本發(fā)明涉及真菌分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的檢測(cè)用引物、包含此引物的試劑盒以及借助此引物實(shí)施的蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌（valsamalimiyabeetyamada）可侵害蘋(píng)果樹(shù)的主枝、主干、果實(shí)等多個(gè)部位，造成蘋(píng)果樹(shù)腐爛病。該病在我國(guó)各主要蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重。蘋(píng)果腐爛病菌具有潛伏侵染特性，說(shuō)明病菌的分布要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于病害的流行區(qū)域，田間植株普遍帶菌。梨樹(shù)腐爛病菌主要危害梨樹(shù)的主枝和側(cè)枝，導(dǎo)致梨樹(shù)勢(shì)衰弱，果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)下降。有研究者從我國(guó)15個(gè)省市梨產(chǎn)區(qū)采集腐爛病樣品，通過(guò)79份梨腐爛病菌純化分離株的rdna-its核苷酸序列分析，證明我國(guó)梨樹(shù)腐爛病病原菌均為valsamalivar.pyri，為蘋(píng)果黑腐皮殼梨變種。有效而精確地檢測(cè)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌，對(duì)深入研究該病菌的致病機(jī)制及進(jìn)行科學(xué)防治均有重要意義，而合適的蘋(píng)果腐爛病菌的檢測(cè)體系也有可能特異性地檢測(cè)梨樹(shù)腐爛病菌。

目前，對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的檢測(cè)通常有普通pcr（聚合酶鏈反應(yīng)）和巢氏pcr兩種方法，普通pcr是通過(guò)特異引物對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的dna特異片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后使擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)條帶的熒光強(qiáng)度來(lái)定性判斷病菌的有無(wú)和多少。該方法的可靠性對(duì)引物的性能依賴(lài)較大，引物選擇不好，易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性，無(wú)法得出正確的判斷。巢式pcr是一種變異pcr，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）引物擴(kuò)增完整的片段，第一對(duì)引物擴(kuò)增片段和普通pcr相似，第二對(duì)引物稱(chēng)為巢式引物，結(jié)合在第一次pcr產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次pcr擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式pcr的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低，這就極大提高了該方法的特異性。但是該方法操作復(fù)雜，不易掌握。同時(shí)，上述兩種方法還都存在只能通過(guò)熒光強(qiáng)度定性判斷病菌數(shù)量，無(wú)法進(jìn)行較為精確的定量，操作時(shí)間普遍較長(zhǎng)，無(wú)法徹底避免致癌的熒光染色劑對(duì)人體的侵害等弊端。

實(shí)時(shí)熒光定量（real-timefluorescencequantitative）pcr是近幾年來(lái)新發(fā)展的一種pcr技術(shù)，它是一種在pcr反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr的進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知的模板進(jìn)行定量分析的方法。如發(fā)明專(zhuān)利cn102312015a公開(kāi)了一種檢測(cè)甘蔗中寄生白條病菌的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法，首先提取白條病菌的dna，然后利用特異引物擴(kuò)增特定的基因片段，再通過(guò)載體進(jìn)行克隆，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)吸光度換算成拷貝數(shù)濃度，進(jìn)行梯度稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后以待測(cè)樣品的dna進(jìn)行同樣的實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增，利用得到的cq值結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量。將實(shí)時(shí)熒光定量pcr用于不同病菌的定量檢測(cè)，需要解決與各病菌dna適合的pcr引物及反應(yīng)條件等問(wèn)題，雖然有許多經(jīng)驗(yàn)規(guī)則指導(dǎo)著引物設(shè)計(jì)，但這并非一個(gè)“照方抓藥”的過(guò)程，而是充滿(mǎn)了不確定性，生物反應(yīng)的復(fù)雜性很容易使設(shè)計(jì)出的引物最終無(wú)法實(shí)現(xiàn)能達(dá)到檢測(cè)目的的pcr擴(kuò)增。

鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的檢測(cè)用引物，該引物具有良好的特異性，能夠?qū)μO(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌基因組dna進(jìn)行特異性擴(kuò)增，無(wú)引物二聚體產(chǎn)生和非特異性擴(kuò)增，能夠用來(lái)對(duì)蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌進(jìn)行效果良好的實(shí)時(shí)熒光pcr定量檢測(cè)。

通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的：

一種蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的檢測(cè)用引物，其特征在于具有如下核苷酸序列：

ve-f：5’-aatgaagtcagcatcgttt-3’，正向引物；

ve-r：5’-gcttatcaagggcttatct-3’，反向引物。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種含有上述引物的用于檢測(cè)蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的試劑盒。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的定量檢測(cè)方法，該方法借助上述引物實(shí)現(xiàn)了對(duì)蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的定量檢測(cè)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，避免熒光染色劑對(duì)人體的侵害。

通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的：

一種蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的定量檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟：

（a）提取蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的基因組dna；

（b）以蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的基因組dna為模板，利用上述引物ve-f和ve-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊膠糖凝膠電泳之后切膠回收，與質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行增菌培養(yǎng)，再用質(zhì)粒小提試劑盒提取后測(cè)序鑒定，經(jīng)鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。本步驟中所用的瓊脂糖凝膠電泳中瓊脂糖凝膠的質(zhì)量百分比濃度通常為1%。

（c）測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，并計(jì)算陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度，然后進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)韵♂尯蟮母麝?yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分別利用所述引物ve-f和ve-r進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，獲得相應(yīng)的cq值，以各拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)值和對(duì)應(yīng)的cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以cq值為縱坐標(biāo)。本步驟中所用的陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的od260/od280比值通常在1.8~2.0之間，此比值范圍內(nèi)的在1.8~2.0之間的陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品純度高，制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)能夠更加準(zhǔn)確的反應(yīng)cq值與起始模板拷貝數(shù)濃度的關(guān)系。

（d）提取待測(cè)樣品的dna，并以待測(cè)樣品的dna為模板，利用所述引物ve-f/ve-r進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，獲得cq值，并將此cq值與步驟（c）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比對(duì)得到對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)值，此拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)值即可定量表示待測(cè)樣品中蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的數(shù)目。

上述實(shí)時(shí)熒光定量pcr采用rochelihgtcycler96實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀進(jìn)行。

優(yōu)選的，所述步驟（b）中，所述的質(zhì)粒載體為puc19質(zhì)粒載體，所用的感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌trans1-t1。

優(yōu)選的，所述步驟（c）中，所述陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度范圍設(shè)置在1.0×10⁷copies/μl~1.0×10⁰copies/μl之間，梯度稀釋的稀釋倍數(shù)為10倍，10倍稀釋梯度的陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度和其進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)的cq值的散點(diǎn)坐標(biāo)均勻，更易獲得高相關(guān)系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；而且1.0×10⁷copies/μl-1.0×10⁰copies/μl的檢測(cè)范圍大，提高了供試材料病毒檢測(cè)的廣泛性。

優(yōu)選的，在所述步驟（c）（d）中，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：faststartessentialdnagreenmaster10μl；引物ve-f和ve-r各0.5μl；模板1.0μl；ddh2o補(bǔ)齊至20μl。

優(yōu)選的，在所述步驟（c）（d）中，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性300s；95℃變性12s；58℃退火12s；72℃延伸14s；共40個(gè)循環(huán)。該擴(kuò)增程序下，擴(kuò)增特異性好。

上述步驟（a）（d）中，可以利用ctab法提取dna：取表面消毒后的樣品0.15g置于2ml離心管中，在液氮中研磨至粉末狀后加入700μl提取液，65℃恒溫水浴1h后再加入700μl酚:氯仿:異戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:異戊醇的重量比為25:24:1，輕顛混勻后12000rpm離心15min，取400μl上清液加入新1.5ml離心管中，再加入重量比為24:1的氯仿:異戊醇混合液和40μlctab-nacl，輕顛混勻后12000rpm離心10min，取300μl上清液加入另一個(gè)1.5ml離心管中，再加等量的冰凍異戊醇，輕顛混勻后12000rpm離心10min即得dna沉淀，倒去上清，70%酒精洗滌2遍后，用濾紙條吸干殘余酒精，晾干，加80μlddh2o，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明中的引物ve-f和ve-r能夠針對(duì)蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌基因組dna的ef-1α延伸因子基因序列進(jìn)行特異性pcr擴(kuò)增，且無(wú)引物二聚體產(chǎn)生和非特異性擴(kuò)增，引物特異性良好。借助上述引物，建立了針對(duì)供試材料中的腐爛病菌的定量檢測(cè)方法，并且檢測(cè)結(jié)果可直接通過(guò)電腦軟件讀出，不需要凝膠電泳以及成像檢測(cè)等操作，避免了環(huán)境污染以及eb對(duì)操作人員造成的身體危害。另外，該檢測(cè)方法整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需1小時(shí)左右，具有節(jié)約時(shí)間以及靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，與常規(guī)pcr技術(shù)對(duì)比，其靈敏度是巢氏pcr檢測(cè)技術(shù)的378倍。

附圖說(shuō)明

圖1為引物ve-f和ve-r特異性擴(kuò)增的電泳圖；

其中，m為marker（dl2000）；1-6泳道的模板分別是蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌、蘋(píng)果輪紋病菌、鏈格孢、木霉、層出鐮刀菌、青霉；7泳道為ddh2o空白對(duì)照。

圖2為本發(fā)明引物對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增溶解曲線(xiàn)圖；

圖3為本發(fā)明方法對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增曲線(xiàn)圖；

圖4為與圖3對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。

所用到的主要材料和儀器來(lái)源如下；

faststartessentialdnagreenmaster（2xconc.）、八聯(lián)管購(gòu)自roche公司；easydilution、dna凝膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；

lightcycler96實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀為roche公司產(chǎn)品；紫外分光光度儀為eppendorf公司產(chǎn)品；pcr儀為abi公司產(chǎn)品。

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌41由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害流行與綜合防治實(shí)驗(yàn)室提供。

實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)與篩選

通過(guò)對(duì)比蘋(píng)果腐爛病菌基因組dnaits區(qū)、β-微管蛋白基因、ef-1α延伸因子基因序列，設(shè)計(jì)13對(duì)引物，交由上海生工生物有限公司合成。通過(guò)特異性篩選，得到特異性引物對(duì)ve-f和ve-r，該引物對(duì)的特異性擴(kuò)增效果如圖1所示。由圖可見(jiàn)，引物ve-f和ve-r對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌能夠擴(kuò)增出清晰且單一的條帶，產(chǎn)物長(zhǎng)度125bp，經(jīng)測(cè)序比對(duì)，其序列與蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌基因序列高度一致。對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌、鏈格孢、木霉、層出鐮刀菌、青霉均未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增條帶。通過(guò)對(duì)引物ve-f和ve-r進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr復(fù)篩，得到對(duì)不同濃度的蘋(píng)果腐爛病菌基因組dna的擴(kuò)增溶解曲線(xiàn)，如圖2所示，該曲線(xiàn)波峰高低與模板濃度呈正相關(guān)，且只有一個(gè)溶解峰，證明無(wú)引物二聚體產(chǎn)生和非特異性擴(kuò)增，引物特異性良好。該實(shí)驗(yàn)得出引物ve-f和ve-r的擴(kuò)增效率為99.5%。引物ve-f和ve-r的核苷酸序列如表1所示。

表1引物序列

實(shí)施例2蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌41基因組dna提取

用刀片輕輕刮掉pda上剛剛長(zhǎng)滿(mǎn)平皿的蘋(píng)果腐爛病菌41的菌絲，經(jīng)過(guò)液氮冷凍研磨，采用ctab法提取其dna：取表面消毒后的樣品0.15g置于2ml離心管中，在液氮中研磨至粉末狀后加入700μl提取液，65℃恒溫水浴1h后再加入700μl酚:氯仿:異戊醇混合液，混合液中酚:氯仿:異戊醇的重量比為25:24:1，輕顛混勻后12000rpm離心15min，取400μl上清液加入新1.5ml離心管中，再加入重量比為24:1的氯仿:異戊醇混合液和40μlctab-nacl，輕顛混勻后12000rpm離心10min，取300μl上清液加入另一個(gè)1.5ml離心管中，再加等量的冰凍異戊醇，輕顛混勻后12000rpm離心10min即得dna沉淀，倒去上清，70%酒精洗滌2遍后，用濾紙條吸干殘余酒精，晾干，加80μlddh2o，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例3陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的獲取

利用引物ve-f和ve-r對(duì)菌株41的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)質(zhì)量百分比濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳之后，采用dna凝膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段特異性條帶進(jìn)行切膠回收，純化后連接至puc19載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌trans1-t1感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒提取后測(cè)序鑒定。經(jīng)過(guò)鑒定正確的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

用紫外分光光度儀測(cè)定重組質(zhì)粒的od260/od280和其濃度，od260/od280值在1.8~2.0的質(zhì)粒用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量將其質(zhì)量濃度換算為拷貝數(shù)濃度：

copies/μl=(ng/μl×10^-9)×(6.02×l0²³)/(dnalength×660)

再用easydilution將其依次進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫?.0×10⁷copies/μl-1.0×10⁰copies/μl共8個(gè)濃度梯度，并以此為模板建立20μl擴(kuò)增體系：

faststartessentialdnagreenmaster（2xconc.）10μl

引物ve-f/ve-r（20μm）各0.5μl

模板（8個(gè)梯度）1.0μl

ddh2o8μl

在lightcycler96實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀上按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性300s；95℃變性12s；58.0℃退火12s；72℃延伸14s。共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖3和圖4所示。陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)值為x軸，反應(yīng)的cq值為y軸，兩者呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r²=0.9987，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=-3.62x+36.11。

實(shí)施例5蘋(píng)果樹(shù)待測(cè)樣品中腐爛病菌的檢測(cè)

在河北蠡縣蘋(píng)果苗圃采集一年生枝條，經(jīng)過(guò)表面消毒后，將韌皮部剝離，采用ctab法分別提取供試樣品dna，利用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果請(qǐng)參考表2。陰性對(duì)照（蘋(píng)果輪紋病菌）和空白對(duì)照（ddh2o）的結(jié)果均為陰性，蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌為陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照cq值為18.61。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，待測(cè)的十個(gè)樣品中有七個(gè)樣品帶菌，且給出了相應(yīng)的模板帶菌量（即以陽(yáng)性重組質(zhì)粒模板數(shù)衡量）。其余三個(gè)樣品未發(fā)現(xiàn)攜帶蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌。

實(shí)施例6梨樹(shù)待測(cè)樣品中腐爛病菌的檢測(cè)

通過(guò)組織分離方法從采自新疆庫(kù)爾勒的香梨腐爛病材料中分離獲得香梨腐爛病菌，通過(guò)其rdna-its序列比對(duì)，確定其為蘋(píng)果黑腐皮殼菌梨變種（valsamalivar.pyri）。材料經(jīng)過(guò)表明消毒后采用ctab法提取dna，利用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例的方法進(jìn)行檢測(cè)，可特異性的檢測(cè)出梨腐爛病菌，其平均cq值為26.58，平均模板病菌含量為5.01×10³copies/μl。

本發(fā)明基于ef-1α基因序列設(shè)計(jì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌特異性引物，成功建立了實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)體系。本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)體系可精確定量到26.4fg/μl濃度的dna，比現(xiàn)有的巢氏pcr體系10pg的檢測(cè)精度高378倍。

上述實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明構(gòu)思和實(shí)現(xiàn)的一個(gè)說(shuō)明，并非對(duì)其進(jìn)行限制，在本發(fā)明構(gòu)思下，未經(jīng)實(shí)質(zhì)變換的技術(shù)方案仍然在保護(hù)范圍內(nèi)。

表2一年生蘋(píng)果枝條韌皮部檢測(cè)結(jié)果

其中，“+”為陽(yáng)性，“-”為陰性。

序列表

<110>河北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>蘋(píng)果樹(shù)/梨樹(shù)腐爛病菌的檢測(cè)用引物、試劑盒及定量檢測(cè)方法

<160>2

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>1

aatgaagtcagcatcgttt19

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>2

gcttatcaagggcttatct19