本發(fā)明屬于金屬離子檢測的熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及的是一種基于半花菁的銅離子比率熒光探針及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銅離子(cu²⁺)是人體中第三豐富的元素，并且其在生物體的各種基本生理過程中具有重要的作用，如基因表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。但是細胞中cu²⁺的濃度變化會導(dǎo)致各種疾病，包括阿爾茨海默(alzheimes)病、緬克斯(menkes)綜合癥、肝豆?fàn)詈俗冃?wilsons)病，甚至癌癥等。此外，cu²⁺被廣泛的運用到工業(yè)和農(nóng)業(yè)中，所以它也是一種嚴重的環(huán)境污染物。因此，尋找一種簡便、快捷檢測方法對cu²⁺進行分析檢測具有重要意義?，F(xiàn)有測定cu²⁺的方法主要是原子吸收光譜法和分光光度法，但前者需要復(fù)雜的儀器及熟練的技術(shù)人員及高昂的檢測費用，后者需要繁瑣的操作，所以都不是理想的識別和檢測cu²⁺濃度的方法。熒光探針具有靈敏度高、選擇性好、成本低、樣品用量少、設(shè)備簡單等優(yōu)點，并已成為檢測重金屬離子的有效手段。

目前關(guān)于cu²⁺熒光探針的研究中，大多是基于單波長熒光發(fā)射強度改變的熒光探針，比如熒光淬滅或熒光增強。這些基于單波長發(fā)射的熒光探針易受一些因素的影響，比如：光漂白、探針分子的濃度、周圍的微環(huán)境和光照射下的穩(wěn)定性等。而比率熒光探針能夠克服上述因素的影響。比率熒光探針是通過記錄兩個熒光發(fā)射峰的比率來實現(xiàn)對金屬離子的檢測的，它有利于增加響應(yīng)范圍，減少環(huán)境因素的影響。雖然文獻已經(jīng)報道了一些比率型的cu²⁺熒光探針，但這些比率型熒光探針大多都是在純有機溶劑或含有有機溶劑的水溶液中對cu²⁺進行檢測。實際上能夠在純水溶液中表現(xiàn)出識別性能的熒光探針才具有更廣闊的使用價值。因此，迫切需要開發(fā)研究在純水溶液中常溫快速高效地檢測cu²⁺的新型比率熒光探針。

基于吡啶鹽的半花菁4-(4-羥基苯乙烯基)-1-甲基吡啶碘鹽不僅具有良好水溶性，而且具有典型的“推-拉”結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出優(yōu)良的光學(xué)性能。當(dāng)羥基被吸電子基團2-吡啶甲酰基保護后，使其“推”電子的能力降低，并伴隨吸收光譜和熒光光譜的變化，同時吡啶甲酸酯基團很容易被cu²⁺水解。因此，本發(fā)明的基于半花菁的銅離子比率熒光探針是以4-(4-羥基苯乙烯基)-1-甲基吡啶碘鹽作為熒光團，以吡啶甲酸酯作為識別單元的比率型熒光探針。經(jīng)檢索沒有發(fā)現(xiàn)與本申請相近似的文獻及專利申請。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過分子設(shè)計，合成出一種在純水溶液中檢測銅離子并具有靈敏度高、選擇性好和響應(yīng)時間短的基于半花菁的銅離子比率熒光探針。

本發(fā)明還提供了上述基于半花菁的銅離子比率熒光探針的制備方法。

本發(fā)明還提供了上述基于半花菁的銅離子比率熒光探針的應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種基于半花菁的銅離子比率熒光探針，它的分子式為c20h17in2o2，結(jié)構(gòu)式如下：

一種基于半花菁的銅離子比率熒光探針的制備方法，包括步驟如下：

(1)4-甲基吡啶與碘甲烷反應(yīng)得到1,4-二甲基吡啶碘鹽，即化合物1，其結(jié)構(gòu)式如下：

(2)將步驟(1)得到化合物1與4-羥基苯甲醛反應(yīng)得到4-(4-羥基苯乙烯基)-1-甲基吡啶碘鹽，即化合物2，其結(jié)構(gòu)式如下：

(3)將步驟(2)得到化合物2與2-吡啶甲酸反應(yīng)得到銅離子比率熒光探針4-(4-吡啶甲酸酯苯乙烯基)-1-甲基吡啶碘鹽，即化合物3。

而且，所述步驟(1)中化合物1獲得的具體方法為：將4-甲基吡啶和碘甲烷溶于乙腈中，在氬氣保護下加熱回流反應(yīng)10小時，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，有固體析出，過濾并用乙酸乙酯洗滌，收集固體即為化合物1。

而且，所述4-甲基吡啶與碘甲烷的比例為1:1.25。

而且，所述步驟(2)中化合物2獲得的具體方法為：將化合物1，4-羥基苯甲醛和哌啶溶于無水乙醇中，在氬氣保護下加熱回流反應(yīng)10小時，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，有固體析出，過濾并用無水乙醇洗滌，收集固體即為化合物2。

而且，所述化合物1與4-羥基苯甲醛和哌啶的比例為1:1.5:0.5。

而且，所述步驟(3)中化合物3獲得的具體方法為：將化合物2，2-吡啶甲酸，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和4-二甲氨基吡啶溶于無水二氯甲烷中，在氬氣保護下室溫反應(yīng)2小時，反應(yīng)完全后，有固體析出，過濾并用無水二氯甲烷洗滌，收集固體即為銅離子比率熒光探針，即化合物3。

而且，所述化合物1與2-吡啶甲酸，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和4-二甲氨基吡啶的比例為1:1.5:1.5:0.6。

一種基于半花菁的銅離子比率熒光探針的應(yīng)用，該應(yīng)用是在純水溶液中將熒光探針與銅離子進行反應(yīng)，利用兩個不同發(fā)射波長處熒光強度的比率(f503nm/f448nm)變化來檢測銅離子的存在與否。

而且，在未加入銅離子前，所述反應(yīng)溶液的最大熒光發(fā)射波長位于448nm處，當(dāng)加入銅離子后，所述反應(yīng)溶液的448nm處的熒光減弱，最大熒光發(fā)射波長紅移至503nm處，所述檢測銅離子的檢出濃度下限為1.1nm。

本發(fā)明的優(yōu)點及其效果

1、本發(fā)明探針的合成只需要三步就可以完成，且后處理過程簡單。

2、本發(fā)明熒光探針分子在銅離子與其他陽離子共存體系中，表現(xiàn)出較高的選擇性和靈敏度。

附圖說明

圖1為實施案例1中化合物2的¹hnmr圖譜；

圖2為實施案例1中化合物2的¹³cnmr圖譜；

圖3為實施案例1中化合物2的esi-ms圖譜；

圖4為實施案例1中化合物3的¹hnmr圖譜；

圖5為實施案例1中化合物3的¹³cnmr圖譜；

圖6為實施案例1中化合物3的esi-ms圖譜；

圖7中(a)為ph值對化合物2(503nm)和3(448nm)熒光強度的影響示意圖，(b)為ph值對化合物2和3的熒光強度比率(f503nm/f448nm)的影響示意圖；

圖8為ph值對化合物3與cu²⁺反應(yīng)前后的熒光強度比率(f503nm/f448nm)的影響示意圖；

圖9中(a)為最佳測試條件下化合物3與cu²⁺反應(yīng)的吸收光譜變化示意圖，(b)為化合物3與cu²⁺反應(yīng)時吸光度在342nm和374nm處隨時間的變化示意圖；

圖10中(a)為最佳測試條件下化合物3與cu²⁺反應(yīng)的熒光光譜變化示意圖，(b)為化合物3與cu²⁺反應(yīng)的熒光強度比率(f503nm/f448nm)隨時間的變化示意圖；

圖11中(a)為化合物3與不同濃度cu²⁺反應(yīng)的熒光強度比率(f503nm/f448nm)隨時間的變化示意圖，(b)為化合物3的熒光強度比率(f503nm/f448nm)隨cu²⁺濃度的變化示意圖；

圖12為化合物3與不同金屬離子反應(yīng)前后的熒光強度比率(f503nm/f448nm)的變化示意圖，(灰色柱代表探針只經(jīng)標(biāo)注的金屬離子處理，黑色柱代表探針經(jīng)標(biāo)注的金屬離子處理后，再添加cu²⁺；1.無金屬離子，2.na⁺，3.k⁺，4.ca²⁺，5.mg²⁺，6.ag⁺，7.zn²⁺，8.cd²⁺，9.hg²⁺，10.ba²⁺，11.co²⁺，12.ni²⁺，13.mn²⁺，14.pb²⁺，15.al³⁺，16.fe³⁺，17.sn⁴⁺，18.cu²⁺)；

圖13為銅離子比率熒光探針化合物3的合成路線及其對cu²⁺檢測的反應(yīng)機理示意圖。

具體實施方式

以下對本發(fā)明實施例做進一步詳述：需要強調(diào)的是，本發(fā)明所述的實施例是說明性的，而不是限定性的，因此本發(fā)明并不限于具體實施方式中所述的實施例，凡是由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案得出的其它實施方式，同樣屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例

(一)目標(biāo)化合物銅離子熒光探針的制備

(1)化合物1的合成

將4-甲基吡啶(1.96ml，20mmol)和碘甲烷(1.56ml，25mmol)溶于乙腈(20ml)中，在氬氣保護下加熱回流反應(yīng)10小時，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，有固體析出，過濾并用乙酸乙酯洗滌，收集固體，產(chǎn)率為88％。

(2)化合物2的合成

將化合物1(2.35g,10mmol)，4-羥基苯甲醛(1.83g,15mmol)和哌啶(0.5ml,5mmol)溶于無水乙醇(30ml)中，在氬氣保護下加熱回流反應(yīng)10小時，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，有固體析出，過濾并用無水乙醇洗滌，收集固體，產(chǎn)率為80％。

化合物2的¹hnmr圖譜如圖1所示，¹hnmr(400mhz,d6-dmso,ppm)δ8.66(d,j＝6.8hz,2h),8.02(d,j＝6.8hz,2h),7.89(d,j＝16.0hz,1h),7.53(d,j＝8.8hz,2h),7.10(d,j＝16.0hz,1h),6.71(d,j＝8.4hz,2h),4.16(s,3h)。

化合物2的¹³cnmr圖譜如圖2所示，¹³cnmr(100mhz,d6-dmso,ppm)δ165.95,153.31,144.16,142.18,130.83,123.01,121.93,117.38,116.67,46.30。

化合物2的esi-ms圖譜如圖3所示，esi-msm/zforc14h14no⁺([m-i]⁺):calcd:212.1,found:212.2。

(3)化合物3的合成

將化合物2(652.4mg,1.92mmol)，2-吡啶甲酸(351.7mg,2.88mmol)，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(351.7mg,2.88mmol)和4-二甲氨基吡啶(140.7mg,1.15mmol)溶于無水二氯甲烷(20ml)中，在氬氣保護下室溫反應(yīng)2小時，反應(yīng)完全后，有固體析出，過濾并用無水二氯甲烷洗滌，收集固體，產(chǎn)率為47％。

化合物3的¹hnmr圖譜如圖4所示，¹hnmr(400mhz,d6-dmso,ppm)δ8.98(d,j＝6.4hz,2h),8.84-8.83(m,1h),8.29-8.25(m,3h),8.14-8.09(m,2h),7.90(d,j＝8.4hz,2h),7.78-7.75(m,1h),7.61(d,j＝16.4hz,1h),7.46(d,j＝8.8hz,2h),4.31(s,3h)。

化合物3的¹³cnmr圖譜如圖5所示，¹³cnmr(100mhz,d6-dmso,ppm)δ163.30,152.37,152.01,150.11,146.57,145.22,139.55,137.87,133.26,129.48,128.16,125.86,123.62,122.64,46.90。

化合物3的esi-ms圖譜如圖6所示，esi-msm/zforc20h17n2o2⁺([m-i]⁺):calcd:317.1,found:317.2。

(二)ph值變化對化合物2和化合物3熒光強度的影響

取實施例(一)中合成的化合物2和化合物3溶于二甲基亞砜中，分別制成2mmol/l的儲備液。當(dāng)ph值不同時，在室溫下以342nm為激發(fā)光測量化合物2和化合物3的熒光性質(zhì)，結(jié)果如圖7和圖8所示。圖7(a)為ph值對化合物2在503nm處的熒光發(fā)射強度和化合物3在448nm處的熒光發(fā)射強度的影響，(b)為ph值對化合物2和化合物3的熒光強度比率(f503nm/f448nm)的影響；圖8為ph值對化合物3與cu²⁺反應(yīng)前后的熒光強度比率(f503nm/f448nm)的影響。實驗結(jié)果表明，在ph＝4.0-7.4時，化合物2和化合物3的熒光強度及比率幾乎不受影響；當(dāng)ph＝7.0時，化合物3與cu²⁺反應(yīng)的熒光強度比率(f503nm/f448nm)變化最大而且速度最快。

(三)化合物3的吸收光譜和熒光光譜研究

在最佳測試條件下，即20mmhepes,ph7.0,25℃，研究化合物3的吸收光譜和熒光光譜性質(zhì)，結(jié)果如圖9和圖10所示。圖9中(a)為化合物3與cu²⁺反應(yīng)的吸收光譜變化，(b)為化合物3與cu²⁺反應(yīng)時吸光度在342nm和374nm處隨時間的變化；圖10中(a)為化合物3與cu²⁺反應(yīng)的熒光光譜變化，(b)為化合物3與cu²⁺反應(yīng)的熒光強度比率(f503nm/f448nm)隨時間的變化。實驗結(jié)果證明，化合物3與cu²⁺反應(yīng)會引起吡啶甲酸酯基的水解，釋放熒光團4-(4-羥基苯乙烯基)-1-甲基吡啶碘鹽，如圖13所示。因此，化合物3適用于cu²⁺的快速檢測。

(四)化合物3檢測cu²⁺的敏感度研究

為測試化合物3檢測cu²⁺的敏感度，不同cu²⁺濃度(0–14μm)條件下化合物3與cu²⁺反應(yīng)的熒光強度比率(f503nm/f448nm)隨時間的變化(如圖11(a))及化合物3的熒光強度比率(f503nm/f448nm)隨cu²⁺濃度的變化(如圖11(b))都進行了研究。從圖11(a)可知，cu²⁺濃度越高會使熒光強度比率(f503nm/f448nm)變化更快和更大。由圖11(b)可以推算出化合物3檢測cu²⁺的檢測限為1.1nm，遠低于美國環(huán)保署(epa)規(guī)定安全飲用水中最大cu²⁺濃度(20μm)。

(五)化合物3對cu²⁺的選擇性研究

為測試化合物3對cu²⁺的選擇性，對化合物3與不同重金屬離子反應(yīng)前后的熒光強度比率(f503nm/f448nm)的變化進行了實驗研究(如圖12)。由圖12可知，化合物3對cu²⁺檢測不受其他具有潛在競爭性的金屬離子的干擾，對cu²⁺檢測具有高度的選擇性。