本發(fā)明屬植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及水稻基因osnf-yc4及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高等植物在發(fā)育過程中會受到高溫、干早等非生物脅迫的影響，阻礙植物生長，甚至?xí)?dǎo)致死亡，制約著農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟的發(fā)展。水稻(oryza.satival.)是一種重要的經(jīng)濟及糧食作物，對水稻生長發(fā)育和產(chǎn)量造成影響的諸多因素中，高溫干旱和鹽堿地危害是最主要的逆境因素，研究水稻逆境應(yīng)答機制對其產(chǎn)量和品質(zhì)的提高具有重要意義。

隨著生物科技的發(fā)展，人們對植物逆境脅迫機理的研究也不斷深入，大量脅迫相關(guān)基因被鑒定和研究。但由于水稻自身遺傳基礎(chǔ)與脅迫下生理生化變化的復(fù)雜性，已鑒定的功能基因較為有限，相關(guān)的表達(dá)調(diào)控分子機制仍需進(jìn)一步探討。

在真菌和動物中，nf-y的每個亞基是由單基因負(fù)責(zé)編碼，植物nf-y則有多個同源基因，它們可形成不同組合參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控來發(fā)揮具體的生物功能，其調(diào)控模式可能更為復(fù)雜；現(xiàn)階段關(guān)于nf-y在植物脅迫響應(yīng)中作用的報道較少。利用基因工程手段來研究和改善植物抗逆性已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的一項重要內(nèi)容。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有技術(shù)中水稻的基因表達(dá)調(diào)控分子機制研究存在的缺陷，提供一種可以顯著提高水稻千粒重并提升其抗逆性的水稻基因osnf-yc4。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了水稻基因osnf-yc4，其開放閱讀框的dna序列如seqidno:1所示。

擴增本發(fā)明水稻基因osnf-yc4的正向引物序列如seqidno:3所示，反向引物序列如seqidno:4所示。

檢測水稻基因osnf-yc4表達(dá)的正向引物序列如seqidno:5所示，反向引物序列如seqidno:6所示。

本發(fā)明水稻基因osnf-yc4編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seqidno:2所示。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種重組過表達(dá)載體，其包含了水稻基因osnf-yc4。

構(gòu)建上述重組過表達(dá)載體時，可以采用pubi-3ha載體作為受體載體，構(gòu)建方式是：將水稻基因osnf-yc4的開放閱讀框酶切連接插入到受體載體，得到重組過表達(dá)載體pubi-osnf-yc4-orf-3ha。

使用osnf-yc4構(gòu)建重組過表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對表達(dá)載體進(jìn)行加工，如抗生素標(biāo)記物(潮霉素標(biāo)記物等)的抗性基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種生物工程菌，其是將含有所述重組過表達(dá)載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌eha105而得。

本發(fā)明水稻基因osnf-yc4可應(yīng)用于培育抗逆植物品種和調(diào)節(jié)植物生長中。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明水稻基因osnf-yc4及其應(yīng)用具有如下優(yōu)點：

本發(fā)明從水稻基因組中克隆得到一個水稻基因osnf-yc4，并驗證了該基因的功能。利用植物表達(dá)載體，過量表達(dá)本發(fā)明osnf-yc4基因其植株增高、粒寬顯著增寬，粒長變長，千粒重顯著增加，同時增強了其抗逆性，說明osnf-yc4基因在植物生長和正調(diào)控抗逆性方面具有重要作用。因此，本發(fā)明的osnf-yc4對培育抗逆性水稻，減少高溫干旱對水稻產(chǎn)量的影響具有重要意義，對研究水稻生長和抗逆性機理方面具有重要的作用，在作物育種方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施方式，對本發(fā)明水稻基因osnf-yc4及其應(yīng)用以及有益效果進(jìn)行詳細(xì)說明。

圖1為含有水稻基因osnf-yc4的植物過量表達(dá)載體pubi-osnf-yc4-orf-3ha的部分結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為t1轉(zhuǎn)基因水稻的pcr鑒定，其中，m為dna分子量dl2000(takara公司生產(chǎn))；編號8#，17#，19#為osnf-yc4過表達(dá)所獲得轉(zhuǎn)基因株系。

圖3為轉(zhuǎn)基因水稻qrt-pcr鑒定圖。

圖4轉(zhuǎn)基因水稻在高溫干旱下表型，其中，實驗處理為40℃高溫，10％peg模擬干旱環(huán)境；經(jīng)過兩周的處理，過表達(dá)水稻株系表現(xiàn)出抗高溫干旱的表型。

圖5為轉(zhuǎn)osnf-yc4水稻株系表型實驗，其中，wt：野生型(zh11生態(tài)型)；osnf-yc4-oe-8,osnf-yc4-oe-17為過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；圖4左上：水稻籽粒寬度比較；右上：水稻籽粒長度比較；左下：水稻籽粒寬度顯著變寬；右下：水稻籽粒長度變長但沒達(dá)到顯著水平。為轉(zhuǎn)基因水稻表型統(tǒng)計實驗結(jié)果，其中，轉(zhuǎn)基因稻和野生型對比，千粒重顯著增加，根長變長，莖長增高(*,p≤0.05；**,p≤0.01)。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益技術(shù)效果更加清晰，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，本說明書中描述的實施例僅僅是為了解釋本發(fā)明，并非為了限定本發(fā)明，實施例的參數(shù)、比例等可因地制宜做出選擇而對結(jié)果并無實質(zhì)性影響。

在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。

實施例1水稻osnf-yc4及其編碼基因的cdna克隆與鑒定

實驗材料為由中國科學(xué)院華南植物園植物激素調(diào)控組研究室提供，材料種植于溫室，常規(guī)田間管理。

利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分析，設(shè)計引物，進(jìn)行水稻基因osnf-yc4的克隆。具體方法如下：

osnf-yc4基因orf正向引物p1如seqidno.3所示。

osnf-yc4基因orf反向引物p2如seqidno.4所示。

取水稻材料兩周嫩葉，置于液氮中研碎，rna提取依據(jù)tiangen總rna提取試劑盒rnaplantextractionkitdp417進(jìn)行。cdna第一鏈合成依據(jù)takara試劑公司cdna第一鏈合成試劑盒takaraprimescript^tm1ststrandcdnasynthesiskitd6110a，具體詳見操作說明。以得到的cdna片段為模板，用上述引物對進(jìn)行pcr擴增反應(yīng)。20μlpcr反應(yīng)體系為：0.8μlcdna第一鏈(0.05μg)、1.6μl引物(seqidno.3和seqidno.4，5μm)、2μl10×pcr緩沖液、1.6μlmg²⁺、1.6μldntp和0.5uextaqdna聚合激酶，用超純水補足20μl。反應(yīng)在ecso型pcr儀上進(jìn)行，其程序為94℃變性5min；再94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，共30個循環(huán)；然后72℃延伸10min；16℃保存。pcr產(chǎn)物回收后經(jīng)連接pmd19-t載體(takara)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10、搖菌、測序、序列分析結(jié)果表明pcr產(chǎn)物具有seqidno.1所示的orf，命名為osnf-yc4，其編碼的氨基酸序列如seqidno.2所示。

實施例2

利用takara公司的nde1和ecr1內(nèi)切酶和takara公司t4-dna連接酶將實施例1克隆基因osnf-yc4正向插入到表達(dá)載體pubi載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10，轉(zhuǎn)化液涂布于含50mg/l卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。經(jīng)測序驗證后，提取質(zhì)粒，得到植物過量pubi-osnf-yc4表達(dá)載體(圖1)。用凍融法將pubi-osnf-yc4轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株eha105(biovectorco.,ltd)中。通過農(nóng)桿菌eha105介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)化野生型水稻zh11。提取轉(zhuǎn)基因水稻的基因組dna作為模板，以野生型水稻基因組和水作為陰性對照，pubi-osnf-yc4質(zhì)粒作為陽性對照，用目的基因內(nèi)部引物進(jìn)行pcr初步鑒定陽性轉(zhuǎn)基因水稻，方法如下：

設(shè)計目的基因內(nèi)部引物p3：seqidno.5和p4：seqidno.6進(jìn)行pcr擴增，10μlpcr反應(yīng)體系為：5μlmix，上、下游引物(5pmol)各1μl，模板2μl(大約含0.03μg)，加ddh2o1μl。其程序為95℃變性4min；再94℃40sec，56℃1min，72℃1min，共30個循環(huán)；然后72℃延伸10min；4℃保存。pcr鑒定結(jié)果見圖2。

用目的基因內(nèi)部上游引物和下游引物進(jìn)行rt-pcr對陽性轉(zhuǎn)基因水稻二次鑒定，方法如下：

用目的基因內(nèi)部上游引物p3：seqidno.5和下游引物p4：seqidno.6，以轉(zhuǎn)基因水稻rna為模板進(jìn)行rt-pcr擴增，10μlpcr反應(yīng)體系為：5μlmix，引物(5pmol)各1μl，模板2μl(大約含0.03μg)，加ddh2o1μl。其程序為95℃變性5min；再94℃50sec，56℃90sec，72℃1min，共30個循環(huán)；然后72℃延伸10min；4℃保存。rt-pcr鑒定結(jié)果見圖3。

實施例3osnf-yc4基因的功能驗證

將t1代轉(zhuǎn)基因水稻種子消毒后播種于組培瓶里，培養(yǎng)溫度為28℃，晝夜時間12/12h；待水稻生長3周，40℃高溫和10％peg模擬干旱處理水稻野生型zh11和過表達(dá)株系osnf-yc4-oe-8、osnf-yc4-oe-17，10d后可明顯觀察過表達(dá)水稻苗葉片鮮綠不變，野生型苗葉片枯死，如圖4。

進(jìn)一步對生長于溫室的過表達(dá)水稻株系進(jìn)行籽粒統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，相比于野生型zh11，過表達(dá)株系osnf-yc4-oe-8、osnf-yc4-oe-17的水稻籽粒寬度顯著變寬，長度增長，除此之外，兩個過表達(dá)株系的籽粒千粒重相比于野生型zh11均達(dá)到極顯著水平，莖長伸長，osnf-yc4-oe-8株系的莖長顯著長于野生型，但是根長沒有明顯變化，如圖5。

結(jié)果可見：

克隆osnf-yc4基因并構(gòu)建osnf-yc4植物過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因水稻，通過高溫干旱實驗評估其抗逆性。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)osnf-yc4表現(xiàn)出抗高溫干旱的表型。并且轉(zhuǎn)基因水稻株系的籽粒變大，千粒重顯著增加，說明水稻osnf-yc4調(diào)控水稻籽粒發(fā)育，對于水稻高產(chǎn)育種提供一定的理論指導(dǎo)。

根據(jù)上述說明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對上述實施方式進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兏托薷?。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式，對本發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術(shù)語，但這些術(shù)語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。

序列表

<110>中國科學(xué)院華南植物園

<120>一個水稻基因osnf-yc4及其應(yīng)用

<160>6

<210>1

<211>753

<212>dna

<213>禾本科水稻屬（oryza.satival.）

<220>

<223>osnf-yc4基因開放閱讀框（orf）

<400>1

4145atggagccatcatcacaacctcagccggcaattggtgttgttgctggtggatcaca

4201agtgtaccctgcataccggcctgcagcaacagtgcctacagctcctgctgtcattcctgc

4261cggttcacagccagcaccgtcgttccctgccaaccctgatcaactgagtgctcagcacca

4321gctcgtctatcagcaagcccagcaatttcaccagcagcttcagcagcagcaacagcgtca

4381actccagcagttttgggctgaacgtctggtcgatattgaacaaactactgacttcaagaa

4441ccacagcttgccacttgctaggataaagaagatcatgaaggcagatgaggacgttcgcat

4501gatctccgcagaggctcctgtgatctttgcgaaagcatgtgagatattcatactggagct

4561gaccctgagatcatggatgcacacggaggagaacaagcgccgtaccttgcagaagaatga

4621catagcagctgccatcaccaggacggatatgtacgatttcttggtagatatagttcccag

4681ggatgacttgaaggaggagggagttgggctccctagggctggattgccgcccttgggtgt

4741ccctgctgactcatatccgtatggctactatgtgccacagcagcaggtcccaggtgcagg

4801aatagcgtatggtggtcagcaaggtcatccggggtatctgtggcaggatcctcaggaaca

4861gcaggaagagcctcctgcagagcagcaaagtgattaa

<210>2

<211>174

<212>prt

<213>禾本科水稻屬（oryza.satival.)

<220>

<223>osnf-yc4氨基酸序列

<400>2

mepssqpqpaigvvaggsqvypayrpaatvptapavipagsqpapsfpanpdqlsaqhqlvyqqaqqfhqqlqqqqqrqlqqfwaerlvdieqttdfknhslplarikkimkadedvrmisaeapvifakaceifileltlrswmhteenkrrtlqkndiaaaitrtdmydflvdivprddlkeegvglpraglpplgvpadsypygyyvpqqqvpgagiayggqqghpgylwqdpqeqqeeppaeqqsd

<210>3<211>24<212>dna<213>人工合成<220><223>osnf-yc4基因orf正向引物p1

<400>3

atgatggagccatcatcacaacc

<210>4<211>17<212>dna<213>人工合成<220><223>osnf-yc4基因orf反向引物p2

<400>4

tcactttgctgctctgc17

<210>5<211>20<212>dna<213>人工合成<220><223>轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)鑒定用目的基因內(nèi)部引物之上游引物p3

<400>5

gccctgccttcatacgctat20

<210>6<211>18<212>dna<213>人工合成<220><223>轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)鑒定用目的基因內(nèi)部引物之下游引物p4

<400>6

gataatcatcgcaagacc18