本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，尤其涉及抗心律失常藥物的篩選方法及平臺。

背景技術：

心律失常是心血管疾病中重要的一組疾病，指心律起源部位心搏頻率與節(jié)律以及沖動傳導等任一項異常，既包括節(jié)律又包括頻率的異常。按照心律失常沖動形成異常可分為1.竇性心律失常①竇性心動過速；②竇性心動過緩；③竇性心律不齊；④竇性停搏。2.異位心律(1)被動性異位心律：①逸博(房性、房室交界區(qū)性、室性)。②逸博心律(房性、房室交界區(qū)性、室性)。按照心律失常沖動傳到異常又可分為：1.生理性干擾及房室分離。2.病理性①竇房傳導阻滯；②房內傳導阻滯；③房室傳導阻滯；④束支或分支阻滯(左、右束支及左束支分支傳導阻滯)或室內阻滯。3.房室間傳導途徑異常預激綜合征。心律失常在心血管疾病中，無論是發(fā)病率還是致死率均位居前列。探究心律失常發(fā)病的機制以及獲取毒性和副作用更小的抗心律失常藥物是臨床醫(yī)學亟待解決的難題。

vaughanwilliams分類法是抗心律失常藥物的常用分類法，此種分類法根據藥物作用的電生理特點將藥物分為四類。

i類為阻斷心肌和心臟傳導系統(tǒng)的鈉通道，具有膜穩(wěn)定作用，降低動作電位0相除極上升速率和幅度，減慢傳導速度，延長apd和erp。對靜息膜電位無影響。根據藥物對鈉通道阻滯作用的不同，又分為三個亞類，即ia、ib、ic。其中：

(1)ia類適度阻滯鈉通道，復活時間常數1～10s，以延長erp最為顯著。

(2)ib類輕度阻滯鈉通道，復活時間常數<1s，降低自律性。

(3)ic類明顯阻滯鈉通道，復活時間常數>10s，減慢傳導性的作用最強。

ⅱ類為β受體阻滯藥，抑制交感神經興奮所致的起搏電流、鈉電流和l-型鈣電流增加，表現為減慢4相舒張期除極速率而降低自律性，降低動作電位0相上升速率而減慢傳導性。

ⅲ類為延長動作電位時程藥，抑制多種鉀電流。

ⅳ類為鈣通道阻滯藥，包括維拉帕米和地爾硫卓等。

心肌細胞又稱心肌纖維，有橫紋，受植物性神經支配，屬于有橫紋的不隨意肌，具有興奮收縮的能力。根據心肌細胞的組織學特點、電生理特性以及功能上的區(qū)別，可以粗略地分為兩大類型，兩類心肌細胞分別實現一定的職能，互相配合，完成心臟的整體活動。一類是普通的心肌細胞，包括心房肌和心室肌，含有豐富的肌原纖維，執(zhí)行收縮功能，故又稱為工作細胞。工作細胞不能自動地產生節(jié)律性興奮，即不具有自動節(jié)律性；但它具有興奮性，可以在外來刺激作用下產生興奮；也具有傳導興奮的能力。另一類是一些特殊分化了的心肌細胞，組成心臟的特殊傳導系統(tǒng)；其中主要包括p細胞和浦肯野細胞，它們除了具有興奮性和傳導性之外，還具有自動產生節(jié)律性興奮的能力，故稱為自律細胞，它們含肌原纖維甚小或完全缺乏，故收縮功能已基本喪失。

可見，心肌細胞的異常會導致心律失常，心律失常模型常采用體外培養(yǎng)心肌細胞的方式或采用構建動物疾病模型的方式。構建疾病動物模型周期長，不穩(wěn)定性高，操作困難，用于藥物篩選周期長，嚴重限制了藥物篩選的效率。而應用成熟心肌細胞的電泳作為藥物篩選的模型，隨機性高，可靠性差，沒有廣泛性。

因此，進一步構建用于篩選抗心律失常的藥物的方法，提高穩(wěn)定性、可靠性十分必要。

技術實現要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供抗心律失常藥物的篩選方法及平臺。本發(fā)明提供的篩選方法通過監(jiān)測心室肌細胞內鈣熒光染料亮度的強弱變化和細胞膜的上下位移判斷待測藥物的有效性，該方法能夠更真實的模擬心律失常，實驗結果直觀、可靠。

本發(fā)明提供的抗心律失常藥物的篩選方法為，待測藥物作用下，根據心肌細胞心律失常模型的細胞內鈣離子濃度和細胞膜的位移，判斷待測藥物是否具有抗心律失常作用。

本發(fā)明通過心室肌細胞的培養(yǎng)，使它們形成的網狀的結構，真實的在體外模擬心臟的電信號發(fā)生，傳導以及心肌細胞的興奮和收縮耦聯。并且，本發(fā)明通過檢測細胞內鈣濃度和細胞的收縮舒張，直接、客觀的反映了藥物的作用特點和作用機制。本發(fā)明提供的方法不再利用動物模型，從而使藥物篩選工作的操作更加簡單、周期更短且能126夠排除多種不確定因素，使結果更加可靠。并且，細胞內該濃度和細胞膜位移的測定使藥物作用機制更加明確、直觀。

在本發(fā)明的實施例中，細胞內鈣離子濃度的測定采用的染料為fluo-3am染料；采用的儀器為熒光顯微鏡。

在本發(fā)明的實施例中，熒光顯微鏡激光源的波長為473nm，檢測波長為528nm。

在本發(fā)明的實施例中，細胞膜的位移的測定采用掃描離子電導顯微鏡；所述掃描離子電導顯微鏡電極電壓為6v。

在本發(fā)明的實施例中，細胞內鈣離子濃度和細胞膜的位移的檢測時長為5秒～8秒。

在本發(fā)明的實施例中，心肌細胞心律失常模型為：以牛磺膽酸誘導心室肌細胞的心律失常模型。

作為優(yōu)選，心室肌細胞的為新生大鼠心室肌細胞。

在本發(fā)明的實施例中，大鼠為wistar大鼠，雄性，1～2日齡。

作為優(yōu)選，心室肌細胞的培養(yǎng)方法包括：

步驟1：破碎1～2日齡大鼠心室組織，于tyrode消化液中37℃消化30min，獲得細胞懸液；

步驟2：收集細胞，以培養(yǎng)液重懸，然后按接種密度1.8×10⁴～3.4×10⁴細胞/cm²，接種于底面預先鋪了fibronectin的培養(yǎng)皿；培養(yǎng)至細胞連接成小的網絡，并開始跳動。

作為優(yōu)選，培養(yǎng)的培養(yǎng)液包括dmem液體培養(yǎng)基、m199液體培養(yǎng)基、馬血清和小牛血清。

優(yōu)選的，dmem液體培養(yǎng)基、m199液體培養(yǎng)基、馬血清和小牛血清的體積比為68:17:10:5。

作為優(yōu)選，培養(yǎng)的條件為37℃，體積分數為5％的co2。

作為優(yōu)選，tyrode消化液包括：無鈣的tyrode溶液、cacl2、bsa、膠原酶和中性蛋白酶ii。

優(yōu)選的，tyrode消化液中，cacl2的濃度為10μmol/l；bsa的濃度為1mg/ml；膠原酶的濃度為0.6mg/ml；中性蛋白酶ii的濃度為0.03mg/ml。

在本發(fā)明的實施例中，心肌細胞心律失常模型的構建方法具體為：以?；悄懰崤c心室肌細胞共同孵育16h；?；悄懰岬臐舛葹?.3mmol/l～3mmol/l。

作為優(yōu)選，在以?；悄懰嵴T導心律失常模型前，以鈣熒光染料將心室肌細胞進行染色。

優(yōu)選的，染色方法包括：

步驟1：以dmso配制染料溶液，其中含有0.2mg/μlpluronicacid、2.5μg/μlfluo-3am；

步驟2：ebss與染料溶液以體積比為200:1混合后，與心室肌細胞混合后，37℃染色30min后，以ebss清洗2次。

本發(fā)明以熒光顯微鏡檢測細胞內鈣離子濃度，并以掃描離子電導顯微鏡(sicm)檢測細胞由于跳動導致的細胞膜的上下位移。不僅能夠能夠觀察一定時間內細胞內鈣離子濃度的變化和細胞膜位移的變化，而且能夠測定某一時刻細胞內鈣離子濃度和細胞膜位置。

具體的，掃描離子電導顯微鏡(sicm)檢測細胞膜的位移的方法為：將含有心肌細胞心律失常模型的培養(yǎng)皿，置于顯微鏡，將sicm的z向位移的壓電陶瓷在培養(yǎng)皿的支架上，給電極施加6v恒定的電壓，在微操作儀的操控下，充滿電極液玻璃探針步進接近跳動細胞的細胞膜，當電極接近細胞膜時，電流突然減小，說明電極進入了工作區(qū)，繼續(xù)移動電極接近細胞膜，直到電流比原來減小了20％。在sicm的程序控制下，側移記錄電極，直到記錄的細胞膜的上下運動幅度達到顯著。

sicm的電極為硼化玻璃電極，外徑1.5mm，內徑0.86mm，含有導絲。

在本發(fā)明的實施例中，判斷待測藥物具有抗心律失常作用的方法為vaughanwilliams分類法。

在本發(fā)明的實施例中，還根據心肌細胞心律失常模型的細胞膜的膜電位、細胞內ph值、細胞內ros值，判斷待測藥物是否具有抗心律失常作用。

細胞膜的膜電位測定采用激光共聚焦顯微鏡，通過檢測熒光強度的變化檢測膜電位的變化，膜電位變化由不規(guī)律轉向規(guī)律。

細胞內ph值的測定采用激光共聚焦顯微鏡，通過檢測熒光染料的熒光強度直接轉換成ph度數。調節(jié)細胞偏酸性的狀態(tài)，ph升高。

細胞內ros值的測定采用激光共聚焦顯微鏡，檢測熒光強度檢測ros值，糾正顯著增多的ros值，使ros值回歸到正常范圍內；

本發(fā)明還提供了一種抗心律失常藥物的篩選平臺，包括心肌細胞心律失常模型、細胞內鈣離子濃度檢測儀器和細胞膜的位移檢測儀器。

在本發(fā)明的實施例中，細胞內鈣離子濃度檢測儀器為熒光顯微鏡；所述細胞膜位移監(jiān)測儀器為掃描離子電導顯微鏡。

本發(fā)明從心肌細胞收縮以及細胞內鈣離子濃度的變化的角度揭示了效應細胞在心肌電信號的作用下的真實反應。心肌電的傳導，導致電信號經過的細胞發(fā)生細胞膜電位的變化，細胞膜上鈣離子通道打開，鈣離子內流。細胞內大量鈣離子，導致了細胞收縮耦聯，細胞發(fā)生收縮。興奮收縮耦聯是心肌電活動的最重要的表現，因此本發(fā)明提供的篩選平臺能夠更加真實細致地觀測心律傳導中的核心元素。在實驗中，還可以通過收縮以及鈣信號的變化，推斷出細胞的類型，以及他們對藥物的不同反應性。

本發(fā)明的篩選方法，操作簡單，實驗數據確切，實驗結果直觀可靠?？梢酝瑫r記錄心肌的收縮跳動和細胞內的鈣離子濃度。并且，還可以通過測定細胞膜的膜電位，細胞內的ph值，細胞內的ros等參數。因此，在篩選心律失常藥物的過程中，除了評價藥物本身對細胞電信號傳到的作用，可以檢測出待篩選的藥物是否會影響心肌的收縮，是否會通過影響h泵造成細胞內ph值的變化，是否影響細胞代謝等待選藥物本身的藥物副作用。而這些是在其他方法和平臺上，不易察覺和不能檢測的。

附圖說明

圖1-a示未經?；悄懰崽幚淼男律笫笮氖壹〖毎奶鴦宇l率；

圖1-b示經濃度為0.3mmol/l?；悄懰崽幚淼男律笫笮氖壹〖毎奶鴦宇l率；

圖1-c示經濃度為1mmol/l?；悄懰崽幚淼男律笫笮氖壹〖毎奶鴦宇l率；

圖1-d示經濃度為3mmol/l牛磺膽酸處理的新生大鼠心室肌細胞的跳動頻率；

圖2-a～圖2-c示心肌收縮與細胞內鈣離子濃度變化的關系。

具體實施方式

本發(fā)明提供了抗心律失常藥物的篩選方法及平臺，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發(fā)明技術。

本發(fā)明采用的材料、儀器皆為普通市售品，皆可通過商業(yè)途徑獲得。

下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1心肌細胞心律失常模型的構建

1、新生1～2天的大鼠(wistar)雄性，取心臟，收集心室，切成小塊。

2、小塊置于tyrode消化液中37℃搖床30min，消化液成分如下：

無鈣的tyrode溶液(40毫升)+50μmcacl2(10毫升)+1mg/mlbsa(40毫克)+collagenase(30mg)+proteaseii(1.5mg)。

3、細胞懸浮液經過percoll梯度離心，收集細胞，重懸細胞在培養(yǎng)液中(dmem：m199(4：1)，10％的馬血清，5％小牛血清)，然后按接種密度1.8×10⁴～3.4×10⁴細胞/cm²，接種于底面預先鋪了fibronectin的培養(yǎng)皿。

4、細胞生長于培養(yǎng)液，在37℃5％co2的環(huán)境下，當細胞連接成小的網絡，并開始跳動時，進行鈣熒光染料的負載：

稱量10毫克pluronicacid，加入50微升dmso，等待pluronicacid完全溶解于dmso中，取出20微升加入含有50微克的fluo-3am中，保存fluo-3am染料在黑暗中。

用ebss溶解fluo-3am染料按200：1的比例，溶液剛好覆蓋張在培養(yǎng)皿底面的細胞，放入37度培養(yǎng)箱中，30分鐘，移走fluo-3am染料，再用ebss清洗2次,放入ebss溶液，覆蓋細胞。

5、分別將含有0mmol/l，0.3mmol/l，1mmol/l，3mmol/l的taurocholate(sigma)(合適濃度的導致心律失常的藥物)的培養(yǎng)液孵育經鈣熒光染色的細胞16個小時。

實施例2心肌細胞心律失常模型細胞內鈣離子濃度、細胞膜位移的測定

1、掃描電導顯微鏡微電極的拉制

應用硼化玻璃電極，外徑1.5mm內徑0.86mm,含有導絲

應用sutterp1000拉制儀

拉制程序為：

2、將實施例1制得的由不同濃度taurocholate(?；悄懰?誘導的心律失常模型的細胞至于培養(yǎng)皿，置入顯微鏡上。

3、應用sicm的探針，實時記錄心肌細胞的跳動。這里sicm的z向位移的壓電陶瓷在培養(yǎng)皿的支架上。給電極施加一個恒定的電壓(6v)，在微操作儀的操控下，充滿電極液玻璃探針步進接近跳動細胞的細胞膜，當電極接近細胞膜時，電流會突然減小，說明電極進入了工作區(qū)。繼續(xù)移動電極接近細胞膜，直到電流比原來減小了20％。

4、在sicm的程序控制下，側移記錄電極，直到記錄的細胞膜的上下運動幅度達到顯著。

5、用473nm的激光源來作為激活fluo-3,應用photon檢測528nm的熒光強度。調節(jié)共聚焦的焦點在細胞膜下。

6、應用sicm的程序，同時記錄細胞的跳動和細胞內鈣離子的變化。其中，結果如圖1-a～圖1～d、圖2-a～圖2-c所示。

結果顯示，0.3mmol/l的taucholate不會引起心肌收縮幅度的變化，但會引起節(jié)律的變化，每4次跳動，有1次延后。而3mm的taucholate不僅引起心肌收縮幅度的大幅減小和不規(guī)則，同時引起節(jié)律的不規(guī)則，甚至心肌顫動。

實施例3藥物作用下心肌細胞心律失常模型細胞內鈣離子濃度、細胞膜位移的測定

1、將實施例1制得的經染色的細胞，由濃度為1mm的taurocholate(?；悄懰?和800nmol/l的地塞米松(常用治療心律失常藥物)共同孵育細胞模型，然后置于顯微鏡上。

2、應用sicm的探針，實時記錄心肌細胞的跳動。這里sicm的z向位移的壓電陶瓷在培養(yǎng)皿的支架上。給電極施加一個恒定的電壓(6v)，在微操作儀的操控下，充滿電極液玻璃探針步進接近跳動細胞的細胞膜，當電極接近細胞膜時，電流會突然減小，說明電極進入了工作區(qū)。繼續(xù)移動電極接近細胞膜，直到電流比原來減小了20％。

3、在sicm的程序控制下，側移記錄電極，直到記錄的細胞膜的上下運動幅度達到顯著。

4、用473nm的激光源來作為激活fluo-3,應用photon檢測528nm的熒光強度。調節(jié)共聚焦的焦點在細胞膜下。

5、應用sicm的程序，同時記錄細胞的跳動和細胞內鈣離子的變化。

結果顯示，800nm的地塞米松和1mm的taucholate共同孵育細胞，地塞米松防止了節(jié)律異常的出現(細胞位移圖與圖1-a相似)。800nm的地塞米松可以逆轉1mm的taucholate引起的心肌節(jié)律異常。說明以本發(fā)明提供的方法能夠檢測到抗心律失常藥物(地塞米松)發(fā)揮藥效，其效果與預期相符，且能夠從胞內鈣離子濃度、心肌細胞膜位移等方面更直觀的觀測到藥物對細胞的作用。說明本發(fā)明提供的方法能夠用于藥物的篩選，且具有準確性。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。