本發(fā)明涉及一種蔗糖轉運蛋白及其在調控植物雄性不育中的應用。
背景技術：
：黃瓜屬于葫蘆科甜瓜屬，為重要的園藝作物，在世界各地普遍栽培，是我國主栽蔬菜作物之一。糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物，也是植物長距離運輸和貯藏的主要形式，更是協(xié)調植物源庫關系的重要信號分子。葉片制造的糖經(jīng)過韌皮部長距離運輸，到達并在花、果實、種子等庫器官中卸出，其在庫器官中卸出的方式、卸出的速度對產(chǎn)量和品質形成具有重要作用。對大多數(shù)植物來說，蔗糖是其光合產(chǎn)物的主要運輸形式，少數(shù)作物以棉籽糖家族系列寡糖為主要運輸形式。糖到達庫器官以后會以多種方式卸出，分解或重新轉運的過程需要各種轉運蛋白和酶的參與，其代謝轉運機制相當復雜。蔗糖轉運蛋白作為運輸蔗糖的工具，參與韌皮部糖卸載，在很大程度上調節(jié)著植株源庫關系，調節(jié)著植株碳素分配。在黃瓜中研究蔗糖轉運蛋白的作用及分子機理，有利于豐富和完善同化物源庫運輸細胞學路徑理論體系，為實現(xiàn)黃瓜優(yōu)質高產(chǎn)栽培提供理論參考。植物雄性不育一直是近年來的研究熱點，因為在雜交育種中雄性不育系可以極大地節(jié)省人工，節(jié)約時間，減少種子生產(chǎn)成本，著名的三系法雜交水稻育種就是應用了雄性不育系大大提高了種子生產(chǎn)效率。黃瓜的花屬于雌雄異花同株，雌花包括下位的子房和上位的柱頭及花瓣、萼片，雄花包括花藥、花瓣、花萼?；ㄆ鞴僭谥仓晟L發(fā)育過程中屬于非常強大的庫，花從分化到開放的整個發(fā)育過程一般需要在數(shù)天之內完成，此過程需要大量的糖分供應，糖分供應不及時往往會造成花器官發(fā)育異常甚至敗育。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種蔗糖轉運蛋白及其在調控植物雄性不育中的應用。本發(fā)明提供的蛋白質，獲自黃瓜，命名為cssut1蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(a2)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物雄性育性相關的由序列1衍生的蛋白質。為了使(a1)中的cssut1蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列標簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個)rrrrrpoly-his2-10(通常為6個)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述(a2)中的cssut1蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(a2)中的cssut1蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。編碼所述cssut1蛋白的基因(cssut1基因)也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述cssut1基因為如下(b1)-(b3)中任一所述的dna分子：(b1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的dna分子；(b2)在嚴格條件下與(b1)限定的dna序列雜交且編碼與植物雄性育性相關蛋白的dna分子；(b3)與(b1)或(b2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼與植物雄性育性相關蛋白的dna分子。上述嚴格條件可為用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。含有所述cssut1基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還保護cssut1蛋白或cssut1基因在調控植物雄性育性中的應用。本發(fā)明還保護cssut1蛋白或cssut1基因在植物育種中的應用。所述植物育種是為了選育雄性不育的植物。本發(fā)明還保護一種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟：抑制目的植物中cssut1基因的表達，得到雄性不育的轉基因植物。所述方法中，所述“抑制目的植物中cssut1基因的表達”是通過干擾載體實現(xiàn)的。所述干擾載體可通過ti質粒、ri質粒、植物病毒載體、直接dna轉化、顯微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化到目的植物中。所述干擾載體具體可為含有干擾片段的重組表達載體。所述干擾片段包括區(qū)段甲和區(qū)段乙。所述區(qū)段甲和所述區(qū)段乙為反向互補序列。所述區(qū)段甲的序列如序列表的序列3所示。所述干擾片段具體可為序列表的序列4所示。所述干擾載體具體可為在載體pfgc1008的多克隆位點中插入了序列表的序列4所示的雙鏈dna分子得到的重組表達載體。所述干擾載體具體可為將載體pfgc1008的asci和spei酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列4所示的dna分子得到的重組表達載體。本發(fā)明還保護一種培育雄性不育植物的方法，包括如下步驟：抑制目的植物中cssut1蛋白的活性和/或表達量，得到雄性不育的植物。以上任一所述目的植物具體可為雙子葉植物。所述雙子葉植物可為葫蘆科植物。所述葫蘆科植物可為黃瓜屬植物。所述黃瓜屬植物具體可為黃瓜，例如新泰密刺黃瓜。本發(fā)明還保護以上任一所述方法在植物育種中的應用。所述植物育種是為了選育雄性不育的植物。本發(fā)明還保護一種特異dna分子，包括區(qū)段甲和區(qū)段乙。所述區(qū)段甲和所述區(qū)段乙為反向互補序列。所述區(qū)段甲的序列如序列表的序列3所示。所述特異dna分子如序列表的序列4所示。本發(fā)明還保護一種干擾載體，是將所述特異dna分子導入表達載體得到的。所述干擾載體具體可為在載體pfgc1008的多克隆位點中插入了序列表的序列4所示的雙鏈dna分子得到的重組表達載體。所述干擾載體具體可為將載體pfgc1008的asci和spei酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列4所示的dna分子得到的重組表達載體。本發(fā)明還保護所述特異dna分子或所述干擾載體在植物育種中的應用。所述植物育種是為了選育雄性不育的植物。以上任一所述植物具體可為雙子葉植物。所述雙子葉植物可為葫蘆科植物。所述葫蘆科植物可為黃瓜屬植物。所述黃瓜屬植物具體可為黃瓜，例如新泰密刺黃瓜。以上任一所述雄性不育具體可表現(xiàn)為雄花無法生長和/或雄花花藥表面無花粉散出和/或雄花花粉無活力。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種黃瓜蔗糖轉運蛋白cssut1及其編碼基因，下調cssut1基因的表達量會導致黃瓜植株雄性不育。本發(fā)明可以應用到黃瓜育種中，對提高育種效率有著積極的作用。附圖說明圖1為黃瓜不同組織部位cssut1基因表達量分析。圖2為干擾載體pfgc1008-rnai-cssut1部分原件示意圖。圖3為轉基因干擾植株鑒定結果。圖4為干擾植株(rnai)雄花生長速度觀察結果。圖5為干擾植株(rnai)花粉粒染色觀察結果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。新泰密刺黃瓜：參考文獻：chengj，wangz，yaof，eta1.down-regulatingcsht1，acucumberpollen-specifichexosetransporter，inhibitspollengermination，tubegrowth，andseeddevelopment.[j].plantphysiology，2015，168(2)：635-47.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。載體pfgc1008：參考文獻：chench，yins，liuxw，，liub，yangs，xuesd，caiyl，blackk，liuhl，dongmm，zhangyq，zhaoby，renhz(2016)thewd-repeatproteincsttg1regulatesfruitwartformationthroughinteractionwiththehomeodomain-leucinezipperiproteinmict.plantphysiology171：1156-1168；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。農(nóng)桿菌lba4404：參考文獻：chengj，wangz，yaof，etal.down-regulatingcsht1，acucumberpollen-specifichexosetransporter，inhibitspollengermination，tubegrowth，andseeddevelopment.[j].plantphysiology，2015，168(2)：635-47.；公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。ms固體培養(yǎng)基：ms培養(yǎng)基4.43g，蔗糖30g，植物凝膠2.5g，補水至1l，調ph5.7-5.8。ms分化培養(yǎng)基：ms培養(yǎng)基4.43g，蔗糖30g，植物凝膠2.5g，6-ba0.5mg，aba1mg，補水至1l，ph5.7-5.8。ms培養(yǎng)基：北京西美杰科技有限公司，貨號：m519。實施例1、cssut1蛋白及其編碼基因的獲得對各品種黃瓜基因組進行序列分析、區(qū)段截取和功能驗證，從新泰密刺黃瓜中發(fā)現(xiàn)一種蔗糖轉運蛋白，將其命名為cssut1蛋白，如序列表的序列1所示。將編碼cssut1蛋白的基因命名cssut1基因，如序列表的序列2所示。實施例2、黃瓜不同組織部位cssut1基因表達量分析分別取長至初瓜期的新泰密刺黃瓜的根(r)、莖(s)、幼葉(yl)、成熟葉(ml)、雄花(mf)、雌花(ff)和果實(f)。提取上述材料的總rna，并合成第一鏈cdna，采用qrt-pcr的方法檢測cssut1基因的表達情況(以tubllin基因為內參基因)，采用引物ysut1-f和引物ysut1-r組成的引物對檢測cssut1基因的表達，采用引物tub-f和引物tub-r組成的引物對檢測tubllin基因的表達。ysut1-f：5’-cgtggttacaaaggttgctgag-3’；ysut1-r：5’-gcggatacgatgaactgtgga-3’；tub-f：5’-acgctgttggtggtggtac-3’；tub-r：5’-agaggggtaaacagtgaatc-3’。結果如圖1所示。結果表明，cssut1基因在黃瓜的雄花中特異性表達，其他部位較低或檢測不到。實施例3、轉基因植株的獲得一、干擾載體的構建1、提取新泰密刺黃瓜的總rna，并反轉錄為cdna，以cdna為模板，采用cssut1-rnai-1f和cssut1-rnai-1r組成的引物對進行pcr擴增，回收pcr擴增產(chǎn)物。cssut1-rnai-1f：5’-aggcgcgccatcggttggttcccatttatcat-3’；cssut1-rnai-1r：5’-atttaaatccccagcacgaacaccaa-3’。cssut1-rnai-1f和cssut1-rnai-1r中，下劃線分別標注asci和swai酶切位點。2、用限制性內切酶asci和swai雙酶切步驟1的pcr擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內切酶asci和swai雙酶切載體pfgc1008，回收約10907bp的載體骨架。4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組載體pfgc1008-rnai-1。根據(jù)測序結果，對重組載體pfgc1008-rnai-1進行結構描述如下：將載體pfgc1008的asci和swai酶切位點之間的小片段取代為了序列表中序列3所示的dna分子。5、提取新泰密刺黃瓜的總rna，并反轉錄為cdna，以cdna為模板，采用cssut1-rnai-2f和cssut1-rnai-2r組成的引物對進行pcr擴增，回收pcr擴增產(chǎn)物。cssut1-rnai-2f：5’-gactagtatcggttggttcccatttatcat-3’；cssut1-rnai-2r：5’-cgcggatccccccagcacgaacaccaa-3’。cssut1-rnai-2f和cssut1-rnai-2r中，下劃線分別標注spei和bamhi酶切位點。6、用限制性內切酶spei和bamhi雙酶切步驟5的pcr擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。7、用限制性內切酶spei和bamhi雙酶切步驟4得到的重組載體pfgc1008-rnai-1，回收約11190bp的載體骨架。8、將步驟6的酶切產(chǎn)物和步驟7的載體骨架連接，得到干擾載體pfgc1008-rnai-cssut1。根據(jù)測序結果，對干擾載體pfgc1008-rnai-cssut1進行結構描述如下：將載體pfgc1008的asci和spei酶切位點之間的小片段取代為了序列表中序列4所示的dna分子。干擾載體pfgc1008-rnai-cssut1部分原件示意圖如圖2所示。二、轉基因干擾植株的獲得1、將步驟一得到的干擾載體pfgc1008-rnai-cssut1導入農(nóng)桿菌lba4404，得到重組農(nóng)桿菌。2、取步驟1得到的重組農(nóng)桿菌，接種至含有25μg/ml利福平和100μg/ml氯霉素的yeb液體培養(yǎng)基中，120rpm、28℃培養(yǎng)至菌液od600nm達到0.6-0.8；將菌液5000rpm離心5min收集菌體沉淀，將菌體沉淀用1/2ms液體培養(yǎng)基洗滌2次后，重新懸浮于1/2ms液體培養(yǎng)基中，調整菌液od600nm為0.2-0.3。3、取新泰密刺黃瓜種子，播種于ms固體培養(yǎng)基中28℃恒溫暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)2天后進行后續(xù)實驗。4、取步驟3萌發(fā)2天后的黃瓜幼嫩子葉，去除生長點后將每片子葉均勻分成2塊，只保留靠近生長點一半的部分。5、將步驟4處理后的黃瓜子葉浸沒在步驟2得到的農(nóng)桿菌菌液中侵染15分鐘，然后用滅菌的濾紙吸干多余菌液，將黃瓜子葉接種至ms分化培養(yǎng)基中，黑暗條件28℃培養(yǎng)2天后收獲外植體。6、將步驟5得到的外植體接種至含有500mg/l羧芐青霉素的ms分化培養(yǎng)基上，25℃、2000lx光照強度(14h光照/10h黑暗)培養(yǎng)，待抗性芽長至1cm時，將其切下移入含有200mg/l羧芐青霉素的ms固體培養(yǎng)基中誘導生根，獲得t0代植株，待植株根系發(fā)育好后，移入盛有無菌土的花盆中，覆膜保溫保濕，28℃、2000lx光照強度(12h光照/12h黑暗)培養(yǎng)，10天后除去覆膜，14天后定植于日光溫室，進行常規(guī)田間管理。7、取步驟6的t0代植株的葉片，提取總rna并反轉錄為cdna，以edna為模板，采用引物35s2-f和35s2-r進行pcr鑒定。35s2-f：5’-tggttagagaggcttacgcagcaggtc-3’；35s2-r：5’-ccatctttgggaccactgtcggca-3’。將pcr產(chǎn)物進行電泳，如果得到特異性條帶，則待測植株鑒定為陽性。設置采用新泰密刺黃瓜(野生型)cdna為模板的野生型對照(wt)。設置采用水為模板的陰性對照(-)。設置采用干擾載體pfgc1008-rnai-cssut1為模板的陽性對照(+)。鑒定結果如圖3所示。8、取步驟7鑒定為陽性的t0代植株的葉片，提取總rna，采用實施例2中的方法檢測cssut1基因的表達情況。檢測結果如圖3所示。結果表明，rnai14中cssut1基因的表達量下降最顯著。9、將t0代rnai14植株自交，得到t1代植株。取若干rnai14株系的t1代植株，按照步驟7和步驟8的方法進行鑒定和表達量檢測。結果如圖3所示。結果表明，t1代植株中，rnai14-1中cssut1基因的表達量下降最顯著。三、轉空載體植株的獲得采用載體pfgc1008代替干擾載體pfgc1008-rnai-cssut1，按照步驟二進行操作，得到轉空載體植株。實施例4、轉基因干擾植株的表型觀察待測植株為：新泰密刺黃瓜(wt)、實施例3構建的t1代轉基因干擾植株(rnai14-1、rnai14-6和rnai14-8)和實施例3構建的t1代轉空載體植株。1、選取待測植株同一節(jié)位、庫強相似、大小相同的早期雄花進行連續(xù)多天的觀察。結果如圖4所示。結果表明干擾植株(rnai)的雄花生長速度明顯慢于野生型(wt)，雄花發(fā)育后期甚至生長停滯，無法開放，然后變黃萎蔫凋落。轉空載體植株表型與野生型(wt)相同。2、取待測植株開花當天的雄花，去掉花瓣萼片，在體式顯微鏡下觀察花藥表面的花粉散出情況。結果如圖5a所示。結果表明，野生型(wt)花藥表面有大量花粉粒，而干擾植株(rnai)花藥表面無花粉散出。轉空載體植株表型與野生型(wt)相同。3、取待測植株開花當天雄花花藥，摩擦載玻片使花粉散落到載玻片上，滴一滴碘-碘化鉀溶液，染色5min，然后蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察。結果如圖5b所示。結果表明，野生型(wt)花粉大量散出且被染成藍黑色，活力強，干擾植株(rnai)花藥摩擦后幾乎無花粉散出，僅有的1-2顆花粉粒也不能被碘-碘化鉀染成藍色，沒有花粉活力。說明干擾植株(rnai)是完全雄性不育的。轉空載體植株表型與野生型(wt)相同。<110>中國農(nóng)業(yè)大學<120>蔗糖轉運蛋白及其在調控植物雄性不育中的應用<160>4<210>1<211>495<212>prt<213>黃瓜（cucumissativusl.）<400>1metgluhisglyglyvalvalserlysglymetalaseraspproser151015sersertyrglnlysileileilevalalaalailealaalaglyval202530glnpheglytrpalaleuglnleuserleuleuthrprotyrvalgln354045glnleuglyvalserhisthrtrpseralapheiletrpleucysgly505560proleuserglyleuilevalglnprothrvalglytyrtyrserasp65707580argcysthrserargpheglyargargargpropheilevalalagly859095serthrphevalalathralavalpheleuileglyphealaalaasp100105110ileglyhisalavalglyaspproleuasnlysprothrlysproarg115120125alavalalailephevalvalglyphetrpvalleuaspvalalaasn130135140asnmetleuglnglyprocysargalaleuleualaaspmetsercys145150155160asnasnhislyslysmetargmetalaasnglyphepheserphephe165170175metglyvalglyasnvalleuglytyralaalaglysertyrasnlys180185190leutyrlyspheleuprophethrleuthrlysalacysaspsertyr195200205cysalaasnleulysthrcyspheleuileaspilevalpheleuleu210215220leuvalthrthrphealavalleumetvalsergluasnglnpheasp225230235240proleugluileaspgluglualathrprophepheglylysleuphe245250255glyalaleulyslysleuglulyspromettrpleuleuleuleuval260265270thralaleuasntrpileglytrpphepropheilemettyraspthr275280285asptrpmetglyleugluvaltyrglyglylysprolysglyserpro290295300glugluvallysphetyraspleuglyvalargalaglyalaleugly305310315320leumetvalasnserphevalleuglypheseralaleuglyileglu325330335proileserargileleuglyglyleuargtrptrptrpglyileval340345350asnileilephethrvalcysmetglyserthrvalvalvalthrlys355360365valalagluargtrpargservalasnglyleuargproproproleu370375380asnvalargalaglyalapheserilephealaileleuglyilepro385390395400leuservalthrpheservalprophealaleualaserilepheser405410415sergluseraspalaglyglnglyleuserleuglyileleuasnleu420425430pheilevalileproglnpheilevalseralavalserglyproleu435440445aspalaalapheglyglyglyasnleuproalaphevalmetglygly450455460ilealaserphealaseralametcysalametphevalleuproasp465470475480proproproglnseraspvalserleuthrmetglyglyglyhis485490495<210>2<211>1488<212>dna<213>黃瓜（cucumissativusl.）<400>2atggagcatggaggtgttgtgtcgaaggggatggcgtcagacccttcaagttcgtaccaa60aaaataataatagttgcagctattgcagccggagtccaatttggttgggctctacagctt120tcattgctaacaccttacgtccaacaacttggagtttcacatacatggtccgctttcata180tggctttgcggaccattatcaggacttattgtgcaacccactgtcgggtactacagtgat240cgctgcacctctaggtttggtcgtcgtcggccgttcattgttgctggatctacttttgtg300gcaactgcagttttcctcattggctttgctgcagacattgggcatgcagtgggtgatccg360cttaacaaacccacaaaaccaagagctgttgccatctttgtggttggattttgggttctt420gatgttgctaacaacatgctccaaggcccttgtagagctctgttggcagatatgtcatgt480aacaaccacaagaagatgagaatggccaatggatttttctcattcttcatgggggtaggg540aatgttttggggtacgcagctgggtcctataacaaactctacaaattccttcccttcaca600ctaaccaaagcatgtgacagttactgtgccaacctcaaaacatgcttcttgatcgacatt660gtattccttctcctcgttaccacgttcgctgtgttgatggtgagcgagaaccaatttgac720ccattggagattgacgaagaagcaacaccctttttcgggaaattgtttggagcactcaag780aagttggagaagccaatgtggcttttgttgctggtaacagccttgaactggatcggttgg840ttcccatttatcatgtacgatactgactggatgggtttggaagtgtacggaggaaagcca900aaggggagtcctgaagaagtcaagttctatgaccttggtgttcgtgctggggcccttggg960ttgatggtaaactcatttgttttgggattttcagctttgggaattgagccaataagtcgt1020attttaggaggcctcagatggtggtggggaattgttaacattatatttacagtttgcatg1080ggatccaccgtcgtggttacaaaggttgctgagcgttggaggtccgttaatggtttgcgt1140cctcctccactaaacgtcagggcaggagcattttcgatctttgcgatattgggtattcca1200ttgtcagtcacttttagtgttccatttgcgcttgcgtccatcttttcttcagaatcggat1260gcgggtcaaggcctctccttgggaattctcaacctcttcattgtcattccacagttcatc1320gtatccgcagttagtgggccattagatgctgctttcggaggaggaaacttacccgcattc1380gtaatgggtggaattgcttcttttgcaagtgcaatgtgtgcaatgttcgtcctccccgat1440ccaccacctcaatccgatgtctccttaacaatgggcggtggtcattga1488<210>3<211>121<212>dna<213>黃瓜（cucumissativusl.）<400>3atcggttggttcccatttatcatgtacgatactgactggatgggtttggaagtgtacgga60ggaaagccaaaggggagtcctgaagaagtcaagttctatgaccttggtgttcgtgctggg120g121<210>4<211>623<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4atcggttggttcccatttatcatgtacgatactgactggatgggtttggaagtgtacgga60ggaaagccaaaggggagtcctgaagaagtcaagttctatgaccttggtgttcgtgctggg120gatttaaatccccagatgaacatggcatcgtggtgattgatgaaactgctgctgtcggct180ttaacctctctttaggcattggtttcgaagcgggcaacaagccgaaagaactgtacagcg240aagaggcagtcaacggggaaactcagcaagcgcacttacaggcgattaaagagctgatag300cgcgtgacaaaaaccacccaagcgtggtgatgtggagtattgccaacgaaccggataccc360gtccgcaaggtgcacgggaatatttcgcgccactggcggaagcaacgcgtaaactcgacc420cgacgcgtccgatcacctgcgtcaatgtaatgttctgcgacgctcacaccgataccatca480gcgatctctttgatggggatccccccagcacgaacaccaaggtcatagaacttgacttct540tcaggactcccctttggctttcctccgtacacttccaaacccatccagtcagtatcgtac600atgataaatgggaaccaaccgat623當前第1頁12