本發(fā)明涉及一種自體脂肪干細(xì)胞生物活性肽凍干粉的制備方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種自體來源的生物活性肽的制備方法，本方法可以有效制備高質(zhì)量自體干細(xì)胞來源的生物活性肽。
背景技術(shù)：
：近年來隨著科技的發(fā)展和生活水平的提高，人們對美容和抗衰老的需求爆發(fā)式增長。隨之而誕生的美容抗衰老手段和方式也應(yīng)運(yùn)而生。包括曾經(jīng)名噪一時(shí)的羊胎素、人胎盤素和干細(xì)胞抗衰老等。羊胎素和胎盤素雖然有不錯(cuò)的用戶體驗(yàn)，但來源為異種和異體，涉及倫理問題和風(fēng)險(xiǎn)控制問題，使用需要謹(jǐn)慎價(jià)格也十分昂貴。目前市場上干細(xì)胞美容的傳統(tǒng)方式為注射干細(xì)胞，這些干細(xì)胞往往來自于流產(chǎn)胎兒、還有異體的圍產(chǎn)組織，除了尖銳的倫理問題還有來源把控問題，感染病毒的陽性細(xì)胞注射到人體可以直接導(dǎo)致用戶感染，因此異體干細(xì)胞的使用也一度收到質(zhì)疑。干細(xì)胞在穩(wěn)定生長過程中，會(huì)分泌許多種細(xì)胞因子，以蛋白質(zhì)多肽形式分泌到培養(yǎng)基上清中，通過收集處理培養(yǎng)干細(xì)胞之后的上清液，通過一系列處理，可以獲得大量細(xì)胞因子，這些人源性因子包括egf(表皮生長因子)、vegf(血管內(nèi)皮生長因子)、hgf(肝臟生長因子)、pdgf(血小板衍生因子)、bfgf(成纖維細(xì)胞生長因子)等，還能直接分泌膠原蛋白。這些因子大都具有與皮膚生長、血管生長、皮下組織再生有關(guān)的生物活性，能夠有效調(diào)控機(jī)體細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，活化人體細(xì)胞進(jìn)而生理性修復(fù)或替代機(jī)體損傷、衰老細(xì)胞，促進(jìn)改善皮膚再生修復(fù)。含干細(xì)胞生物活性肽的干細(xì)胞化妝品已經(jīng)在多個(gè)國家上市，特別是在政策寬松、整形美容行業(yè)發(fā)達(dá)的韓國。但目前推出的干細(xì)胞生物活性肽類產(chǎn)品往往是在上清液中直接摻入化妝品基質(zhì)制成，濃度低，市場普遍反映使用效果欠佳，甚至有過敏和干燥紅腫。液體狀態(tài)下的干細(xì)胞生物活性肽溶液在室溫保存時(shí)間短，不利于運(yùn)輸，濃度也低。并且異體來源的干細(xì)胞生物活性肽，干細(xì)胞種子雖然經(jīng)過篩選，但仍然存在感染風(fēng)險(xiǎn)。還有一些產(chǎn)品是通過直接裂解干細(xì)胞或其它活性細(xì)胞直接獲得，蛋白成分復(fù)雜，雖然濃度高，但無效蛋白多，對人體也將是代謝壓力。比如公告號(hào)為cn106381284a的專利，采用了異體臍帶來源的干細(xì)胞超聲破碎收集蛋白和多肽，此類方法獲得的大量蛋白質(zhì)都為胞內(nèi)蛋白，雖然濃度高，但絕大部分不具有對皮膚細(xì)胞調(diào)節(jié)或修復(fù)的因子功能，況且大規(guī)模異體獲得的臍帶干細(xì)胞仍然有感染風(fēng)險(xiǎn)。此外除了使用異體干細(xì)胞有感染風(fēng)險(xiǎn)外，大量使用異種血清也是重要的風(fēng)險(xiǎn)因素，適用人群對胎牛蛋白等的過敏會(huì)直接導(dǎo)致使用感受下降，例如公布號(hào)為cn102465148a的專利，使用了胎牛血清作為培養(yǎng)基主要成分，胎牛血清成分復(fù)雜，而且會(huì)直接進(jìn)入產(chǎn)品，引起過敏風(fēng)險(xiǎn)。培養(yǎng)基除了需要不含有動(dòng)物血清以外，一些有可能造成皮膚損傷的內(nèi)含物也必須去除，比如常用的干細(xì)胞培養(yǎng)基指示劑酚紅和避免培養(yǎng)過程污染的抗生素。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種制備自體脂肪干細(xì)胞生物活性肽凍干粉的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明提供了一種制備自體脂肪干細(xì)胞生物活性肽凍干粉的方法，其包括如下步驟：s1：提取自體脂肪組織；s2：利用所述自體脂肪組織制備原代脂肪干細(xì)胞；s3：利用所述原代脂肪干細(xì)胞制備第五代脂肪干細(xì)胞，并獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清液；選擇第五代脂肪干細(xì)胞，是一種質(zhì)量控制的方式，更穩(wěn)定也使干細(xì)胞狀態(tài)最佳的代數(shù)。代數(shù)往后的細(xì)胞干細(xì)胞特性會(huì)不佳。s4：將所述細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行離心，棄上清并收集上清溶液，并對所述上清溶液進(jìn)行過濾；s5：進(jìn)行超濾濃縮后，加入凍干保護(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥，得到所述自體脂肪干細(xì)胞生物活性肽凍干粉。作為優(yōu)選方案，所述自體脂肪組織的提取方法為：在局部麻醉的狀態(tài)下，在腰腹部皮下注射膨脹液后，利用66.5～93.1kpa的負(fù)壓進(jìn)行脂肪抽取。作為優(yōu)選方案，所述膨脹液包含如下重量或體積的各組分：作為優(yōu)選方案，所述原代脂肪干細(xì)胞的制備方法為：去除自體脂肪組織中的膨脹液后，用生理鹽水對自體脂肪組織進(jìn)行洗滌；加入ii型膠原酶溶液，進(jìn)行消化后，離心消化產(chǎn)物，去除上層脂肪組織，保留沉淀和部分中間層溶液，得到原代脂肪干細(xì)胞。作為優(yōu)選方案，所述第五代脂肪干細(xì)胞的制備方法為：配制干細(xì)胞培養(yǎng)基；將所述原代脂肪干細(xì)胞接種于干細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃、5v/v％co2的條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)7天左右觀察到細(xì)胞集落，并繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80～85％時(shí)，用生理鹽水溫和沖洗培養(yǎng)瓶底部2次，加入4～5毫升消化液，室溫放置30秒，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞背景變透亮，細(xì)胞間隙變大，輕輕拍打瓶壁，加入5毫升完全培養(yǎng)基終止消化，并反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶底部，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50毫升離心管中，混勻計(jì)數(shù)，按照1*105密度繼續(xù)接種傳代，2～4天細(xì)胞密度達(dá)到80～85％時(shí)重復(fù)以上操作，獲得大量第五代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。作為優(yōu)選方案，所述凍干保護(hù)劑包括右旋糖苷、海藻糖、甘露醇和精氨酸。作為優(yōu)選方案，步驟s5中所述的冷凍干燥的具體操作為：在-30℃下預(yù)冷4h；在-25℃的溫度、5pa的負(fù)壓下，冷凍過夜后，在30℃的溫度、5pa的負(fù)壓下干燥1h。本發(fā)明使用自體脂肪干細(xì)胞作為生物活性肽的來源，避免異體的感染和過敏風(fēng)險(xiǎn)；無動(dòng)物源性無酚紅指示劑和抗生素的培養(yǎng)方法；通過超濾和真空冷凍抽干，使得生物活性肽以凍干粉形式保存，方便稀釋、運(yùn)輸和配置。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：合理方式收集干細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)過一系列處理，在保證回收率的情況下，獲得的未變性的生物因子活性肽凍干粉。這種凍干粉在低溫下可以長期保存，便于運(yùn)輸，成分穩(wěn)定的批量凍干粉。在簡單的溶解、稀釋步驟下，能夠獲得目的濃度的生物活性肽溶液，用于皮膚修復(fù)、皮膚護(hù)理、保養(yǎng)的產(chǎn)品生產(chǎn)；現(xiàn)有技術(shù)中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源于異體臍帶組織，非自體，屬于同種異體來源。本專利所申請自體脂肪干細(xì)胞生物活性肽通過采集自身脂肪獲得干細(xì)胞來源。臍帶組織來源豐富，采集簡單，但是異體干細(xì)胞來源的產(chǎn)物需要嚴(yán)格篩選異體干細(xì)胞種子，不合格的干細(xì)胞種子會(huì)帶來感染風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，脂肪干細(xì)胞相較于其它來源干細(xì)胞，例如臍帶干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞等，分泌的生物活性肽更為豐富，含量更高。相比于現(xiàn)有技術(shù)中的臍帶干細(xì)胞生物活性肽使用的是細(xì)胞裂解物，裂解物中蛋白成分復(fù)雜，雖然濃度高，但大多為無活性的細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白，本發(fā)明技術(shù)使用收集干細(xì)胞上清，上清中含大量分泌因子，多為對皮膚修復(fù)生長至關(guān)重要的營養(yǎng)、修復(fù)、再生因子。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：圖1為使用貼壁試劑培養(yǎng)10天(圖1a)和不使用貼壁試劑培養(yǎng)10天(圖1b)的效果對比圖；圖2為自體脂肪干細(xì)胞p0(圖2a)和自體脂肪干細(xì)胞p5(圖2b)的對比圖；圖3為p5代自體脂肪干細(xì)胞流式細(xì)胞圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本實(shí)施例涉及一種制備自體脂肪干細(xì)胞生物活性肽凍干粉的方法，包括如下步驟：1、吸脂術(shù)采集自體脂肪組織。局部麻醉狀態(tài)下吸脂術(shù)采集自體腰腹部脂肪25-50ml凈脂肪，配置1000毫升膨脹液包含：1％利多卡因40毫升、1毫克腎上腺素、8.4％碳酸氫鈉20毫升，并用乳酸林格液配齊1000毫升。在腰腹部皮下注射50毫升膨脹液后負(fù)壓66.5～93.1kpa(500～700mmhg)抽取100毫升脂肪。2、制備原代脂肪干細(xì)胞。將脂肪組織在4℃和1000g條件下離心，去除膨脹液，并用生理鹽水洗滌后，獲得純凈脂肪組織。加入等體積6％質(zhì)量體積比(即100ml溶液中6毫克)的ⅱ型膠原酶溶液，在37℃水浴環(huán)境下消化30分鐘，加入終止液后充分混勻并1000g(重力加速度)離心消化產(chǎn)物，去除上層脂肪組織，保留沉淀和部分中間層溶液，獲得原代脂肪干細(xì)胞。其中的消化液的配方為：6％質(zhì)量體積比的ⅱ型膠原酶、2％人血清白蛋白(即以生理鹽水為溶劑，100ml溶劑中含有6mgii型膠原酶，2ml人血清白蛋白)。終止液為20毫升clinicmacs溶液。3、培養(yǎng)穩(wěn)定第五代脂肪干細(xì)胞。①在培養(yǎng)原代脂肪干細(xì)胞前一天預(yù)處理75cm2培養(yǎng)瓶。稀釋商品化貼壁試劑至1％，吸取5毫升包被培養(yǎng)瓶，在4℃環(huán)境下過夜，備用。使用貼壁試劑可以提高原代脂肪干細(xì)胞的接種成功數(shù)量，提高產(chǎn)量縮短生產(chǎn)時(shí)間(圖1a)，不使用貼壁試劑會(huì)減少細(xì)胞貼壁，減少產(chǎn)量(圖1b)。②配制干細(xì)胞培養(yǎng)基。采用無酚紅無血清培養(yǎng)法，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清替代物按照10v/v％的比例混合，配制成無血清完全培養(yǎng)基。此步驟不添加動(dòng)物血清和抗生素，部分人對動(dòng)物血清可能會(huì)過敏，造成副作用，本步驟避免此類反應(yīng)。部分人對細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加的抗生素過敏，本步驟不使用抗生素，避免此類反應(yīng)。③原代脂肪干細(xì)胞接種。將獲得的原代脂肪干細(xì)胞按照1*106/cm2密度接種在步驟①獲得的培養(yǎng)瓶中，放置在設(shè)定為37℃，5％(壓力比)co2的細(xì)胞孵箱中。在72小時(shí)后更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)7天左右觀察到細(xì)胞集落(見圖2a)，并繼續(xù)培養(yǎng)。④脂肪干細(xì)胞傳代。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80～85％時(shí)，用生理鹽水溫和沖洗培養(yǎng)瓶底部2次，加入4～5毫升消化液，室溫放置30秒，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞背景變透亮，細(xì)胞間隙變大，輕輕拍打瓶壁，加入5毫升完全培養(yǎng)基終止消化，并反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶底部，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50毫升離心管中，混勻計(jì)數(shù)，按照1*105密度繼續(xù)接種傳代，2～4天細(xì)胞密度達(dá)到80～85％時(shí)重復(fù)以上操作，已獲得大量p5代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(見圖2b)。其中的傳代消化液為0.25wt％胰酶。⑤脂肪干細(xì)胞檢測。臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測活率大于95％；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞陽性標(biāo)志物(cd73、cd90、cd105)大于90％；陰性標(biāo)志物(cd31、cd34、cd45、hla-dr)小于5％；快速內(nèi)毒素檢測小于0.5eu；衣原體和支原體檢測陰性。見圖3。4、收集預(yù)處理脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)上清液。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和個(gè)體差異，最后獲得p5代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目將在2*109，同時(shí)獲得脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)上清液10～15升。收集干細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過高速離心去除不溶物質(zhì)和懸浮細(xì)胞，離心條件為4℃和16000g(重力加速度)，時(shí)間25分鐘，棄上清并收集上清溶液。此步驟去除游離染色質(zhì)、懸浮細(xì)胞和不溶大分子。將獲得的溶液通過0.22μm過濾器去除細(xì)菌和殘余不溶物質(zhì)。5、在4℃冷房環(huán)境內(nèi)對獲得溶液進(jìn)行超濾濃縮，選用孔徑在0.2nm的超濾膜，操作壓力為0.35mpa，進(jìn)行超濾，濃縮上清液體體積，將10l液體超濾至500-800ml,混勻后轉(zhuǎn)入一個(gè)新容器，本步驟可以去除上清液中多余的水，和絕大多數(shù)無機(jī)鹽，這些無機(jī)鹽對蛋白質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)品使用都會(huì)有明顯的副作用；6、將步驟5獲得的上清液加入凍干保護(hù)劑并轉(zhuǎn)移到真空冷凍干燥機(jī)器中。①預(yù)冷冷凍干燥機(jī)。設(shè)定-30℃預(yù)冷4小時(shí)；②設(shè)定穩(wěn)定在-25℃，在5帕負(fù)壓下，操作過夜，將中溶液成分凍干成粉末狀。③設(shè)定30℃，保持5帕負(fù)壓，繼續(xù)干燥1小時(shí)。其中的凍干保護(hù)劑為1wt％右旋糖苷、0.5wt％海藻糖、1.5wt％甘露醇和0.5wt％精氨酸的混合物，其中，右旋糖苷、海藻糖、甘露醇和精氨酸質(zhì)量比為0.01：0.5：1.5：0.5。7、將步驟6獲得的凍干粉末壓塞裝入西林瓶，貼以標(biāo)簽。凍干操作對樣品回收比例的影響如表1所示，其中，非凍干樣本7天樣本回收比例(e組)；凍干樣本7天樣本回收比例(f組)；表1、液體4℃保存7天和凍干7天后溶解濃度對比(pg/ml)：因子處理前濃度e組濃度e組回收率f組濃度f組回收率pdgf42.4115.7337.1％33.7079.5％bfgf154.2963.8641.4％148.6596.3％kgf76.5523.0430.1％45.7559.8％tgf-β1122.3145.6037.3％97.9980.1％hgf880.64401.4945.6％684.3277.7％fibronectin2570.671290.6550.2％2319.9390.2％vegf790.50586.7674.2％620.6478.5％typeicollagen856.21268.3331.3％823.9696.2％以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。當(dāng)前第1頁12