當特異性為97.6％時，結直腸癌和腺瘤的檢出率分別是96.2％和71.6％。

采用msp實驗的引物在widr、sw480、hct15、ht29、caco2和dld1共六株結直腸癌細胞株檢測itga4基因的甲基化水平，結果顯示itga4在六株腸癌細胞中均發(fā)生甲基化。

作為優(yōu)選，本發(fā)明提供試劑盒的待測樣品為糞便和/或組織；

一些具體實施例中，待測樣品為糞便。

本發(fā)明還提供了一種itga4基因甲基化定性檢測方法，以待測樣品為模板，捕獲試劑捕獲itga4基因后，經(jīng)重亞硫酸鹽修飾，以定性檢測試劑擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物判斷itga4基因是否出現(xiàn)甲基化；

所述待測樣品為糞便、組織或細胞；

所述捕獲試劑包括磁珠探針復合物；所述磁珠探針復合物中，探針的核苷酸序列如seqidno:1所示；

所述定性檢測試劑包括檢測引物；所述檢測引物的核苷酸序列如seqidno:2～3所示。

具體的，以待測樣品為模板，以seqidno:1所示核苷酸序列的itga4基因捕獲序列捕獲itga4基因后，經(jīng)重亞硫酸鹽處理修飾后，以seqidno:2～3所示核苷酸序列的itga4基因甲基化定性檢測引物擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物判斷itga4基因是否出現(xiàn)甲基化；所述待測樣品為糞便、組織或細胞。

作為優(yōu)選，待測樣品為糞便、結直腸癌、結直腸腺瘤、正常腸上皮組織或細胞株。優(yōu)選的，待測樣品為糞便。

磁珠捕獲方法是采用磁珠作為固相吸附載體并使用特定設計的試劑體系及提取流程(journalofchinamedicaluniversity應用磁珠法檢測并提取尿液游離甲基化dna；2015,(10))。

在本發(fā)明中，序列如seqidno.1所示。通過磁珠捕獲的方式，可以對糞便中的itga4基因進行提取和富集。

糞便的處理方式可選地為：將糞便在緩沖液中混勻、離心、取上清至另外一個試管中，加入帶有特定互補寡核苷酸捕獲序列的磁珠至上清液中，經(jīng)過孵育雜交后，用磁鐵將磁珠吸附于管壁一側，經(jīng)過反復洗凈后，用緩沖液將目標基因dna洗脫。該法可以俘獲到目的基因，富集的過程約為2個小時。

被俘獲的dna經(jīng)過重亞硫酸鹽處理修飾后用于后續(xù)熒光定量pcr的檢測。

擴增體系：無核酸酶水10.5μl，2×酶反應液12.5μl，前向引物和反向引物(5μm濃度)各0.5μl，待測dna1μl，共計25μl。

擴增程序：95℃5min，(95℃30s，64℃30s，72℃30s)×34cycles，72℃5min，37℃30s。

根據(jù)擴增結果，出現(xiàn)擴增條帶，則基因出現(xiàn)甲基化。

本發(fā)明還提供了一種itga4基因甲基化定量檢測方法，

以待測樣品為模板，以捕獲試劑捕獲itga4基因后，經(jīng)重亞硫酸鹽修飾后，以定量檢測試劑進行定量檢測，根據(jù)定量結果判斷itga4基因甲基化水平；

所述待測樣品為糞便、組織或細胞；

所述捕獲試劑包括磁珠探針復合物；所述磁珠探針復合物中，探針的核苷酸序列如seqidno:1所示；

所述定量檢測試劑包括檢測引物和檢測探針；所述檢測引物的核苷酸序列如seqidno:4～5所示，所述檢測探針的核苷酸序列如seqidno:6所示。

具體的，以待測樣品為模板，以seqidno:1所示核苷酸序列的itga4基因捕獲序列捕獲itga4基因后，經(jīng)重亞硫酸鹽處理修飾后，以seqidno:4～5所示核苷酸序列的itga4基因甲基化定量檢測引物和seqidno:6所示核苷酸序列的itga4基因甲基化定量檢測探針進行定量檢測，根據(jù)定量結果判斷itga4基因甲基化水平；所述待測樣品為糞便、組織或細胞。

作為優(yōu)選，待測樣品為糞便、結直腸癌、結直腸腺瘤、正常腸上皮組織或細胞株。優(yōu)選的，待測樣品為糞便。

磁珠捕獲方法是采用磁珠作為固相吸附載體并使用特定設計的試劑體系及提取流程(journalofchinamedicaluniversity應用磁珠法檢測并提取尿液游離甲基化dna；2015,(10))。

在本發(fā)明中，序列如seqidno.1所示。通過磁珠捕獲的方式，可以對糞便中的itga4基因進行提取和富集。

糞便的處理方式可選地為：將糞便在緩沖液中混勻、離心、取上清至另外一個試管中，加入帶有特定互補寡核苷酸捕獲序列的磁珠至上清液中，經(jīng)過孵育雜交后，用磁鐵將磁珠吸附于管壁一側，經(jīng)過反復洗凈后，用緩沖液將目標基因dna洗脫。該法可以俘獲到目的基因，富集的過程約為2個小時。

被俘獲的dna經(jīng)過重亞硫酸鹽處理修飾后用于后續(xù)熒光定量pcr的檢測。

所述擴增反應的體系為：無核酸酶水8.2μl，5×酶反應緩沖液5μl，mgcl2(25mm)5μl，dntps(10mm)1μl，反應酶0.5μl，前向引物(100μm)0.125μl，后向引物(100μm)0.125μl，探針(100μm)0.05μl，待測dna5μl，共計25μl。

程序為95℃4min，(95℃20s，56℃30s，72℃30s)×45cycles，37℃30s。

根據(jù)定量結果，以actb基因作為內(nèi)參基因，計算獲得itga4基因的相對甲基化水平。

本發(fā)明提供的引物和探針配合，能夠?qū)S便樣品進行檢測，從而使檢測更加簡便、快速。本發(fā)明還可以對組織標本進行檢測。而在對樣品進行檢測的過程中，檢測的特異性和敏感性也得到了提高。實驗表明，對糞便標本而言，在特異性為95.2％時，甲基化的itga4對腸癌和腺瘤的敏感性分別為83.8％和41.6％。對腸癌組織而言，當特異性為97.6％(40/41)時，結直腸癌和腺瘤的檢出率分別是96.2％(101/105)和71.6％(78/109)。該效果優(yōu)于其他引物或探針檢測的效果。

附圖說明

圖1示itga4基因在癌、腺瘤、正常組中甲基化水平的點圖，****表示p<0.0001；

圖2示roc曲線圖，其中auc(癌vs正常)＝0.953(95％ci：0.920-0.985)；auc(腺瘤vs正常)＝0.735(95％ci：0.657-0.814)；

圖3示梯度稀釋的s1-s6的擴增曲線和其構建的標準曲線，其中ntc表示無模板對照，wt表示用野生型的dna作對照，每個樣本均作了3個復孔；

圖4示標準曲線，其線性度r²＝0.995，擴增效率＝97.96％；

圖5示不同引物、探針的擴增曲線。

具體實施方式

本發(fā)明提供了itga4基因甲基化檢測試劑、試劑盒及檢測方法，本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。

本發(fā)明采用的試材、試劑、儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。

下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1定性檢測

選擇widr、sw480、hct15、ht29、caco2和dld1共6株結直腸癌細胞株，另設健康細胞ccd-18co為對照。采用msp實驗檢測itga4基因在這些細胞中是否發(fā)生了甲基化；每個細胞株重復檢測10次。

方法步驟為:

1、收集細胞沉淀，轉移到事先裝有3ml細胞裂解液的新的15ml離心管中。

向離心管中加入100ul捕獲磁珠，其含有捕獲序列seqidno:1所示序列的捕獲序列(5’-tgcttctccgggtacgggccgctgggtggggtc-3)。水浴鍋92℃孵育10min。室溫搖床100rpm孵育1h，簡短離心后置于磁力架5min，丟棄上清。

向15ml離心管中加入500ul洗滌液，振蕩搖勻，使管壁磁珠完全懸下來，簡短離心后轉移到新的2ml離心管中。室溫干浴器900rpm孵育1min，置于磁力架上1min，棄上清。重復4次。

加入55ul洗脫液，簡短離心，干浴器92℃900rpm孵育10min。簡短離心，置于磁力架上，3min以內(nèi)轉移50ul洗脫液到新的ep管中。

2、重亞硫酸鹽轉化，采用ezdnamethylationkit(zymoresearch)

3、擴增：引物為

上游引物序列：5’-tcggagaagtagcgcgagtattc-3’(seqidno:2)

下游引物序列：5’-aaatcgacccaccgcgaacg-3’(seqidno:3)

體系：25μl(1×體系：無核酸酶水10.5μl，gotaqhotstartcolorlessmastermix12.5μl，forwardprimer和reverseprimer(濃度5um)各0.5μl，待測dna1μl)

程序：95℃5min，(95℃30s，64℃30s，72℃30s)×34cycles，72℃5min，37℃30s。

4、擴增結果觀察。

根據(jù)擴增結果，對pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，有條帶出現(xiàn)即為出現(xiàn)甲基化。

實驗結果：itga4在六株腸癌細胞中均檢測到發(fā)生甲基化，10次重復檢測準確率可達100％。而健康細胞中則未檢測到甲基化現(xiàn)象。

實施例2定量檢測

1、以糞便為樣品

選擇240例糞便標本，其中經(jīng)腸鏡檢查80例為腸癌、77例為大于等于1cm腺瘤、83例為正常，定量檢測itga4基因的甲基化水平。

實驗過程：在糞便標本中采用捕獲序列(seqidno:1)捕獲出itga4基因；捕獲條件和過程同實施例1)，以actb為內(nèi)參基因，通過qmsp實驗定量檢測標本中itga4基因的甲基化水平。

定量檢測引物和探針：

上游引物序列：5’-acgcgagttttgcgtagtc-3’(seqidno:4)

下游引物序列：5’-tccgaatacgaaccgctaa-3’(seqidno:5)

檢測探針序列：5’-acggagttcggttttgcgttttc-3’(seqidno:6)

體系：25μl(1×體系：無核酸酶水8.2ul，5×colorlessgotaqflexibuffer5μl，mgcl2(25mm)5μl，dntps(10mm)1μl，gotaqhotstartpolymerase0.5μl，forwardprimer(100um)0.125μl，reverseprimer(100um)0.125μl，probe(100um)0.05μl，dna5μl)

程序：95℃4min，(95℃20s，56℃30s，72℃30s)×45cycles，37℃30s。

在240例糞便標本中(80例腸癌、77例大于等于1cm腺瘤、83例正常)，檢測itga4的甲基化水平，結果顯示，在特異性為95.2％時，甲基化的itga4對腸癌和腺瘤的敏感性分別為83.8％和41.6％(圖1～2)。

2、以組織為樣品

選擇手術或腸鏡切除的結直腸癌、結直腸腺瘤和正常腸上皮組織標本，并定量檢測itga4基因的甲基化水平。標本為：105對腸癌和癌旁配對的組織，109例≧1cm腺瘤組織，41例正常腸上皮組織。

分別提取各組織的dna并進行重亞硫酸鹽處理修飾，然后通過qmsp實驗定量檢測標本中itga4基因的甲基化水平。

根據(jù)定量結果繪制roc曲線(圖2)，實驗結果表明：當特異性為97.6％(40/41)時，結直腸癌和腺瘤的檢出率分別是96.2％(101/105)和71.6％(78/109)。曲線下面積分別為：0.958(95％ci：0.909-1)和0.832(95％ci：0.761-0.902)，(p均<0.001)。

實施例3檢測限

采用cpgenomeuniversalmethylateddna(購自millipore)經(jīng)重亞硫酸鹽轉化后得到20ng/μl的模板dna，按5倍梯度稀釋分別得到s1、s2、s3、s4、s5、s6，濃度分別為20ng/μl、4ng/μl、0.8ng/μl、0.16ng/μl、0.032ng/μl、0.0064ng/μl。

按5μl上樣模板量進行qpcr(方法、引物同實施例2)?？芍猻1-s6的實際dna投入量分別是：100ng、20ng、4ng、0.8ng、0.16ng、0.032ng。qpcr結果顯示，該基因引物探針可檢測的dna量為0.032ng～100ng(圖3)。

對比例1

采用cpgenomeuniversalmethylateddna(購自millipore)進行重亞硫酸鹽轉化；以actb為內(nèi)參基因，然后采用不同的引物和探針進行定量檢測，考察各組探針和引物的擴增效果。

采用的引物和探針如表1：

表1引物和探針

各組探針和引物的擴增結果如圖5，set1的擴增結果參考實施例3檢測限實驗結果(檢測限中s3的檢測模板與本對比例中的檢測模板相同)。由表中數(shù)據(jù)可見，針對目的基因的特異性擴增過程中，set1組的擴增結果ct最小，表現(xiàn)出最好的擴增效果，優(yōu)于其他組別的探針。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

sequencelisting

<110>廣州市康立明生物科技有限責任公司

<120>itga4基因甲基化檢測試劑、試劑盒及檢測方法

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