本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株具有石油降解功能的菌株cs07以及利用該菌株進(jìn)行海洋環(huán)境治理。

背景技術(shù)：

隨著全球經(jīng)濟(jì)與文化的高速發(fā)展，人類(lèi)對(duì)石油資源的需求不斷擴(kuò)大，與此同時(shí)，因石油不當(dāng)開(kāi)采和利用引發(fā)的海洋石油污染問(wèn)題已經(jīng)成為了人類(lèi)當(dāng)前所面臨的嚴(yán)重挑戰(zhàn)之一。1967年3月18日，利比亞超級(jí)油輪“卡尼丸”號(hào)在英國(guó)康沃爾海岸附近觸礁沉沒(méi)，所載11.9萬(wàn)t石油全部流入大海，油液很快浸染了康沃爾海岸，這是最早的事故造成石油污染事件。最嚴(yán)重的污染事件發(fā)生在1978年3月16日，超級(jí)油輪“卡基斯”號(hào)在比斯開(kāi)灣英吉利海峽入口處遭遇風(fēng)暴觸礁斷裂，船上22.3萬(wàn)t石油流入大海，半封閉的比斯開(kāi)灣遭受空前污染。大量石油瞬間溢出進(jìn)入海洋環(huán)境，通過(guò)擴(kuò)散、漂移等作用可對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞。在我國(guó)海洋石油污染也日益嚴(yán)重，全國(guó)每年直接排入近海的石油約10余萬(wàn)噸，僅漁業(yè)損失每年就達(dá)數(shù)億元。據(jù)全國(guó)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)網(wǎng)監(jiān)測(cè)，我國(guó)近海油類(lèi)含量超過(guò)一二類(lèi)海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的海域面積已達(dá)到5.6萬(wàn)平方公里。

海洋石油污染將造成生物多樣性急劇下降，尤其是石油中所含的多種芳烴類(lèi)有毒化合物，因其在環(huán)境中穩(wěn)定、持久而且具有生物累積效應(yīng)和放大效應(yīng)，使被污染環(huán)境的生物多樣性急劇降低，因此，石油污染對(duì)生態(tài)環(huán)境特別是生物多樣性的破壞將是致命的。目前，人們對(duì)石油污染環(huán)境處理的方式除了應(yīng)急處理的物理或化學(xué)方法外，人們更加重視能夠促使環(huán)境完全恢復(fù)的生物方法，利用土著微生物進(jìn)行海洋石油污染治理則備受人們青睞，而獲得土著的海洋石油降解微生物也一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。在國(guó)外早在20世紀(jì)40年代就出現(xiàn)了細(xì)菌降解石油污染的研究。而中國(guó)關(guān)于這方面的研究開(kāi)始于20世紀(jì)70年代，在20世紀(jì)80年代后，大量的研究成果開(kāi)始在污水及油污土壤中使用，并且取得了巨大的成功。

目前研究表明，能夠降解石油的微生物有70個(gè)屬，共200多種微生物，他們分別屬于細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母菌以及藻類(lèi)。其中，土壤中最常見(jiàn)的石油降解菌主要有：假單胞菌屬(pseudomoonus)、節(jié)核細(xì)菌屬(arthrobacter)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)、黃質(zhì)菌屬(flavobacterium)、無(wú)色菌屬(acthromobacter)、木霉屬(trichoderma)、青霉屬(penicillium)、曲霉屬(aspergillus)、森田屬(mortierella)等，在土壤中，細(xì)菌和真菌是石油生物降解的最基本作用者。在海洋中最主要的降解菌有：無(wú)色桿菌屬(achromobacter)、不動(dòng)桿菌屬(acinetobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬(alcaligenes)、金色擔(dān)子菌屬(aureobasidium)、假絲酵母菌屬(candida)等。

目前文獻(xiàn)報(bào)道較多的微生物治理環(huán)境石油污染主要集中在陸地石油污染。例如，徐德增等在勝利油田進(jìn)行油田含油污泥中烴類(lèi)物質(zhì)的生物降解技術(shù)研究時(shí)，在厭氧和好氧條件下，從油污染土壤中分離純化出4株能降解石油烴的微生物ch1、ch2、ch3和ch4，經(jīng)過(guò)鑒定ch3為假單胞菌屬，能以脂肪烴和芳香烴為唯一碳源，進(jìn)行生物降解，在油泥的初始含油量為9.84g/kg時(shí)，經(jīng)過(guò)14d的生物降解，石油污染物的生物降解速率達(dá)到了80％以上。徐金蘭等從陜北石油污染土壤中富集分離、優(yōu)選出7株菌株，鑒定結(jié)果表明sy21為不動(dòng)細(xì)菌屬、sy22為奈瑟氏球菌屬、sy23為鄰單胞菌屬、sy24為黃單胞菌屬、sy42為動(dòng)膠菌屬、sy43為黃桿菌屬、sy44為假單胞菌屬，7株菌的降油試驗(yàn)結(jié)果表明，降解8d后，加菌試樣的石油烴降解率達(dá)到80％左右；采用sy43和sy23菌株對(duì)土壤進(jìn)行生物修復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果表明，投加高效菌株sy43和sy23均可在較短的時(shí)間內(nèi)將土壤中的石油污染物去除，去除率可達(dá)88.4％和73.4％。

雖然，生物法治理石油污染環(huán)境已經(jīng)有了大量的研究，但是，目前，應(yīng)用于石油污染處理的降解菌大多數(shù)來(lái)源于土壤，而來(lái)源于海洋習(xí)居降解菌報(bào)道相對(duì)較少。相對(duì)于土壤環(huán)境而言，海洋環(huán)境具有低溫、低氧、寡營(yíng)養(yǎng)的特點(diǎn)，投放高效降解菌常需伴隨投放營(yíng)養(yǎng)源等，而外源微生物對(duì)土著微生物能否長(zhǎng)期保持競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，是否會(huì)對(duì)土著生物造成威脅，投放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是否會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成影響，不少學(xué)者對(duì)此意見(jiàn)不一。而篩選海洋習(xí)居降解菌將在很大程度上解決這些問(wèn)題，這些海洋習(xí)居菌所需要的降解條件相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠適應(yīng)海洋環(huán)境的生長(zhǎng)，也不會(huì)對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境造成威脅，因此，通過(guò)篩選海洋微生物來(lái)治理海洋石油污染已成為當(dāng)今研究的研究方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中海洋石油污染處理的問(wèn)題，發(fā)明人經(jīng)過(guò)對(duì)石油污染海域篩選獲得具有石油降解性能的微生物菌株，確定其分類(lèi)地位并對(duì)其石油降解性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，菌株cs07在降解石油的同時(shí)，還具有使石油凝聚作用，為開(kāi)發(fā)微生物修復(fù)石油污染產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株具有石油降解功能的菌株cs07，拉丁文學(xué)名為marinobactermaritimus.分類(lèi)命名：近海海桿菌，其16srrna序列如seqidno.1所示。

所述的菌株cs07采集于大連新港石油污染海域海底沉積物，富集分離所得。

所述的菌株cs07已提交保藏，具體保藏信息如下：

保藏單位名稱(chēng)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)；

保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；

保藏日期：2016年7月6日；

保藏編號(hào)：cgmccno.12739；

所述的菌株cs07的形態(tài)及理化特征為：

菌株cs07在固體lb培養(yǎng)基上在15℃條件下劃線培養(yǎng)至單菌落，觀察菌株cs07的菌落形態(tài)，菌落表面濕潤(rùn)光滑凸起，邊緣整齊，多呈圓形，不透明，淺黃色。

菌株cs07菌株呈桿狀，無(wú)鞭毛，長(zhǎng)約0.25-0.56μm，寬約0.13-0.2μm，(圖3)菌株cs07深紫色菌體周?chē)械仙v膜結(jié)構(gòu)(圖4)。

所述菌株cs07的用途為以石油降解和凝聚的方式進(jìn)行石油污染的治理。

所述菌株cs07的分離方法包括以下步驟：將菌株cs07按照1％的接種量接種至富集培養(yǎng)基中，在15-28℃條件下培養(yǎng)，菌株cs07的菌懸液濃度為10⁸cfu/ml，所述的富集培養(yǎng)基組成是：以石油作為唯一碳源添加至無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，石油添加量為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基總量的0.5％(v/v)。

所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基組成為：mgs04·7h2o0.7g，nh4no31g，kcl0.7g，kh2po42g，na2hpo43g，天然海水1000ml，ph7.5，滅菌后補(bǔ)加10ml的微量元素混合液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明首次從海底沉積物中篩選出一株同時(shí)具有石油降解和凝聚性能的菌株cs07(拉丁文學(xué)名m.maritimus)。該菌株在28℃搖床振蕩培養(yǎng)7d后，石油降解率可達(dá)到28.55％，15℃搖床振蕩培養(yǎng)7d降解率為23.54％。經(jīng)gc-ms檢測(cè)分析，菌株cs07對(duì)高碳鏈的降解能力明顯好于中低碳鏈，且ph值和nacl濃度對(duì)菌株cs07的石油降解能力影響較大，偏堿性環(huán)境不利于石油的降解，nacl濃度過(guò)高或過(guò)低也均不利于石油的降解，其中nacl濃度在3％時(shí)其降解率最高。在降解菌株篩選的過(guò)程中，觀察到菌株cs07在降解石油的同時(shí)，會(huì)使石油出現(xiàn)凝聚成顆粒狀的現(xiàn)象，同時(shí)發(fā)酵液澄清。該菌株其石油降解和凝聚性能解決了石油污染后引起的海洋污染問(wèn)題，使海洋環(huán)境完全恢復(fù)，并且為開(kāi)發(fā)微生物修復(fù)石油污染產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為菌株cs07的菌落形態(tài)照片；

圖2為菌株cs07的菌體形態(tài)照片；

圖3為菌株cs0716srrna系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；

圖4為菌株cs07對(duì)石油的凝聚照片；

圖5為菌株cs07發(fā)酵液對(duì)石油的凝聚作用照片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明不以任何形式受限于實(shí)施例內(nèi)容。實(shí)施例中所述試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；如無(wú)特殊說(shuō)明，所述試劑和生物材料，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

菌株cs07的采集及分離

樣品采集于大連新港石油污染海域海底沉積物，采集后冰盒保存，并迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行石油降解微生物的富集分離。

稱(chēng)取約10g新采集的沉積物樣品加入到含100ml富集培養(yǎng)基中的250ml三角瓶中，在15℃靜置培養(yǎng)條件下富集1周，然后以梯度稀釋分離法分離獲得石油降解菌株。

培養(yǎng)基：

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：mgs04·7h2o0.7g，nh4no31g，kcl0.7g，kh2po42g，na2hpo43g，天然海水1000ml，ph7.5，滅菌后補(bǔ)加10ml的微量元素混合液。

微量元素混合液：cacl22mg，fecl3·6h2o50mg，cuso40.5mg，mncl2·4h2o0.5mg，znso4·7h2o10mg，蒸餾水1000ml。

富集培養(yǎng)基：在上述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，添加石油作為唯一碳源，碳源的添加量為：石油按培養(yǎng)基總量的0.5％(v/v)添加。

分離培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中添加1.5％的瓊脂凝固劑。

實(shí)施例2

菌株的形態(tài)觀察及鑒定：

將菌株cs07分別在以石油為唯一碳源的富集培養(yǎng)基和lb培養(yǎng)基上在15℃條件下劃線培養(yǎng)至單菌落，觀察菌株cs07的菌落形態(tài)。同時(shí)挑取菌落至2.5％戊二醛溶液固定1-2h，然后將菌懸液滴于硅片上，自然晾至微濕半干狀態(tài)，再用ph為7.2的磷酸緩沖液沖洗硅片10min，沖洗3次后，分別用30％，50％，70％，85％，95％，100％乙醇梯度脫水，再向硅片滴加醋酸異戊酯進(jìn)行固定，放置過(guò)夜。第二天將制備好的樣品進(jìn)行鍍膜后，進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。如圖1所示，菌株cs07在固體lb培養(yǎng)基上，菌落表面濕潤(rùn)光滑凸起，邊緣整齊，多呈圓形，不透明，淺黃色。如圖2所示，菌株cs07菌株呈桿狀，無(wú)鞭毛，長(zhǎng)約0.25-0.56μm，寬約0.13-0.2μm。

根據(jù)菌株形態(tài)和培養(yǎng)特征排除重復(fù)菌株，然后將獲得的菌株進(jìn)行16srrna基因序列分析。采用微波法提取分離獲得的微生物基因組dna，以細(xì)菌通用引物f27:5'-agagtttgatcctggctcag-3'，r1492:5'-taccttgttacgactt-3'(上海生工合成)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果提交到ncbi的genebank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，并利用blast軟件和mega軟件構(gòu)建獲得的微生物菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行可培養(yǎng)微生物種群多樣性分析。如圖3所示為菌株cs0716srrna序列分析，結(jié)合其形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，鑒定菌株cs07為marinobactermaritimus。

實(shí)施例3

菌株cs07石油降解性能的測(cè)定

菌株cs07石油降解性能評(píng)價(jià)采用氣相色譜法(日本島津)測(cè)定各菌株的石油降解率。以萃取出的石油醚混合物為樣品，使用gc-ms-qp2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)菌株降解前后的石油含量變化進(jìn)行分析。色譜柱型號(hào)為hp-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)，進(jìn)樣量為1μl。菌株的對(duì)石油的降解率計(jì)算公式為：其中，η為石油降解率，n0為空白對(duì)照，n1為接種了菌株的培養(yǎng)液的萃取液中殘余的石油含量。

在富集培養(yǎng)基加入150μl石油做為唯一碳源進(jìn)行各菌株石油降解性能分析。將菌株(菌懸液濃度為10⁸cfu/ml)按照1％的接種量接種至含100ml富集培養(yǎng)基中，分別在15℃靜置和150r/min搖床振蕩和28℃搖床振蕩培養(yǎng)7d后，以30ml石油醚進(jìn)行萃取，采用gc-ms法測(cè)定萃取液中石油烴各組分的降解情況。同時(shí)分別觀察培養(yǎng)溫度(15℃和28℃)，ph值(ph5-9)，nacl濃度(0-9％)對(duì)菌株cs07降解功能的影響。gc-ms分析時(shí)，采用石油醚萃取發(fā)酵液，以萃取的石油醚混合物為樣品。以未加微生物菌株的富集培養(yǎng)基作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

gc-ms分析石油的色譜條件為：進(jìn)樣口溫度為200℃；載氣為氦氣，柱箱初始溫度為40℃，升溫程序設(shè)定為40℃保持5min，之后以10.00℃/min的速度升溫至230℃，保持17min；離子源溫度為230℃，掃描范圍為50-600amu。

在28℃搖床培養(yǎng)條件下，菌株cs07降解率最高，7d石油降解率可達(dá)到28.55％；15℃搖床培養(yǎng)條件下，菌株cs07降解率稍低，7d降解率為23.54％；在15℃靜置培養(yǎng)條件下，菌株cs07的降解率最低，7d降解率僅為5.73％(表1)，說(shuō)明菌株cs07在中溫振蕩培養(yǎng)時(shí)其降解能力明顯好于低溫靜置培養(yǎng)，氧氣在石油的降解中十分必要。但菌株cs07的石油降解率明顯不高，

在15℃搖床培養(yǎng)7d，ph＝7時(shí)，菌株cs07的降解率達(dá)到最大值(24.92％)。在nacl濃度為3％時(shí)，菌株cs07的降解率達(dá)到最大值，此時(shí)菌株cs07的在15℃搖床培養(yǎng)條件下7d的石油降解率為25.69％，之后，隨著nacl濃度的升高，菌株cs07的降解率降低，在nacl濃度為9％時(shí)，菌株cs07已不能降解石油。

實(shí)施例4

菌株cs07石油凝聚性能的測(cè)定

在降解菌株篩選的過(guò)程中，觀察到菌株cs07在降解石油的同時(shí)，會(huì)使石油出現(xiàn)凝聚成球狀物質(zhì)的現(xiàn)象，同時(shí)發(fā)酵液呈現(xiàn)澄清狀態(tài)，如圖4所示為菌株cs07對(duì)石油的凝聚現(xiàn)象照片。其中圖4-1是加入石油未接種菌株cs07的發(fā)酵液對(duì)照；圖4-2是接入菌株cs07的發(fā)酵液中石油凝聚呈顆粒狀，發(fā)酵液變清澈。由圖4可知，菌株cs07對(duì)石油具有一定的凝聚性能，因此，對(duì)其性能進(jìn)行更深入研究。

在100ml富集培養(yǎng)基加入150μl石油做為唯一碳源，然后將菌株cs07(菌懸液濃度為10⁸cfu/ml)以1％的接種量接種至含100ml富集培養(yǎng)基中，在15℃振蕩(150rpm/min)培養(yǎng)7d，觀察菌株cs07凝聚性能。

采用lb液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)菌株cs07，使菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，然后向發(fā)酵液中加入石油觀察石油的凝聚情況。同時(shí)，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心，分別收集上清液和沉淀。對(duì)上清液和沉淀的觀察如下：(1)向上清液中加入石油觀察石油的凝聚情況。(2)向沉淀中加入滅菌的asm培養(yǎng)基，搖勻后加入石油，觀察石油的凝聚情況，同時(shí)以asm培養(yǎng)基作為對(duì)照。

如圖5所示，其中，a為lb發(fā)酵原液對(duì)石油的凝聚作用；b為lb發(fā)酵液離心后的上清液對(duì)石油的凝聚作用；c為lb發(fā)酵液離心后的沉淀(即菌體)+asm培養(yǎng)基混勻后對(duì)石油的凝聚作用。石油在發(fā)酵液原液、上清液及沉淀的asm培養(yǎng)基溶液中都發(fā)生了凝聚，而對(duì)照培養(yǎng)基asm則沒(méi)有發(fā)生凝聚(圖4-1)，石油呈膜狀漂浮于asm培養(yǎng)基表面。

經(jīng)不同處理后石油凝聚現(xiàn)象也各不相同。振蕩培養(yǎng)時(shí)，石油均發(fā)生了較明顯凝聚現(xiàn)象，但低溫振蕩凝聚現(xiàn)象更為明顯，發(fā)酵液在3d后就開(kāi)始變?yōu)槌吻迦芤海兔黠@的聚集呈顆粒狀。

表1菌株cs07的降解性能及凝聚情況分析

注：+為凝聚現(xiàn)象不明顯，石油呈片塊狀；++為凝聚現(xiàn)象較明顯，石油部分呈顆粒狀；+++為凝聚現(xiàn)象很明顯，石油全部呈顆粒狀，溶液變?yōu)槌吻濉?/p>

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

通過(guò)對(duì)菌株cs07在不同培養(yǎng)條件下的降解性能評(píng)價(jià)以及凝聚情況評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)菌株cs07在28℃搖床培養(yǎng)條件下降解率最高，但在15℃搖床培養(yǎng)條件下凝聚情況最好，在15℃靜置培養(yǎng)條件下，菌株cs07對(duì)石油的降解率極低，并且凝聚情況最差。通過(guò)gc-ms分析，可知菌株cs07對(duì)石油烴中的全組分都可以降解，但在不同條件下降解的組分不同，在28℃搖床培養(yǎng)時(shí)，菌株cs07主要降解長(zhǎng)鏈烷烴，因此降解后的石油組分中短鏈烷烴甚至出現(xiàn)了增加的情況，在15℃培養(yǎng)條件下，石油中各組分都呈現(xiàn)下降的狀態(tài)，但相比而言菌株cs07在15℃搖床培養(yǎng)的條件下，對(duì)石油中各組分的降解較為均衡，在15℃靜置培養(yǎng)條件下，石油中短鏈烷烴的部分降解率較高，而長(zhǎng)鏈烷烴的部分降解率較低。