本發(fā)明提供了一種水貂自咬行為診斷基因，進一步本發(fā)明還涉及利用該診斷基因設計自咬行為個體特異性的環(huán)介導恒溫核酸擴增引物，可用于快速診斷水貂群體中的自咬行為個體的檢測方法，屬于鼬科動物疾病檢測技術領域。

背景技術：

自咬行為（self-bitingbehavior，sb）是一種發(fā)生機理未明的異常行為。行為學家將其定義為有意、直接傷害自體組織的行為模式，多見于籠養(yǎng)條件下飼養(yǎng)的動物和患有精神性疾病或智力障礙、癡呆的病人。毛皮動物的自咬癥是指水貂和狐貍等肉食性毛皮動物的一種以反復咬傷身體后軀和尾部為主要癥狀的慢性疾病，是毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)中最為嚴重的疾病之一。目前，世界上主要的毛皮動物飼養(yǎng)大國均有該病發(fā)生，發(fā)病率約為5~20%。丹麥報道的發(fā)病率為20%。全世界每年僅水貂皮的生產(chǎn)量約為3000~3500萬張，由于自咬癥導致的等級下降的皮張在200~300萬張，每年給世界毛皮動物飼養(yǎng)業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。我國1967~1970年已有水貂自咬癥發(fā)病的報道。國內(nèi)每年水貂自咬癥的發(fā)病率約為5~10%。因此對水貂自咬行為的動態(tài)監(jiān)測、診斷并及時治療對預防和徹底根除該行為具有重大的意義。目前，對于水貂自咬行為的檢測方法多為pcr擴增、rapd和scar檢測方法。但以上方法存在重復性和穩(wěn)定性差，以及操作復雜不利于現(xiàn)場推廣等問題。因此，選擇高特異性的抗原，建立具有高敏感性、高特異性的水貂自咬行為診斷方法十分必要。

技術實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明公開了一種水貂自咬行為診斷基因，采用尾分析法對健康水貂和自咬行為水貂基因組dna池進行rapd擴增篩選隨機引物，獲得健康水貂和自咬行為水貂基因池中差異標記基因?；厥?、克隆隨機引物a10的rapd特異標記片段，經(jīng)測序后獲得該片段的全序列。所測的sa10-1000基因序列的長度為959bp，將所測序列通過genbank中的blast序列比較分析，從比較結(jié)果得知，所測的sa10-959擴增序列與犬屬布氏桿菌的同源性達73%。

本發(fā)明所述的一種水貂自咬行為診斷基因，如sqyno:1所示。

本發(fā)明所述一種水貂自咬行為診斷基因的制備方法，包括以下步驟：

用基因組dna提取試劑盒從采取健康水貂和自咬癥水貂肌肉樣本中提取基因組dna，分別組成基因池用于rapd擴增；

隨機引物序列如下：

a10引物序列gtgatcgcag；

將隨機引物a10對健康和自咬水貂基因組dna進行擴增，發(fā)現(xiàn)該引物在自咬水貂基因組中擴增到1條特異性條帶；回收、克隆隨機引物的rapd特異標記片段，經(jīng)測序后獲得該片段的全序列；

所測基因序列的長度為959bp（圖1），并命名為sa10-959，將所測序列通過genbank中的blast序列比較分析，從比較結(jié)果得知，所測的基因序列與犬屬布氏桿菌的同源性達73%；sa10-959特異標記片段的全序列如sqyno:1所示。

本發(fā)明水貂自咬行為診斷基因診斷水貂群體中的自咬行為個體的檢測方法，包括以下步驟：

采用水貂自咬行為診斷基因序列做為候選靶基因序列，設計了一套特異性的lmap引物。lmap的引物設計是采用官方軟件primerexplorerv3.0；首先通過瀏覽器登錄lamp官方網(wǎng)站http://primerexplorer.jp，進入primerexplorerv3.0軟件使用界面，導入文本格式的靶序列；

lmap的引物序列如下：

f3引物序列cgggtgatttccggtttga

b3引物序列　acgcagccatgatcttcttg

fip引物序列tccagcgtcaccgtcacgcgtccgaagagccgtgagg

bip引物序列aaggcagtcggcatgggcggcgggatcaaccgcaat

lf引物序列gttgggaagaccgataagagc

lb引物序列ggggatcgcggctgtttct。

所述的lamp反應體系為：2.5μl10×buffer、1.2mmdntp、f3和b3引物0.2μm、fip和bip引物1.6μm、lf和lb引物0.8μm、1.0m甜菜堿、8mmmg²⁺、1μlbstdna聚合酶、2μl模板；62.1°c反應1小時，80°c加熱2分鐘；分別以健康水貂和自咬水貂dna為模板，同時進行l(wèi)amp擴增，發(fā)現(xiàn)只有自咬水貂個體能擴增出lamp反應特有的梯形條帶。

本發(fā)明所述的診斷基因可以制備水貂群體中的自咬行為個體試劑盒。

本發(fā)明的積極效果在于：

提供了一種水貂自咬行為診斷基因，通過genbank中的blast序列比較分析，從比較結(jié)果得知，所測的sa10-959擴增序列與犬屬布氏桿菌的同源性達73%。具有特異性強、靈敏度高、快速準確且自動化程度高等特點，使其適合于臨床的快速診斷和牧區(qū)、村鎮(zhèn)等流行病學調(diào)查大規(guī)模應用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明a10隨機引物對健康和自咬水貂dna的擴增結(jié)果1~5為健康水貂6~10為自咬水貂；

圖2為本發(fā)明lamp反應對水貂自咬癥的的特異性檢測電泳圖：m,dl2000；泳道1,2是自咬水貂dna；泳道3，4為健康水貂dna；n，陰性對照。

具體實施方式：

下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領域技術人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本發(fā)明的待批權利要求范圍內(nèi)。

實施例1:

本發(fā)明一種水貂自咬行為診斷基因的制備方法，包括以下步驟：

用基因組dna提取試劑盒從采取健康水貂和自咬癥水貂肌肉樣本中提取基因組dna，分別組成基因池用于rapd擴增；

隨機引物序列如下：

a10引物序列gtgatcgcag；

將隨機引物a10對健康和自咬水貂基因組dna進行擴增，發(fā)現(xiàn)該引物在自咬水貂基因組中擴增到1條特異性條帶；

回收、克隆隨機引物的rapd特異標記片段，經(jīng)測序后獲得該片段的全序列；

所測基因序列的長度為959bp（圖1），并命名為sa10-959，將所測序列通過genbank中的blast序列比較分析，從比較結(jié)果得知，所測的基因序列與犬屬布氏桿菌的同源性達73%；sa10-959特異標記片段的全序列如sqyno:1所示。

實施例2：

本發(fā)明水貂自咬行為診斷基因診斷水貂群體中的自咬行為個體的檢測方法，包括以下步驟：

采用水貂自咬行為診斷基因序列做為候選靶基因序列，設計了一套特異性的lmap引物。lmap的引物設計是采用官方軟件primerexplorerv3.0；首先通過瀏覽器登錄lamp官方網(wǎng)站http://primerexplorer.jp，進入primerexplorerv3.0軟件使用界面，導入文本格式的靶序列；

lmap的引物序列如下：

f3引物序列cgggtgatttccggtttga

b3引物序列　acgcagccatgatcttcttg

fip引物序列tccagcgtcaccgtcacgcgtccgaagagccgtgagg

bip引物序列aaggcagtcggcatgggcggcgggatcaaccgcaat

lf引物序列gttgggaagaccgataagagc

lb引物序列ggggatcgcggctgtttct。

lamp反應體系為：2.5μl10×buffer、1.2mmdntp、f3和b3引物0.2μm、fip和bip引物1.6μm、lf和lb引物0.8μm、1.0m甜菜堿、8mmmg²⁺、1μlbstdna聚合酶、2μl模板；62.1°c反應1小時，80°c加熱2分鐘；分別以健康水貂和自咬水貂dna為模板，同時進行l(wèi)amp擴增，發(fā)現(xiàn)只有自咬水貂個體能擴增出lamp反應特有的梯形條帶（圖2）。

為了驗證lmap標記的特異性和適用性。選水貂養(yǎng)殖廠取皮期的自咬水貂和健康水貂各30只，分別提取dna，并分別采用rapd和lmap標記擴增并進行驗證。卡方檢驗結(jié)果如表1所示，特異lmap標記在健康和自咬水貂群體之間的比例差異極顯著（p<0.001）。與rapd標記相比較，lmap標記方法更準確的區(qū)分健康與自咬水貂個體，并且更加穩(wěn)定、可靠。lamp反應可合成10⁹數(shù)量級的dna，同時產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，它們能與鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，可根據(jù)反應體系中是否形成白色沉淀來快速定性判斷l(xiāng)amp反應。因此，在實際生產(chǎn)中，可以用此簡化方法對水貂群體進行大規(guī)模鑒定，既快速簡便，又大大降低成本。

表1健康水貂和自咬水貂中rapd和lmap標記分布情況

<110>中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所

<120>

<140>

<160>

<210>

<211>959

<212>dna

<213>水貂（neovisonvison）

<400>

1cactagcgtcgccctgctaagtcgatcttgacgccgcgttggtcgaaccc

51tctcttactactcgccgcaagtcgggctaatgtgcgaagtgtcccttcgt

101ggtaggcaactgctaataacggccaacgcccactaaaggccaaactcagg

151cttctcggcactccgccgagaatagccagaagggttgtgccagacgccgc

201actgccactgcgacctgccgttccgtcagccgtacccggcgtagcagccc

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851ggcggctacagccactcgctacggtgtagtcgggggcacgtctaagccga

901cacgtcgtctacgagacgcgcgtcgaaggtcttgcgctacgaaaacagag

951acgctagtg

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(19)

<223>

<400>2

cgggtgatttccggtttga19

<210>3

<211>10

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(10)

<223>

<400>3

acgcagccatgatcttcttg20

<210>4

<211>37

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(37)

<223>

<400>4

tccagcgtcaccgtcacgcgtccgaagagccgtgagg37

<210>5

<211>36

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(36)

<223>

<400>5

aaggcagtcggcatgggcggcgggatcaaccgcaat36

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(21)

<223>

<400>6

gttgggaagaccgataagagc21

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(19)

<223>

<400>7

ggggatcgcggctgtttct19