本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域，具體涉及一種針對腫瘤免疫治療的car-t細(xì)胞，尤其涉及膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1(sterolo-acyltransferase1，geneid:6646)被抑制的car-t細(xì)胞。此外，本發(fā)明還涉及該細(xì)胞的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)具有識別腫瘤相關(guān)抗原、調(diào)控機(jī)體攻擊腫瘤細(xì)胞(高度特異性的細(xì)胞溶解)的能力。1950年代，burnet和thomas提出了“免疫監(jiān)視”理論，認(rèn)為機(jī)體中經(jīng)常會出現(xiàn)的突變的腫瘤細(xì)胞可被免疫系統(tǒng)所識別而清除，為腫瘤免疫治療奠定了理論基礎(chǔ)[burnetfm.immunologicalaspectsofmalignantdisease.lancet,1967；1:1171-4]。隨后，各種腫瘤免疫療法包括細(xì)胞因子療法、單克隆抗體療法、過繼免疫療法、疫苗療法等相繼應(yīng)用于臨床。2013年一種更先進(jìn)的腫瘤免疫療法---car-t療法成功用于臨床，并表現(xiàn)了前所未有的臨床療效。car-t，全稱是chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，嵌合抗原受體t細(xì)胞免疫療法。該療法是通過轉(zhuǎn)基因的手段，將啟動(dòng)子、抗原識別區(qū)、共刺激因子、效應(yīng)區(qū)等共同組成的嵌合分子，導(dǎo)入t細(xì)胞基因組內(nèi)，從而使t細(xì)胞對靶細(xì)胞的識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、殺傷等功能融為一體，實(shí)現(xiàn)了對靶細(xì)胞的特異性殺傷[eleanorj.cheadle,etal.cartcells:drivingtheroadfromthelaboratorytotheclinic.immμnologicalreviews2014.vol.257:91–106]。car-t療法在臨床上最領(lǐng)先的有諾華的clt019，采用clt019治療復(fù)發(fā)難治急性淋巴細(xì)胞白血病患者，六個(gè)月的腫瘤無進(jìn)展生存率達(dá)到67％，其中最長的應(yīng)答時(shí)間達(dá)到兩年多?？偛课挥谥袊虾５纳虾?yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司與醫(yī)院合作，截止到2017年2月，共治療復(fù)發(fā)難治急性淋巴細(xì)胞白血病患者36例，其中完全24例，緩解比例達(dá)到66.6％。這是抗癌研究的顛覆性突破。car-t細(xì)胞療法可能是最有可能治愈癌癥的手段之一，并被《science》雜志評為2013年度十大科技突破之首。car-t目前在在治療b-all等幾種類型的血液腫瘤方面療效顯著，但是在骨髓瘤、淋巴瘤甚至實(shí)體瘤方面，目前治療效果不是很好，主要原因可能有以下幾點(diǎn)：一、以氧化應(yīng)激，營養(yǎng)缺乏，酸性ph值以及缺氧為主特征的腫瘤微環(huán)境；二、腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制性因子的存在；三、抑制性免疫細(xì)胞的抑制作用，例如調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)、髓養(yǎng)前體抑制性細(xì)胞(mdsc)、腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(tam)、未成熟的樹突狀細(xì)胞(idc)等等；四、t細(xì)胞固有的免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，增強(qiáng)car-t細(xì)胞的治療活性成為了car-t細(xì)胞免疫治療術(shù)走向下一個(gè)勝利的關(guān)鍵。通過對過繼性t細(xì)胞免疫治療(adoptivet-cellimmunotherapy)中的腫瘤浸潤性t細(xì)胞(tumorinfiltratinglymphocytes,til)的研究表明，當(dāng)t細(xì)胞在腫瘤組織中被激活后，細(xì)胞內(nèi)的合成代謝將十分旺盛，以適應(yīng)急劇增加的物質(zhì)和能量需求[kidaniy,elsaesserh,hockmb,etal.sterolregulatoryelement-bindingproteinsareessentialforthemetabolicprogrammingofeffectortcellsandadaptiveimmunity.[j].natureimmunology,2013,14(5):489-499.]。作為細(xì)胞代謝中的重要組份，多種脂質(zhì)合成代謝通路在激活的t細(xì)胞中重新編程并迅速上調(diào)[bensingersj,bradleymn,josephsb,etal.lxrsignalingcouplessterolmetabolismtoproliferationintheacquiredimmuneresponse.[j].cell,2008,134(1):97-111.]。早期的同位素富集(isotopomer-enrichment)實(shí)驗(yàn)證實(shí)激活的淋巴細(xì)胞可以導(dǎo)致其內(nèi)膽固醇和脂肪酸的快速合成。在培養(yǎng)基中添加膽固醇替代物(oxysterols)可以減弱脂質(zhì)合成代謝并使細(xì)胞停滯在g1期，說明脂質(zhì)代謝可影響細(xì)胞增殖。膽固醇是細(xì)胞脂質(zhì)代謝中的重要成分。它具有調(diào)節(jié)胞膜表面的信號傳遞、組成脂伐等相關(guān)功能區(qū)域、影響細(xì)胞膜流動(dòng)性等重要作用(如圖2所示)[wuw,shix,xuc.regulationoftcellsignallingbymembranelipids.[j].naturereviews.immunology,2016,16(11):690-701.]。在激活的t細(xì)胞中，尤其是cd8+t細(xì)胞中，脂質(zhì)代謝增強(qiáng)、膽固醇合成增多[lochnerm,berodl,sparwassert.fattyacidmetabolismintheregulationoftcellfunction.[j].trendsinimmunology,2015,36(2):81-91.]；而降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，會導(dǎo)致t細(xì)胞功能減退[kritchevskysb,kritchevskyd.serumcholesterolandcancerrisk:anepidemiologicperspective.[j].annualreviewofnutrition,1992,12:391-416.]。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞，該膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞有著超越car-t細(xì)胞的殺傷能力，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供該膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞的制備方法，該方法能夠制備出存活時(shí)間長、殺傷效果好、副作用小的用于臨床級別的治療性細(xì)胞。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供該膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞在制備腫瘤的細(xì)胞治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的增強(qiáng)car-t細(xì)胞的治療活性的方法，是通過抑制脂質(zhì)合成代謝通路中膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1(sterolo-acyltransferase1，geneid:6646)發(fā)揮功能，從而限制了膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯的速率，增加了細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量，通過一系列的臨床前實(shí)驗(yàn)表明，膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞有著超越car-t細(xì)胞的殺傷能力，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。嵌合抗原受體(car)是car的核心部件(如圖1所示)，賦予免疫細(xì)胞hla非依賴的方式識別腫瘤抗原的能力，這使得經(jīng)過car改造的免疫細(xì)胞相較于天然免疫細(xì)胞表面受體tcr能夠識別更廣泛的目標(biāo)。car的基礎(chǔ)設(shè)計(jì)中包括一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原(tμmor-associatedantigen，taa)結(jié)合區(qū)(通常來源于單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scfv段)，一個(gè)胞外鉸鏈區(qū)，一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。scfv段的設(shè)計(jì)對于car的特異性、有效性以及基因改造免疫細(xì)胞自身的安全性來是關(guān)鍵的決定因素。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：在本發(fā)明的第一方面，提供膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞，包括如下細(xì)胞：膽固醇轉(zhuǎn)酯酶soat1基因dna水平敲除的表達(dá)hcar19受體的t細(xì)胞，即hcar19-kosoat1-t細(xì)胞；膽固醇轉(zhuǎn)酯酶soat1基因mrna水平敲減的表達(dá)hcar19受體的t細(xì)胞，即hcar19-shrnasoat1-t細(xì)胞；膽固醇轉(zhuǎn)酯酶soat1基因在蛋白質(zhì)水平受到抑制劑抑制作用的表達(dá)hcar19受體的t細(xì)胞，即hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述膽固醇轉(zhuǎn)酯酶soat1基因dna水平敲除的表達(dá)hcar19受體的t細(xì)胞，采用的dna水平敲除方法通過cas9、zfn、或talen基因敲除方法來實(shí)現(xiàn)。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述采用的dna水平敲除方法通過cas9基因敲除方法來實(shí)現(xiàn)，具體為：通過對人soat1外顯子序列分析，首先，選定基因敲除的位點(diǎn)；隨后，通過targetlength、gcpercentage、pampattern、potentialoff-targetsite篩選條件，最終選出6條target序列及一條negativecontrol序列，具體序列如下：6條target序列如下：soat1-target1-f：如seqidno.4所示；soat1-target1-r：如seqidno.5所示；soat1-target2-f：如seqidno.6所示；soat1-target2-r：如seqidno.7所示；soat1-target3-f：如seqidno.8所示；soat1-target3-r：如seqidno.9所示；soat1-target4-f：如seqidno.10所示；soat1-target4-r：如seqidno.11所示；soat1-target5-f：如seqidno.12所示；soat1-target5-r：如seqidno.13所示；soat1-target6-f：如seqidno.14所示；soat1-target6-r：如seqidno.15所示；一條negativecontrol序列如下：soat1-target7-f：如seqidno.16所示；soat1-target7-r：如seqidno.17所示；上述任一所示核苷酸序列或具有與上述任一所示核苷酸序列>＝80％同源性(優(yōu)選地，>＝90％同源性；等優(yōu)選地，>＝95％同源性；最優(yōu)選地，>＝97％同源性)的核苷酸序列用于慢病毒表達(dá)載體上，或用于逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、腺病毒表達(dá)載體、腺相關(guān)病毒表達(dá)載體或其它類型的表達(dá)載體上。所述選出的target序列優(yōu)選為如下序列：soat1-target3-f：如seqidno.8所示；soat1-target3-r：如seqidno.9所示。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述膽固醇轉(zhuǎn)酯酶soat1基因mrna水平敲減的表達(dá)hcar19受體的t細(xì)胞，采用的mrna水平敲減方法，通過對人soat1mrna序列分析，首先，通過sirnapattern、gcpercentage、toraorginarow、consecutivergc、3’endntpattern篩選條件，設(shè)計(jì)出一批候選序列；其次，對候選序列進(jìn)行blast，通過thermodynamicvalue、sirnatarget、identity、alignment篩選條件，最終選出12條sirna序列及一條negativecontrol序列，具體序列如下：12條sirna序列如下：shrna1soat1-f：如seqidno.25所示；shrna1soat1-r：如seqidno.26所示；shrna2soat1-f：如seqidno.27所示；shrna2soat1-r：如seqidno.28所示；shrna3soat1-f：如seqidno.29所示；shrna3soat1-r：如seqidno.30所示；shrna4soat1-f：如seqidno.31所示；shrna4soat1-r：如seqidno.32所示；shrna5soat1-f：如seqidno.33所示；shrna5soat1-r：如seqidno.34所示；shrna6soat1-f：如seqidno.35所示；shrna6soat1-r：如seqidno.36所示；shrna7soat1-f：如seqidno.37所示；shrna7soat1-r：如seqidno.38所示；shrna8soat1-f：如seqidno.39所示；shrna8soat1-r：如seqidno.40所示；shrna9soat1-f：如seqidno.41所示；shrna9soat1-r：如seqidno.42所示；shrna10soat1-f：如seqidno.43所示；shrna10soat1-r：如seqidno.44所示；shrna11soat1-f：如seqidno.45所示；shrna11soat1-r：如seqidno.46所示；shrna12soat1-f：如seqidno.47所示；shrna12soat1-r：如seqidno.48所示；一條negativecontrol序列如下：shrna13soat1-f：如seqidno.49所示；shrna13soat1-r：如seqidno.50所示；上述任一所示核苷酸序列或具有與上述任一所示核苷酸序列>＝80％同源性(優(yōu)選地，>＝90％同源性；等優(yōu)選地，>＝95％同源性；最優(yōu)選地，>＝97％同源性)的核苷酸序列用于慢病毒表達(dá)載體上，或用于逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、腺病毒表達(dá)載體、腺相關(guān)病毒表達(dá)載體或其它類型的表達(dá)載體上。所述選出的sirna序列優(yōu)選為如下序列：shrna6soat1-f：如seqidno.35所示；shrna6soat1-r：如seqidno.36所示。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述抑制劑選自avasimibe、cyclandelate、saracatinib中的一種或幾種的組合。在本發(fā)明的第二方面，提供所述的膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞的制備方法，如圖3所示，hcar19-kosoat1-t細(xì)胞、hcar19-shrnasoat1-t細(xì)胞、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞的構(gòu)建策略，包括如下步驟：(1)從供者提供的外周血中分離peripheralbloodmononuclearcell(pbmc)；(2)使用磁珠分離t細(xì)胞，目的抗體激活t細(xì)胞；(3)采用hcar19重組慢病毒載體以及soat1敲除重組慢病毒載體共同轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入t細(xì)胞，產(chǎn)生hcar19-kosoat1-t細(xì)胞；或者采用hcar19重組慢病毒載體將hcar19-shrnasoat1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入t細(xì)胞，產(chǎn)生hcar19-shrnasoat1-t細(xì)胞；或者采用hcar19重組慢病毒載體將hcar19基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入t細(xì)胞，并用抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞；(4)hcar19-kosoat1-t、hcar19-shrnasoat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞體外培養(yǎng)；(5)hcar19-kosoat1-t、hcar19-shrnasoat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞大量擴(kuò)增；(6)hcar19-kosoat1-t、hcar19-shrnasoat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞最終收集、凍存以及功能檢測。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(3)中，所述hcar19重組慢病毒載體是重組后的復(fù)制缺陷型慢病毒載體，能將外源片段整合入宿主基因，一次性使用，無法復(fù)制和增殖，安全可靠；所述hcar19重組慢病毒載體是二代或者三代的慢病毒轉(zhuǎn)基因載體；所述hcar19重組慢病毒載體是靶向cd19抗原的hcar19慢病毒轉(zhuǎn)基因載體，hcar19重組慢病毒載體的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述hcar19重組慢病毒載體將cd19抗原識別區(qū)、car錨定區(qū)、共刺激因子區(qū)、細(xì)胞激活區(qū)共同組成的car嵌合受體表達(dá)在cik細(xì)胞和t細(xì)胞的表面，當(dāng)抗原識別區(qū)與cd19抗原結(jié)合時(shí)，信號通過嵌合受體傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌增加、抗細(xì)胞凋亡蛋白分泌增加、細(xì)胞死亡延遲、裂解靶細(xì)胞等一系列生物學(xué)效應(yīng)。本發(fā)明中的car嵌合受體結(jié)構(gòu)以及hcar19重組慢病毒載體結(jié)構(gòu)及其制備方法已經(jīng)公開在發(fā)明名稱為“一種基于復(fù)制缺陷性重組慢病毒的car-t轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用”，專利申請?zhí)枮?01610008360.5的專利申請說明書中。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(3)中，所述car嵌合受體中的共刺激因子區(qū)域選自4-1bb、icos、cd27、ox40、cd28、myd88、il1r1、cd70、tnfrsf19l、tnfrsf27、tnfrsf1od、、tnfrsf13b、tnfrsf18等腫瘤壞死因子超家族(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamily，tnfrsf)中的一種或多種的任意組合。能夠增加轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞的存活時(shí)間、殺傷效率、免疫記憶等特性。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(3)中，所述hcar19重組慢病毒載體包括cd19單鏈抗體的輕鏈vl和cd19單鏈抗體重鏈vh；所述cd19單鏈抗體的輕鏈vl的核苷酸序列如seqidno.2所示，或與seqidno.2所示的核苷酸序列有大于等于90％同源性的核苷酸序列；所述cd19單鏈抗體重鏈vh的核苷酸序列如seqidno.3所示，或與seqidno.3所示的核苷酸序列有大于等于90％同源性的核苷酸序列；所述cd19單鏈抗體的輕鏈vl和cd19單鏈抗體重鏈vh經(jīng)過人源化抗體優(yōu)化。在本發(fā)明的第三方面，提供上述膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞在制備腫瘤的細(xì)胞治療藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明是針對脂質(zhì)合成代謝通路中的膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1(sterolo-acyltransferase1，geneid:6646)，分別在dna水平、mrna水平和蛋白質(zhì)水平抑制了soat1發(fā)揮功能，從而限制了膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯的速率，增加了細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量，增強(qiáng)了car-t細(xì)胞的治療活性，通過一系列的臨床前實(shí)驗(yàn)表明，膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞有著超越car-t細(xì)胞的殺傷能力。本發(fā)明使用的soat1引導(dǎo)rna，經(jīng)過精心設(shè)計(jì)篩選，能夠引導(dǎo)cas9核酸酶對soat1的基因有較好的切割作用。本發(fā)明使用的soat1shrna，經(jīng)過精心設(shè)計(jì)篩選，對soat1的mrna有良好的抑制作用。本發(fā)明所采用的增強(qiáng)car-t細(xì)胞的治療活性的方法，能夠調(diào)節(jié)t細(xì)胞亞型比例，提高cd8+細(xì)胞在最終產(chǎn)品中的比例。本發(fā)明所采用的增強(qiáng)car-t細(xì)胞的治療活性的方法，可以提高慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)car-t細(xì)胞的效率，提供一種提升腫瘤殺傷效果的方式，節(jié)約了生產(chǎn)成本，降低了患者病情進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明所述的cd19單鏈抗體輕鏈vl、cd19單鏈抗體重鏈vh經(jīng)過人源化優(yōu)化，避免了進(jìn)入人體后產(chǎn)生hama，增加car-t細(xì)胞的存在時(shí)間。本發(fā)明提供的hcar19-kosoat1-t、hcar19-shrnasoat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞的制備方案，經(jīng)過本公司長時(shí)間的摸索和優(yōu)化，能夠制備出存活時(shí)間長、殺傷效果好、副作用小的用于臨床級別的治療性細(xì)胞。本發(fā)明通過將car元件轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入t細(xì)胞，使得t細(xì)胞表面增加了具有靶向功能的嵌合抗原受體，給t細(xì)胞增加了特異性殺傷的功能，使得car-t應(yīng)用價(jià)值大大提高。本發(fā)明中使用的共刺激因子的一種或若干種組合，能夠增加轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞的存活時(shí)間、殺傷效率、免疫記憶等特性。本發(fā)明采用的hcar19-kosoat1-t、hcar19-shrnasoat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞由gmp級別的車間生產(chǎn)后，可用于人體臨床實(shí)驗(yàn)?？梢姡景l(fā)明所述的car-t細(xì)胞將給腫瘤細(xì)胞治療提供可靠的保障。附圖說明圖1為本發(fā)明所述的car的示意圖，其中，圖1a是car的基本結(jié)構(gòu)圖，圖1b是car的代次改進(jìn)示意圖；圖2為本發(fā)明
背景技術(shù)：
所述的膽固醇在膜蛋白聚集中的作用示意圖；圖3為本發(fā)明所述的soat1功能阻斷的三種策略(基因敲除、mrna干擾和抑制劑抑制酶的催化)示意圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例1所述的hcar19-kosoat1-t細(xì)胞構(gòu)建步驟(包含基因敲除載體設(shè)計(jì)、基因敲除載體質(zhì)粒構(gòu)建和病毒包裝、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體外培養(yǎng)、hcar19-kosoat1-t細(xì)胞鑒定等階段)的流程示意圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例2所述的hcar19-shrnasoat1-t細(xì)胞構(gòu)建的步驟(包含基因敲減載體設(shè)計(jì)、基因敲減載體質(zhì)粒構(gòu)建和病毒包裝、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體外培養(yǎng)、hcar19-shrnasoat1-t細(xì)胞鑒定等階段)的流程示意圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例3所述的hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞構(gòu)建的步驟(包含分離培養(yǎng)、加藥抑制、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞鑒定等階段)的流程示意圖；圖7為本發(fā)明實(shí)施例1中soat1敲除重組慢病毒質(zhì)粒pcas9-soat1-1～pcas9-soat1-7的測序比對結(jié)果示意圖；其中，a是pcas9-soat1-1的測序比對結(jié)果；b是pcas9-soat1-2的測序比對結(jié)果；c是pcas9-soat1-3的測序比對結(jié)果；d是pcas9-soat1-4的測序比對結(jié)果；e是pcas9-soat1-5的測序比對結(jié)果；f是pcas9-soat1-6的測序比對結(jié)果；g是pcas9-soat1-7的測序比對結(jié)果；圖8為本發(fā)明實(shí)施例1中soat1敲除重組慢病毒lvcas9-soat1-1～lvcas9-soat1-7的滴度檢測結(jié)果示意圖；圖9為本發(fā)明實(shí)施例1中hcar19-ko1soat1-t～hcar19-ko7soat1的soat1敲除檢測結(jié)果示意圖；圖10為本發(fā)明實(shí)施例2中soat1重組敲減慢病毒質(zhì)粒p-hcar19-shrna1soat1～p-hcar19-shrna13soat1的測序比對結(jié)果示意圖；其中，a是p-hcar19-shrna1soat1的測序比對結(jié)果；b是p-hcar19-shrna2soat1的測序比對結(jié)果；c是p-hcar19-shrna3soat1的測序比對結(jié)果；d是p-hcar19-shrna4soat1的測序比對結(jié)果；e是p-hcar19-shrna5soat1的測序比對結(jié)果；f是p-hcar19-shrna6soat1的測序比對結(jié)果；g是p-hcar19-shrna7soat1的測序比對結(jié)果；h是p-hcar19-shrna8soat1的測序比對結(jié)果；i是p-hcar19-shrna9soat1的測序比對結(jié)果；j是p-hcar19-shrna10soat1的測序比對結(jié)果；k是p-hcar19-shrna11soat1的測序比對結(jié)果；l是p-hcar19-shrna12soat1的測序比對結(jié)果；m是p-hcar19-shrna13soat1的測序比對結(jié)果；圖11為本發(fā)明實(shí)施例2中soat1敲減重組慢病毒lv-hcar19-shrna1soat1～lv-hcar19-shrna13soat1的滴度檢測結(jié)果示意圖；圖12為本發(fā)明實(shí)施例2中hcar19-shrna1soat1-t～hcar19-shrna13soat1-t的soat1敲減檢測結(jié)果示意圖；圖13為本發(fā)明實(shí)施例4中hcar19-t、hcar19-ko3soat1-t、hcar19-shrna6soat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞的內(nèi)毒素檢測結(jié)果示意圖；圖14為本發(fā)明實(shí)施例4中hcar19-t、hcar19-ko3soat1-t、hcar19-shrna6soat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞的支原體檢測結(jié)果示意圖；其中，lane1為dl2000marker，從上到下條帶條帶從上到下依次為：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2為陽性對照；lane3為陰性對照；lane4為pbs；lane5為裂解液；lane6為hcar19-t細(xì)胞；lane7為hcar19-ko3soat1-t細(xì)胞；lane8為hcar19-shrna6soat1-t細(xì)胞；lane9為hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞；圖15為本發(fā)明實(shí)施例4中流式檢測hcar19-t(對照)、hcar19-ko3soat1-t、hcar19-shrna6soat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及免疫分型結(jié)果示意圖；其中，圖15a表示hcar19-t(對照)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖15b表示hcar19-t(對照)細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖15c表示hcar19-ko3soat1-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖15d表示hcar19-ko3soat1-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖15e表示hcar19-shrna6soat1-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖15f表示hcar19-shrna6soat1-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖15g表示hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖15h表示hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞的免疫分型結(jié)果；圖16為本發(fā)明實(shí)施例4中soat表達(dá)水平對t細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和cd8+/cd4+比例的影響示意圖；圖17為本發(fā)明實(shí)施例5中不同效靶比條件下，hcar19-t(對照)、hcar19-ko3soat1-t、hcar19-shrna6soat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷效率折線圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述此發(fā)明。應(yīng)理解的是，在此描述的特定實(shí)施方式通過舉例的方式來表示，并不作為對本發(fā)明的限制。在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實(shí)施方式。材料1、lv-hcar19重組慢病毒載體、p-hcar19重組慢病毒載體質(zhì)粒(seqidno.1)、plenti-cas9-monoko慢病毒轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白質(zhì)粒penv-g、hek293t/17細(xì)胞、同源重組酶、oligoannealingbuffer、支原體檢測試劑盒、內(nèi)毒素檢測試劑盒、cd19+k562細(xì)胞購自世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司；hcar19重組慢病毒載體的具體制備方法已經(jīng)公開在發(fā)明名稱為“一種基于復(fù)制缺陷性重組慢病毒的car-t轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用”，專利申請?zhí)枮?01610008360.5的專利申請說明書中；2、人新鮮外周血由健康供者提供；3、cd19單鏈抗體的輕鏈vl(如seqidno.2所示)、cd19單鏈抗體重鏈vh(如seqidno.3所示)的dna序列由上海生物公司合成，并以寡核苷酸干粉或者質(zhì)粒形式保存；4、工具酶bsmbi、sali、t4dna連接酶均購自neb公司；5、0.22μm-0.8μmpes濾器購自millipore公司；6、d-pbs(-)、0.4％臺盼藍(lán)、篩網(wǎng)、各類型細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)袋、培養(yǎng)板均購自corning公司；7、opti-mem、pen-srep、hepes、fbs、aim-v、rpmi1640、dmem、lipofectamine3000購自invitrogen公司；8、biotinylatedproteinl購自genescript公司；9、ldh檢測試劑盒購自promega公司；10、ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自ge公司；11、20％人血白蛋白注射液購自杰特貝林公司；12、cryopremium凍存液、分選緩沖液來自上海優(yōu)卡迪公司；13、ril-2、ril-1a、rifn-γ，ril-7，，ril-15，ril-21購自peprotech公司；14、cd3單克隆抗體，cd28單克隆抗體，cd3/cd28磁珠cd4/cd8磁珠購自德國miltenyi公司；15、冷凍離心機(jī)(美國thermoscientific公司；16、facs流式細(xì)胞儀購自thermo公司；17、熒光倒置顯微鏡購自olympus公司；18、cd4-fitc、cd8-apc購自biolegend公司；19、0.9％生理鹽水購自今邁公司；20、proteinlmagneticbeads購自biovision公司；21、primestar、retronectin購自takara公司；22、phycoerythrin(pe)-conjugatedstreptavidin購自bdbioscience公司；23、質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自mn公司；24、感受態(tài)細(xì)胞top10購自tiangen公司；25、nacl、kcl、na2hpo4.12h2o、kh2po4、trypsin、edta、cacl2、naoh、peg6000均購自上海生工；26、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、dab工作液均購自北京中杉金橋；27、ecl+plustmwesternblottingsystem購自amersham公司；28、dneasy試劑盒購自上海捷瑞公司；29、sa-hrp購自上海翊圣公司；30、引物：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)擴(kuò)增dna片段和靶位點(diǎn)所需的引物，該引物由上海生物公司合成，具體為：soat1-target1-f：5’-accggaagtcagcatcattagataag-3’(seqidno.4)soat1-target1-r：5’-aaaacttatctaatgatgctgacttc-3’(seqidno.5)soat1-target2-f：5’-accggtcagcatcattagataatggg-3’(seqidno.6)soat1-target2-r：5’-aaaacccattatctaatgatgctgac-3’(seqidno.7)soat1-target3-f：5’-accggcagcatcattagataatggtg-3’(seqidno.8)soat1-target3-r：5’-aaaacaccattatctaatgatgctgc-3’(seqidno.9)soat1-target4-f：5’-accggacaaccttttctgttcttgag-3’(seqidno.10)soat1-target4-r：5’-aaaactcaagaacagaaaaggttgtc-3’(seqidno.11)soat1-target5-f：5’-accggctctccttcaagaacagaaag-3’(seqidno.12)soat1-target5-r：5’-aaaactttctgttcttgaaggagagc-3’(seqidno.13)soat1-target6-f：5’-accggtgctgacttttcaatgagatg-3’(seqidno.14)soat1-target6-r：5’-aaaacatctcattgaaaagtcagcac-3’(seqidno.15)negativecontrol：soat1-target7-f：5’-accggttctccgaacgtgtcacgtg-3’(seqidno.16)negativecontrol：soat1-target7-r：5’-aaaacacgtgacacgttcggagaac-3’(seqidno.17)wpre-qpcr-f：5’-cctttccgggactttcgcttt-3’(seqidno.18)wpre-qpcr-r：5’-gcagaatccaggtggcaaca-3’(seqidno.19)actin-qpcr-f：5’-catgtacgttgctatccaggc-3’(seqidno.20)actin-qpcr-r：5’-ctccttaatgtcacgcacgat-3’(seqidno.21)soat1-qpcr-f：5’-agttggcagtcactttgatgat-3’(seqidno.22)soat1-qpcr-r：5’-ttgtgagagcgcacccacca-3’(seqidno.23)dna模板：ccccttcaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaactccgg(seqidno.24)shrna1soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.25)shrna1soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaagccgatttggaatgttctgatctcgagatcagaacattccaaatcggcccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.26)shrna2soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.27)shrna2soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaagtaatggtcgaattgacataactcgagttatgtcaattcgaccattacccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.28)shrna3soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.29)shrna3soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaattcccggttcatcattatattctcgagcgaatataatgatgaaccgggccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.30)shrna4soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.31)shrna4soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaatggtccatgactggctatattctcgaggtaatatagccagtcatggacccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.32)shrna5soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.33)shrna5soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaagtgcctcgggtactaaattcactcgaggctgaatttagtacccgaggcccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.34)shrna6soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.35)shrna6soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaattggtgacaggatgttctatactcgagcttatagaacatcctgtcaccccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.36)shrna7soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.37)shrna7soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaacagcacacttgtagtagattactcgagtgtaatctactacaagtgtgcccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.38)shrna8soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.39)shrna8soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaaatctgctgtagtacacgaatactcgagcatattcgtgtactacagcagccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.40)shrna9soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.41)shrna9soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaaaaccagtatttgtacttcttactcgagaataagaagtacaaatactggccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.42)shrna10soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.43)shrna10soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaaaatacctacagtcaaccagtactcgagaatactggttgactgtaggtaccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.44)shrna11soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.45)shrna11soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaaaacaaccatagagcgaaggatctcgagaaatccttcgctctatggttgccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.46)shrna12soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.47)shrna12soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaaacctacagtcaaccagtatttctcgagacaaatactggttgactgtagccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.48)negativecontrol：shrna13soat1-f：5’-cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt-3’(seqidno.49)negativecontrol：shrna13soat1-r：5’-gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaattctccgaacgtgtcacgtctcgagacgtgacacgttcggagaaccggagtttcgtcctttcca-3’(seqidno.50)實(shí)施例1hcar19-kosoat1-t細(xì)胞構(gòu)建。參見圖4，本發(fā)明所述hcar19-kosoat1-t細(xì)胞的構(gòu)建方法如下：一、soat1敲除重組慢病毒載體lvcas9-soat1-1～lvcas9-soat1-7的構(gòu)建、純化、檢測方法。1、將合成好的soat1-target1～soat1-target7片段分別連接到plenti-cas9-monoko質(zhì)粒中，得到soat1敲除重組慢病毒質(zhì)粒pcas9-soat1-1～pcas9-soat1-7。(1)將重組慢病毒質(zhì)粒plenti-cas9-monoko使用bsmbi限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)11127bp的片段v1，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；表1瓊脂糖凝膠回收步驟(2)將合成好的soat1-target1-f/r～soat1-target7-f/r分別用oligoannealingbuffer(退火緩沖液)溶解成20μm，對應(yīng)的f和r各取30μl混合。然后將soat1-target1-f&r～soat1-target7-f&r混合物在水浴鍋中95℃加熱5分鐘，然后水浴鍋開蓋置室溫中自然冷卻至室溫，形成雙鏈寡核苷酸片段。取1μl用于的連接反應(yīng)(見表2)，4℃連接16h，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反應(yīng)液加入50μltop10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42℃的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，每管加900μllb培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育1小時(shí)使細(xì)菌復(fù)蘇，取100μl的轉(zhuǎn)化菌液涂布于amplb瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，16小時(shí)。挑取克隆進(jìn)行菌落pcr鑒定，鑒定正確的克隆即為soat1敲除重組慢病毒質(zhì)粒pcas9-soat1-1～pcas9-soat1-7，其中pcas9-soat1-7為對照，對正確的克隆進(jìn)行測序鑒定(見圖7)，全部正確。試劑體積(μl)h2o13v2310×t4dnaligasebuffer2t4dnaligase1退火的雙鏈寡核苷酸1表220μl連接反應(yīng)體系2、重組慢病毒載體lvcas9-soat1-1～lvcas9-soat1-7的包裝；(1)完全培養(yǎng)基：取出預(yù)熱好的新鮮培養(yǎng)基，加入10％fbs+5mlpen-srep，上下顛倒混勻即可；(2)1xpbs溶液：稱量nacl8g，kcl0.2，na2hpo4.12h2o3.58g，kh2po40.24g置于1000ml燒杯中，加入900mlmilli-qgrade超純水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高溫濕熱滅菌20min；(3)0.25％trypsin溶液:稱量trypsin2.5g，edta0.19729g置于1000ml燒杯中，加入900ml1xpbs溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μm過濾除菌，長期使用可保存至-20℃冰箱；(4)0.5mcacl2溶液：稱量36.75gcacl2用400mlmilli-qgrade超純水溶解；用milli-qgrade超純水將總體積定容至500ml，混勻；0.22μm過濾除菌，分裝保存到50ml離心管中，每管45ml左右，4℃保存；(5)2xhbs溶液：稱量4.09gnacl，0.269gna2hpo4，5.96ghepes，用400mlmilli-qgrade超純水溶解；校準(zhǔn)ph儀后，用2mnaoh溶液將hbs溶液的ph調(diào)到7.05。調(diào)整每瓶hbs的ph消耗2mnaoh為3ml左右；(6)從液氮罐中取出凍存的hek293t/17細(xì)胞，迅速轉(zhuǎn)移到37℃水浴中，1～2min后轉(zhuǎn)移到超凈臺中，無菌操作將凍存管中的液體全部轉(zhuǎn)移至10cm2培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足含10％fbs的dmem至8ml/10cm2dish，24h后顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞匯合的程度大于80％進(jìn)行傳代；(7)選擇細(xì)胞狀態(tài)良好、無污染的hek293t/17細(xì)胞，每2-6個(gè)培養(yǎng)皿為一組，將細(xì)胞胰酶消化后，用電動(dòng)移液器吸取4-12ml完全培養(yǎng)基，向每個(gè)消化后的培養(yǎng)皿中加2ml，避免培養(yǎng)皿變干；使用1ml移液器將所有細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中；(8)將上述2-6個(gè)培養(yǎng)皿中的剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中，并用培養(yǎng)基再沖洗一便培養(yǎng)皿；(9)蓋緊培養(yǎng)基瓶蓋，上下顛倒10次左右充分混勻細(xì)胞懸液，將細(xì)胞傳到8-24個(gè)10cm2培養(yǎng)皿中，每皿的細(xì)胞密度應(yīng)當(dāng)約4×106個(gè)/10ml完全培養(yǎng)基左右。如果細(xì)胞密度和預(yù)期的相差較大，則需要對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后按照4×106個(gè)/皿的量接種；(10)每6個(gè)培養(yǎng)皿整理為一摞，注意保持上下皿之間的配合。將培養(yǎng)皿左右，前后晃動(dòng)數(shù)次，使細(xì)胞充分鋪開，然后放入5％co2培養(yǎng)箱。剩余細(xì)胞做同樣處理；(11)檢查所傳代細(xì)胞，細(xì)胞匯合度應(yīng)當(dāng)為70-80％，輪廓飽滿，貼壁良好，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中均勻分布；(12)為細(xì)胞換液，將培養(yǎng)基替換為新鮮完全培養(yǎng)基,每皿9ml，并將培養(yǎng)箱的co2濃度設(shè)定值提高到8％；(13)按照n+0.5配dna/cacl2溶液。每皿hek293t/17細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量按照下列比例使用：重組慢病毒質(zhì)粒(20μg),ppac-gp(15μg)，ppac-r(10μg),penv-g(7.5μg)。取一個(gè)新的5ml離心管，加入0.5mcacl2：0.25ml，重組慢病毒質(zhì)粒20μg：ppac-gp15μg：ppac-r10μg：penv-g7.5μg，補(bǔ)充超純水至0.5ml蓋上蓋子，充分混勻；(14)另取一支5ml離心管，加入0.5mldna/cacl2溶液。打開渦旋振蕩器，一只手拿住5ml離心管的上端，使管底接觸振蕩頭，使液體在管壁上散開流動(dòng)，另一只手拿一把1ml移液槍，吸取0.5ml2×hbs溶液，緩慢滴加進(jìn)入離心管，控制流速，以半分鐘滴完為宜。2×hbs加入后，繼續(xù)振蕩5秒鐘，停止振蕩，可直接加入需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中；(15)取一皿細(xì)胞，將離心管中的1ml鈣轉(zhuǎn)液滴加進(jìn)去，盡可能使鈣轉(zhuǎn)試劑分布到整個(gè)培養(yǎng)皿中；(16)鈣轉(zhuǎn)液加入后，在皿蓋上做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放還到另一個(gè)5％co2培養(yǎng)箱中。確保培養(yǎng)皿水平放置，每摞培養(yǎng)皿不要超過6個(gè)。在5％co2培養(yǎng)箱中放置(6–8h)；(17)將第一個(gè)培養(yǎng)箱的co2濃度設(shè)定值調(diào)回到5％；(18)24小時(shí)后，檢查細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞匯合度應(yīng)當(dāng)為80–85％左右，狀態(tài)良好。將培養(yǎng)基吸走，更換10ml新鮮的dmem完全培養(yǎng)基；(19)48小時(shí)后，觀察轉(zhuǎn)染效率。絕大多數(shù)細(xì)胞仍然是貼壁的?？梢钥吹匠^95％細(xì)胞都會帶有綠色熒光。將同一個(gè)病毒包裝上清液收集到一起，并向培養(yǎng)皿中繼續(xù)添加10ml新鮮培養(yǎng)基；(20)72小時(shí)后，再次將同一個(gè)病毒上清液收集到一起，兩次收集的病毒可以放在一起，丟棄培養(yǎng)皿；此時(shí)收集的上清里包含了重組慢病毒載體lvcas9-soat1-1～lvcas9-soat1-7。3、離子交換色譜法純化重組慢病毒載體；(1)將收集的上清液使用thermo真空泵，經(jīng)0.22μm-0.8μm的pes濾器抽濾，除去雜質(zhì)；(2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5mnacl250mmtris-hcl(ph6-8)；(3)將2個(gè)離子交換柱串聯(lián)放置，用4ml1mnaoh、4ml1mnacl、5ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液依次過柱；(4)將步驟(2)中獲得的溶液通過蠕動(dòng)泵以1-10ml/min的速度給離子交換柱上樣；(5)全部上清液過柱后，使用10ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液清洗一遍；(6)根據(jù)上樣量使用1-5ml1.5mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(7)將洗脫液分成25到50μl一管，凍存到-80℃冰箱，進(jìn)行長期保存；4、重組慢病毒載體滴度測定；(1)取24孔板接種293t細(xì)胞。每孔細(xì)胞為5×104個(gè)，所加培養(yǎng)基體積為500ul,不同種類的細(xì)胞生長速度有所差異，進(jìn)行病毒感染時(shí)的細(xì)胞融合率為40％-60％；(2)準(zhǔn)備3個(gè)無菌ep管，在每個(gè)管中加入90ul的新鮮完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)接種細(xì)胞24小時(shí)后，取兩個(gè)孔的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定感染時(shí)細(xì)胞的實(shí)際數(shù)目，記為n；(3)取待測定的病毒原液10ul加入到第一個(gè)管中，輕輕混勻后，取10ul加入到第二個(gè)管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs),終體積為500ul；(4)感染開始后20小時(shí)，除去培養(yǎng)上清，更換為500μl完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)，5％co2繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；(5)72小時(shí)后，觀察熒光表達(dá)情況，正常情況下，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應(yīng)減少,并拍照；(6)用0.2ml0.25％胰酶-edta溶液消化細(xì)胞，在37℃放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗整個(gè)細(xì)胞面，離心收集細(xì)胞。按照dneasy試劑盒的說明抽提基因組dna。每個(gè)樣品管中加入200μl洗脫液洗下dna并定量；(7)準(zhǔn)備目的dna檢測qpcrmix總管ⅰ(qpcr引物序列為seqidno.18---seqidno.19)：n＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlh2o混和。震蕩后放在冰上；(8)準(zhǔn)備內(nèi)參dna檢測qpcrmix管ⅱ(qpcr引物序列為seqidno.20---seqidno.21)：2×taqmanmastermix25μl×n10×rnasepprimer/probemix2.5μl×nh2o17.5μl×nn＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，100μl10×rnasepprimer/probemix和700μlh2o混和。震蕩后放在冰上；(9)在預(yù)冷的96孔pcr板上完成pcr體系建立。從總管ⅰ中各取45μl加入到a-d各行的孔中，從總管ⅱ中各取45μl加入到e-g各行的孔中。(10)分別取5μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組dna加入到a-d行中，每個(gè)樣品重復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5μl的水做為無模板對照(no-templatecontrol)。(11)分別取5μl基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組dna加入到e-g行中，每個(gè)樣品重復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5μl的水做為無模板對照(no-templatecontrol)。(12)所使用定量pcr儀為abiprism7500定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50℃2分鐘，95℃10分鐘，然后是95℃15秒，60℃1分鐘的40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測得的dna樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度(integrationunitsperml，iuml-1)的計(jì)算公式如下：iuml-1＝(c×n×d×1000)/v其中：c＝平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)n＝感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目(約為1×105)d＝病毒載體的稀釋倍數(shù)v＝加入的稀釋病毒的體積數(shù)(13)soat1敲除重組慢病毒載體lvcas9-soat1-1～lvcas9-soat1-7的滴度結(jié)果(如圖8所示)。二、hcar19-kosoat1-t細(xì)胞的構(gòu)建。1、分離pbmc。(1)抽取健康供者新鮮外周血50ml；(2)將采血袋噴拭酒精兩遍，并擦干。(3)用50ml注射器將袋中的血細(xì)胞吸出來移至新50ml管中。(4)400g，20℃離心10min。(5)將上層血漿移到新的50ml離心管中，56℃，30min滅活血漿，恢復(fù)至室溫，2000g，離心30min，取上清到50ml離心管中待用。(6)用d-pbs(-)補(bǔ)至50ml，擰緊蓋子，顛倒混勻。(7)取2個(gè)新50ml離心管，每管加入15mlficoll淋巴細(xì)胞分離液。(8)向每管ficoll上小心加入血細(xì)胞稀釋液25ml。800g，20℃離心20min。(9)離心管中液體分為四層，從上至下分別為：黃色的血漿層(回收待用)、白膜層、無色透明的ficoll層、紅黑色的混合細(xì)胞層。(10)小心吸取白膜層到新50ml離心管中，補(bǔ)加d-pbs(-)至50ml，顛倒混勻后500g，20℃離心10min。(11)加入25ml5％人血白蛋白并重懸細(xì)胞，400g，20℃離心10min。(12)棄上清，加入25ml5％人血白蛋白重懸細(xì)胞沉淀，并過70um篩網(wǎng)，計(jì)數(shù)。(13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余細(xì)胞懸液400g，20℃離心10min，加cryopremium并凍存。2、cd4/cd8陽性t細(xì)胞分選。(1)將獲得的pbmc計(jì)數(shù)，以80ul/107cells的比例加入分選緩沖液，重懸細(xì)胞沉淀。(2)再以20ul/107cells的比例加入cd4/cd8磁珠，吹打混勻后放入4℃中孵育15min。(3)取出磁珠-細(xì)胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分選緩沖液，顛倒混勻后，250g，4℃離心10min。(4)以500ul/108cells的比例加入分選緩沖液，重懸細(xì)胞沉淀。(5)用鑷子夾取ls分離柱到磁力架上。(6)同時(shí)準(zhǔn)備2個(gè)15ml離心管，分別標(biāo)記：cd4-/cd8-細(xì)胞液(a管)、cd4+/cd8+細(xì)胞液(b管)。(7)用3ml分離緩沖液潤洗ls,并用a管接緩沖液。(8)加入細(xì)胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml緩沖液沖洗柱子(每次無液體殘留時(shí)再加入新的液體)，總共三次，收集得到cd4/cd8-細(xì)胞。(9)ls分離柱與磁力架分離，用b管接細(xì)胞懸液，加入5ml緩沖液，將并用柱子內(nèi)塞稍用力沖洗，收集為cd4+/cd8+細(xì)胞，取樣計(jì)數(shù)。(10)按1x106/ml-4x106/ml的細(xì)胞密度用aim-v培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并加入2×105～1×106u/lifn-γ因子。3、t細(xì)胞激活。(1)提前一天將1×103ug/l～1×104ug/lcd3單克隆抗體和1×103ug/l～1×104ug/lcd28單克隆抗體加入24孔板，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)取出包被的t75瓶，倒掉包被液，用d-pbs(-)洗滌一次，并將分選得到的細(xì)胞懸液接種到t75瓶中，搖勻，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、soat1敲除重組慢病毒載體lvcas9-soat1-1～lvcas9-soat1-7分別與lv-hcar19重組慢病毒載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)及hcar19-kosoat1-t細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)。(1)提前一天包被1×103ug/l～1×104ug/lretronectin于24孔板內(nèi)，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)往24孔板中，根據(jù)每孔5×105細(xì)胞量，按moi＝5～20的量，分別加入2種慢病毒載體混合，同時(shí)添加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)。5、hcar19-kosoat1-t細(xì)胞體外擴(kuò)增及soat1表達(dá)檢測。(1)每2天等量補(bǔ)加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基，使ph值維持在6.5～7.5之間，細(xì)胞密度維持在5×105～2×106/ml之間，37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。(2)第7天左右，用proteinlmagneticbeads分離約1×106個(gè)hcar19陽性細(xì)胞用于soat1基因表達(dá)檢測。qpcr引物序列為seqidno.22---seqidno.23，結(jié)果如圖9顯示，其中hcar19-ko3soat1-t細(xì)胞敲除效果最好，達(dá)到90％以上的效果。凍存培養(yǎng)的hcar19-ko3soat1-t細(xì)胞用于后續(xù)檢測。實(shí)施例2hcar19-shrnasoat1-t細(xì)胞構(gòu)建。參見圖5，本發(fā)明所述hcar19-shrnasoat1-t細(xì)胞的構(gòu)建方法如下：一、重組敲減慢病毒載體lv-hcar19-shrna1soat1～lv-hcar19-shrna13soat1的構(gòu)建、純化、檢測方法。1、將合成好的shrna1soat1～shrna13soat1片段分別與hu6片段共同連接到p-hcar19重組慢病毒載體質(zhì)粒中，得到soat1重組敲減慢病毒質(zhì)粒p-hcar19-shrna1soat1～p-hcar19-shrna13soat1。(1)將p-hcar19重組慢病毒載體質(zhì)粒使用sali限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切，產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)8519bp的片段v2，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見實(shí)施例1中的表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(2)分別用引物對shrna1soat1f/r～shrna13soat1f/r以合成的seqidno.24為模板，使用實(shí)施例1的表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，58℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)約365bp的片段a1～a13，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見實(shí)施例1中的表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(3)將dna片段v1+a1～v1+a13以5μl總體積且摩爾比1:1的比例加入eppendorf管內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μl，混勻后在42℃孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反應(yīng)液加入50μltop10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42℃的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3分鐘，每管加900μllb培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育1小時(shí)使細(xì)菌復(fù)蘇，取100μl的轉(zhuǎn)化菌液涂布于amplb瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，16小時(shí)。挑取克隆進(jìn)行菌落pcr鑒定，鑒定正確的克隆即為重組敲減慢病毒質(zhì)粒p-hcar19-shrna1soat1～p-hcar19-shrna13soat1，其中p-hcar19-shrna13soat1為對照，將鑒定正確的克隆進(jìn)行測序，結(jié)果如圖10所示，全部正確；2、重組慢病毒載體lv-hcar19-shrna1soat1～lv-hcar19-shrna13soat1的包裝，具體步驟參見實(shí)施例1；3、離子交換色譜法純化重組慢病毒載體，具體步驟參見實(shí)施例1；4、重組慢病毒載體滴度測定，具體步驟參見實(shí)施例1；(1)重組慢病毒載體lv-hcar19-shrna1soat1～lv-hcar19-shrna13soat1的滴度結(jié)果(如圖11所示)。二、hcar19-shrnasoat1-t細(xì)胞的構(gòu)建。1、分離pbmc。(1)抽取健康供者新鮮外周血50ml；(2)將采血袋噴拭酒精兩遍，并擦干。(3)用50ml注射器將袋中的血細(xì)胞吸出來移至新50ml管中。(4)400g，20℃離心10min。(5)將上層血漿移到新的50ml離心管中，56℃，30min滅活血漿，恢復(fù)至室溫，2000g，離心30min，取上清到50ml離心管中待用。(6)用d-pbs(-)補(bǔ)至50ml，擰緊蓋子，顛倒混勻。(7)取2個(gè)新50ml離心管，每管加入15mlficoll淋巴細(xì)胞分離液。(8)向每管ficoll上小心加入血細(xì)胞稀釋液25ml。800g，20℃離心20min。(9)離心管中液體分為四層，從上至下分別為：黃色的血漿層(回收待用)、白膜層、無色透明的ficoll層、紅黑色的混合細(xì)胞層。(10)小心吸取白膜層到新50ml離心管中，補(bǔ)加d-pbs(-)至50ml，顛倒混勻后500g，20℃離心10min。(11)加入25ml5％人血白蛋白并重懸細(xì)胞，400g，20℃離心10min。(12)棄上清，加入25ml5％人血白蛋白重懸細(xì)胞沉淀，并過70um篩網(wǎng)，計(jì)數(shù)。(13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余細(xì)胞懸液400g，20℃離心10min，加cryopremium并凍存。2、cd4/cd8陽性t細(xì)胞分選。(1)將獲得的pbmc計(jì)數(shù)，以80ul/107cells的比例加入分選緩沖液，重懸細(xì)胞沉淀。(2)再以20ul/107cells的比例加入cd4/cd8磁珠，吹打混勻后放入4℃中孵育15min。(3)取出磁珠-細(xì)胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分選緩沖液，顛倒混勻后，250g，4℃離心10min。(4)以500ul/108cells的比例加入分選緩沖液，重懸細(xì)胞沉淀。(5)用鑷子夾取ls分離柱到磁力架上。(6)同時(shí)準(zhǔn)備2個(gè)15ml離心管，分別標(biāo)記：cd4-/cd8-細(xì)胞液(a管)、cd4+/cd8+細(xì)胞液(b管)。(7)用3ml分離緩沖液潤洗ls,并用a管接緩沖液。(8)加入細(xì)胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml緩沖液沖洗柱子(每次無液體殘留時(shí)再加入新的液體)，總共三次，收集得到cd4/cd8-細(xì)胞。(9)ls分離柱與磁力架分離，用b管接細(xì)胞懸液，加入5ml緩沖液，將并用柱子內(nèi)塞稍用力沖洗，收集為cd4+/cd8+細(xì)胞，取樣計(jì)數(shù)。(10)按1x106/ml-4x106/ml的細(xì)胞密度用aim-v培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并加入2×105～1×106u/lifn-γ因子。3、t細(xì)胞激活。(1)提前一天將1×103ug/l～1×104ug/lcd3單克隆抗體和1×103ug/l～1×104ug/lcd28單克隆抗體加入24孔板，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)取出包被的t75瓶，倒掉包被液，用d-pbs(-)洗滌一次，并將分選得到的細(xì)胞懸液接種到t75瓶中，搖勻，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、lv-hcar19-shrna1soat1～lv-hcar19-shrna13soat1轉(zhuǎn)導(dǎo)及hcar19-shrnasoat1-t細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)。(1)提前一天包被1×103ug/l～1×104ug/lretronectin于24孔板內(nèi)，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)往24孔板中，根據(jù)每孔5×105細(xì)胞量，按moi＝5～20的量，加入慢病毒載體，同時(shí)添加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)。5、hcar19-shrnasoat1-t細(xì)胞體外擴(kuò)增及soat1表達(dá)檢測。(1)每2天等量補(bǔ)加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基，使ph值維持在6.5～7.5之間，細(xì)胞密度維持在5×105～2×106/ml之間，37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。(2)第7天左右，用proteinlmagneticbeads分離約1×106個(gè)hcar19陽性細(xì)胞用于soat1基因表達(dá)檢測。qpcr引物序列為seqidno.22---seqidno.23，結(jié)果如圖12顯示，其中hcar19-shrna6soat1-t敲除效果最好，達(dá)到70％以上的效果，凍存培養(yǎng)的hcar19-shrna6soat1-t細(xì)胞用于后續(xù)檢測。實(shí)施例3hcar19-t和hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞構(gòu)建。參見圖6，本發(fā)明所述hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞的構(gòu)建方法如下：1、分離pbmc。(1)抽取健康供者新鮮外周血50ml；(2)將采血袋噴拭酒精兩遍，并擦干。(3)用50ml注射器將袋中的血細(xì)胞吸出來移至新50ml管中。(4)400g，20℃離心10min。(5)將上層血漿移到新的50ml離心管中，56℃，30min滅活血漿，恢復(fù)至室溫，2000g，離心30min，取上清到50ml離心管中待用。(6)用d-pbs(-)補(bǔ)至50ml，擰緊蓋子，顛倒混勻。(7)取2個(gè)新50ml離心管，每管加入15mlficoll淋巴細(xì)胞分離液。(8)向每管ficoll上小心加入血細(xì)胞稀釋液25ml。800g，20℃離心20min。(9)離心管中液體分為四層，從上至下分別為：黃色的血漿層(回收待用)、白膜層、無色透明的ficoll層、紅黑色的混合細(xì)胞層。(10)小心吸取白膜層到新50ml離心管中，補(bǔ)加d-pbs(-)至50ml，顛倒混勻后500g，20℃離心10min。(11)加入25ml5％人血白蛋白并重懸細(xì)胞，400g，20℃離心10min。(12)棄上清，加入25ml5％人血白蛋白重懸細(xì)胞沉淀，并過70um篩網(wǎng)，計(jì)數(shù)。(13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余細(xì)胞懸液400g，20℃離心10min，加cryopremium并凍存。2、cd4/cd8陽性t細(xì)胞分選。(1)將獲得的pbmc計(jì)數(shù)，以80ul/107cells的比例加入分選緩沖液，重懸細(xì)胞沉淀。(2)再以20ul/107cells的比例加入cd4/cd8磁珠，吹打混勻后放入4℃中孵育15min。(3)取出磁珠-細(xì)胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分選緩沖液，顛倒混勻后，250g，4℃離心10min。(4)以500ul/108cells的比例加入分選緩沖液，重懸細(xì)胞沉淀。(5)用鑷子夾取ls分離柱到磁力架上。(6)同時(shí)準(zhǔn)備2個(gè)15ml離心管，分別標(biāo)記：cd4-/cd8-細(xì)胞液(a管)、cd4+/cd8+細(xì)胞液(b管)。(7)用3ml分離緩沖液潤洗ls,并用a管接緩沖液。(8)加入細(xì)胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml緩沖液沖洗柱子(每次無液體殘留時(shí)再加入新的液體)，總共三次，收集得到cd4/cd8-細(xì)胞。(9)ls分離柱與磁力架分離，用b管接細(xì)胞懸液，加入5ml緩沖液，將并用柱子內(nèi)塞稍用力沖洗，收集為cd4+/cd8+細(xì)胞，取樣計(jì)數(shù)。(10)按1x106/ml-4x106/ml的細(xì)胞密度用aim-v培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并加入2×105～1×106u/lifn-γ因子。3、t細(xì)胞激活。(1)提前一天將1×103ug/l～1×104ug/lcd3單克隆抗體和1×103ug/l～1×104ug/lcd28單克隆抗體加入24孔板，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)取出包被的t75瓶，倒掉包被液，用d-pbs(-)洗滌一次，并將分選得到的細(xì)胞懸液接種到t75瓶中，搖勻，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、car基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及hcar19-t和hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)。(1)提前一天包被1×103ug/l～1×104ug/lretronectin于24孔板內(nèi)，其中半數(shù)的孔中加入1～5μmavasimibe(抑制劑)，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)往24孔板中，根據(jù)每孔5×105細(xì)胞量，按moi＝5～20的量，加入hcar19重組慢病毒載體，同時(shí)添加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)。5、hcar19-t和hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞體外擴(kuò)增。(1)每2天等量補(bǔ)加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基，使ph值維持在6.5～7.5之間，細(xì)胞密度維持在5×105～2×106/ml之間，37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。(2)第7天左右，凍存培養(yǎng)的hcar19-t和hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞用于后續(xù)檢測，其中hcar19-t細(xì)胞作為對照。實(shí)施例4hcar19-t、hcar19-ko3soat1-t、hcar19-shrna6soat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞病原檢測和表達(dá)檢測。一、內(nèi)毒素檢測；(1)、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為15eu/支；(2)、鱟試劑靈敏度λ＝0.25eu/ml,0.5ml/管(3)、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品一支，分別用bet水按比例稀釋成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震蕩溶解15min；稀釋時(shí)每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s；(4)、加樣：取鱟試劑若干支，每支加入bet水0.5ml溶解，分裝至若干支無內(nèi)毒素試管中，每管0.1ml。其中2支為陰性對照管，加入bet水0.1ml；2支為陽性對照管，加入2λ濃度的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ml；2支為樣品陽性對照管，加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液(稀釋20倍的待測樣品1ml+4λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1ml＝2ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋40倍樣品)。樣品管中加入0.1ml樣品，稀釋比例見表3，37±1℃水浴(或培養(yǎng)箱)保溫60±1min；表3內(nèi)毒素稀釋比例及對應(yīng)內(nèi)毒素含量(5)、hcar19-t、hcar19-ko3soat1-t、hcar19-shrna6soat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞的內(nèi)毒素檢測結(jié)果(如圖13所示)，四種細(xì)胞的內(nèi)毒素含量均在在0.25～1.25eu/ml之間，符合《中華人民共和國藥典》中小于10eu/ml的標(biāo)準(zhǔn)。二、支原體檢測；(1)在實(shí)驗(yàn)前三日，細(xì)胞樣品用無抗生素培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；(2)收集1ml細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞數(shù)大于1*105)，置于1.5ml離心管中；(3)13000g離心1min，收集沉淀，棄去培養(yǎng)基；(4)加入500ulpbs用槍頭吹吸或渦旋振蕩，重懸沉淀。13000g離心5min；(5)步驟(4)重復(fù)一次；(6)加入50μlcelllysisbuffer，用槍頭吹吸，充分混勻后,在55℃水浴中孵育20min；(7)將樣品置于95℃中加熱5min；(8)13000g離心5min后，取5μl上清作為模板，25μlpcr反應(yīng)體系為：ddh206.5μl、mycomix1μl、2xtaqplusmixmaster(dyeplus)12.5μl、模板5μl；pcr循環(huán)條件為：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。(9)支原體檢測結(jié)果顯示(如圖14所示)，hcar19-t、hcar19-ko3soat1-t、hcar19-shrna6soat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t中均不含支原體。三、car基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測及免疫分型檢測；(1)收集經(jīng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的t細(xì)胞，用含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞并調(diào)整為1×106/ml。(2)向離心管中加入含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液1ml并混勻，350g離心5min，棄上清。(3)重復(fù)步驟2一次。(4)用0.2ml的含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞，并向離心管中加入1ul的1mg/ulproteinl，5ulcd4-fitc，5ulcd8-apc，混勻，4℃孵育45min。(5)向離心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液并混勻，350g離心5min，棄上清。(6)重復(fù)步驟5兩次。(7)用0.2ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞，并向離心管中加入0.2ulpe-sa，混勻，37℃避光孵育15min。(8)向離心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重并混勻，350g離心5min，棄上清。(9)用1mld-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞沉淀，350g離心5min，棄上清。(10)重復(fù)步驟(9)兩次。(11)用0.4mld-pbs(-)溶液重懸細(xì)胞沉淀，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。(12)car基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及免疫分型檢測檢測結(jié)果如圖15所示，數(shù)據(jù)分析如圖16所示，soat1的催化功能隨著蛋白水平抑制、mrna水平敲減、dna水平敲除越來越弱，car基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也隨之有一定程度的降低，但是cd8+/cd4+比例隨著soat1功能的減弱有明顯的提高，顯示出令人激動(dòng)的潛力。實(shí)施例5hcar19-t、hcar19-ko3soat1-t、hcar19-shrna6soat1-t、hcar19-inhibitorsoat1-t細(xì)胞的功能檢測。一、靶細(xì)胞殺傷效果評估。(1)分別培養(yǎng)cd19+k562細(xì)胞和四種效應(yīng)細(xì)胞；(2)收集靶細(xì)胞(cd19+k562)4x105cells和效應(yīng)細(xì)胞2.8x106cells，800g，6min離心，棄上清；(3)用1mld-pbs(-)溶液分別重懸靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，800g，6min離心，棄上清；(4)重復(fù)步驟3一次；(5)用700ul培養(yǎng)基(aim-v培養(yǎng)基+1～10％fbs)重懸效應(yīng)細(xì)胞，用2ml培養(yǎng)基(aim-v培養(yǎng)基+1～10％fbs)重懸靶細(xì)胞；(6)設(shè)置效靶比為1:1、5:1、10:1的實(shí)驗(yàn)孔，并設(shè)置對照組，每組3個(gè)復(fù)孔；(7)250g，5min平板離心；(8)37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)；(9)250g，5min平板離心；(10)取每個(gè)孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；(11)避光孵育25min；(12)每孔加入50ul終止液；(13)酶標(biāo)儀檢測490nm吸光度；(14)將3個(gè)復(fù)孔取平均值；將所有實(shí)驗(yàn)孔、靶細(xì)胞孔和效應(yīng)細(xì)胞孔的吸光值減去培養(yǎng)基背景吸光值的均值；將靶細(xì)胞最大值的吸光值減去體積校正對照吸光值的均值。(15)將步驟(14)中獲得的經(jīng)過校正的值帶入下面公式，計(jì)算每個(gè)效靶比所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性百分比。結(jié)果如圖17所示，隨著soat1功能的減弱，cd8+/cd4+比例有明顯的提高，同時(shí)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力也有明顯提高，hcar19-ko3soat1-t細(xì)胞的殺傷效率最高；殺傷效率＝(實(shí)驗(yàn)孔-效應(yīng)細(xì)胞孔-靶細(xì)胞孔)/(靶細(xì)胞最大孔-靶細(xì)胞孔)x100％(16)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過調(diào)控car-t的細(xì)胞脂質(zhì)代謝，抑制了soat1，減少了膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，增加了car-t內(nèi)的膽固醇含量，能夠有效提高car-t細(xì)胞中cd8+/cd4+細(xì)胞的比例，顯著提高car-t細(xì)胞的殺傷作用，達(dá)到了預(yù)料不到的技術(shù)效果。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞有著超越car-t細(xì)胞的殺傷能力，因此調(diào)控car-t的細(xì)胞脂質(zhì)代謝在腫瘤的細(xì)胞治療中擁有極高的應(yīng)用價(jià)值。序列表<110>上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司<120>膽固醇轉(zhuǎn)脂酶soat1被抑制的car-t細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用<130>hj17-13059<160>50<170>patentinversion3.5<210>1<211>861<212>dna<213>人工序列<400>1atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcct60gtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca120cgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcccc180gaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcc240cgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttg300gttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatta360tgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatc420ggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgcctt480gatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg540cctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagct600tcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgc660tcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtct720cgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctac780acgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcc840tcactgattaagcattggtaa861<210>2<211>333<212>dna<213>人工序列<400>2gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccacc60atctcctgcaaggccagccaaagtgttgattatgatggtgatagttatttgaactggtac120caacagattccaggacagccacccaaactcctcatctatgatgcatccaatctagtttct180gggatcccacccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccat240cctgtggagaaggtggatgctgcaacctatcactgccagcaaagtactgaggatccgtgg300acgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa333<210>3<211>375<212>dna<213>人工序列<400>3caggttcagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatt60tcctgcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagagg120cctggacagggtcttgagtggattggacagatttggcctggagatggtgatactaactac180aatggaaagttcaagggtaaagccactctgactgcagacgaatcctccagcacagcctac240atgcaactcagcagcctagcatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagacgggag300actacgacggtaggccgttattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtc360accgtctcctcgagt375<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>4accggaagtcagcatcattagataag26<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>5aaaacttatctaatgatgctgacttc26<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>6accggtcagcatcattagataatggg26<210>7<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>7aaaacccattatctaatgatgctgac26<210>8<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>8accggcagcatcattagataatggtg26<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>9aaaacaccattatctaatgatgctgc26<210>10<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>10accggacaaccttttctgttcttgag26<210>11<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>11aaaactcaagaacagaaaaggttgtc26<210>12<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>12accggctctccttcaagaacagaaag26<210>13<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>13aaaactttctgttcttgaaggagagc26<210>14<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>14accggtgctgacttttcaatgagatg26<210>15<211>26<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>15aaaacatctcattgaaaagtcagcac26<210>16<211>25<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>16accggttctccgaacgtgtcacgtg25<210>17<211>25<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>17aaaacacgtgacacgttcggagaac25<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>18cctttccgggactttcgcttt21<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>19gcagaatccaggtggcaaca20<210>20<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>20catgtacgttgctatccaggc21<210>21<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>21ctccttaatgtcacgcacgat21<210>22<211>22<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>22agttggcagtcactttgatgat22<210>23<211>20<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>23ttgtgagagcgcacccacca20<210>24<211>261<212>dna<213>人工序列<400>24ccccttcaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggc60tgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatac120gtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaat180ggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatctt240gtggaaaggacgaaactccgg261<210>25<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>25cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>26<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>26gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaagccgatttggaatgttctgatctcgagatcag60aacattccaaatcggcccggagtttcgtcctttcca96<210>27<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>27cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>28<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>28gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaagtaatggtcgaattgacataactcgagttatg60tcaattcgaccattacccggagtttcgtcctttcca96<210>29<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>29cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>30<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>30gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaattcccggttcatcattatattctcgagcgaat60ataatgatgaaccgggccggagtttcgtcctttcca96<210>31<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>31cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>32<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>32gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaatggtccatgactggctatattctcgaggtaat60atagccagtcatggacccggagtttcgtcctttcca96<210>33<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>33cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>34<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>34gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaagtgcctcgggtactaaattcactcgaggctga60atttagtacccgaggcccggagtttcgtcctttcca96<210>35<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>35cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>36<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>36gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaattggtgacaggatgttctatactcgagcttat60agaacatcctgtcaccccggagtttcgtcctttcca96<210>37<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>37cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>38<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>38gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaacagcacacttgtagtagattactcgagtgtaa60tctactacaagtgtgcccggagtttcgtcctttcca96<210>39<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>39cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>40<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>40gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaaatctgctgtagtacacgaatactcgagcatat60tcgtgtactacagcagccggagtttcgtcctttcca96<210>41<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>41cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>42<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>42gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaaaaccagtatttgtacttcttactcgagaataa60gaagtacaaatactggccggagtttcgtcctttcca96<210>43<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>43cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>44<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>44gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaaaatacctacagtcaaccagtactcgagaatac60tggttgactgtaggtaccggagtttcgtcctttcca96<210>45<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>45cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>46<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>46gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaaaacaaccatagagcgaaggatctcgagaaatc60cttcgctctatggttgccggagtttcgtcctttcca96<210>47<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>47cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>48<211>96<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>48gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaaacctacagtcaaccagtatttctcgagacaaa60tactggttgactgtagccggagtttcgtcctttcca96<210>49<211>49<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>49cctgccccctcgctaagtcgacgctagcccccttcaccgagggcctatt49<210>50<211>92<212>rna<213>人工序列<220><221>misc_rna<223>shrna<400>50gaggttgattgtcgacgaattcaaaaaattctccgaacgtgtcacgtctcgagacgtgac60acgttcggagaaccggagtttcgtcctttcca92當(dāng)前第1頁12