本發(fā)明涉及一種酶的純化方法，尤其是一種mtgase粗酶的純化方法。

背景技術(shù)：

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（transglutaminase，簡(jiǎn)稱tgase)是一種催化酰胺轉(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)與分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)與氨基酸之間的連接、蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解反應(yīng)，從而直接改變蛋白質(zhì)本身以及蛋白質(zhì)所附著的細(xì)胞、組織等的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的特性，提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值，生產(chǎn)出滿足人們需求的新型蛋白食品。微生物來源的tgase（mtgase）酶活性完全不依賴于鈣離子的存在，分子量小，更容易常溫保存，而功能上與動(dòng)物來源的tgase相似，這些性質(zhì)使得微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用的前景十分巨大。目前《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》僅允許茂原鏈輪絲菌來源的mtgase作為食品酶制劑使用，mtgase作為蛋白質(zhì)功能改善劑廣泛運(yùn)用在水產(chǎn)品、肉制品、乳制品、豆制品以及烘焙產(chǎn)品中，可改善蛋白質(zhì)的凝膠特性、乳化能力、持水力、起泡性以及穩(wěn)定性。

目前mtgase純化方法一般采用離子交換層析或凝膠柱層析的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員利用雙水相萃取技術(shù)進(jìn)行酶的純化時(shí)，一般選擇peg4000、peg2000、peg1000等分子量較小的peg，萃取時(shí)，待純化的酶都會(huì)分配在peg富集的上相，為了使得peg與待純化的酶分開，需進(jìn)行反萃取，將待純化的酶再萃取進(jìn)鹽相（下相），這樣使得生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高，存在工藝繁瑣、樣品回收率低、分離材料和設(shè)備昂貴、樣品處理量小、單一方法分離純度低等問題，難以滿足生產(chǎn)和應(yīng)用中的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種mtgase粗酶的純化方法，其純化簡(jiǎn)便，純化分離獲得的mtgase純度較高，回收率高。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase粗酶粉末用水溶解，配制成1-2wt%濃度的mtgase粗酶液；

配制peg/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg/(nh4)2so4雙水相溶液混合均勻，20-40℃靜置1-2h，mtgase進(jìn)入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相進(jìn)行納濾膜處理，收集納濾膜處理膜內(nèi)液獲得純化的mtgase。

優(yōu)選所述peg/(nh4)2so4雙水相溶液的組成為：

peg15-40wt%

(nh4)2so45-20wt％

水50-80wt％。

優(yōu)選所述peg/(nh4)2so4雙水相溶液的組成為：

peg25-30wt%

(nh4)2so47-13wt％

水60-68wt％。

優(yōu)選所述peg為peg-6000、peg-8000或peg-10000中的任一一種和硫酸銨配合使用，可以達(dá)到比較合適的分配系數(shù)，使得mtgase的純化效果較好。

優(yōu)選將所述mtgase粗酶液與peg/(nh4)2so4雙水相溶液混合均勻時(shí)，兩者的混合的質(zhì)量比例為1：2-1：5,利于mtgase分散在peg/(nh4)2so4雙水相溶液中，使得mtgase的純化效果較好。

優(yōu)選所述納濾膜所用的材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，納濾膜具有良好的截留效果，利于mtgase的提純和濃縮。

優(yōu)選將收集的鹽相進(jìn)行納濾膜處理過程中，溫度控制在20-40℃，進(jìn)壓2～6bar，出壓1～5bar，利于提高mtgase的提純和濃縮的速度和效率。

本發(fā)明配制合適比例的peg和(nh4)2so4在水中能形成兩層互不相溶的均相水溶液，運(yùn)用mtgase和雜質(zhì)在雙水相中的分配系數(shù)不同的性質(zhì)，使得mtgase和雜質(zhì)分配在不同的相中。經(jīng)過發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所用的peg的分子量大于等于6000，小于等于10000時(shí)，親水性的mtgase酶不再向富含peg相（上相）中聚集，而轉(zhuǎn)向鹽相（下相），并且此時(shí)的mtgase酶在下相的分配系數(shù)也足夠滿足酶的純化，酶的純化效果可以達(dá)到電泳純，回收率達(dá)到81.45-92.23%，純化后的mtgase的酶活力達(dá)到5.24-10.87u/ml。再對(duì)鹽相利用納濾膜進(jìn)行過濾處理，在去除鹽相中的硫酸銨和小分子雜質(zhì)的同時(shí)，對(duì)mtgase溶液進(jìn)行濃縮，獲得較高純度的mtgase，利于mtgase的應(yīng)用。

與本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用雙水相萃取技術(shù)進(jìn)行酶的純化時(shí)，通過一次萃取就可實(shí)現(xiàn)酶純化，工藝更簡(jiǎn)單，酶純度高，酶活回收率和酶活力更高。省略反萃取步驟，也可實(shí)現(xiàn)酶的純化，極大的簡(jiǎn)化了利用現(xiàn)有雙水相萃取技術(shù)進(jìn)行酶純化的工藝。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中實(shí)施例1中純化的mtgase的sds-page電泳圖；

圖2是本發(fā)明中實(shí)施例2中純化的mtgase的sds-page電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

mtgase的酶活力測(cè)定方法：取50μl待測(cè)溶液于試管中，加入500μl底物溶液，并立即混勻，37±1℃條件下準(zhǔn)確反應(yīng)10min，加入500μl顯色溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)終止后，將反應(yīng)混合液3000rpm離心10min，取上清，以水作對(duì)照，于525nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值，為待測(cè)酶液吸收值。以l-谷氨酸-γ-單異羥肟酸為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力單位定義：該酶在37℃時(shí)每分鐘催化底物生成1μmol的l-谷氨酸-γ-單異羥肟酸所需要的酶量。

實(shí)施例1

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成2wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-600027wt%

(nh4)2so413wt％

水60wt％；

peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg-6000相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：5的質(zhì)量比混合均勻，30℃靜置1h，mtgase進(jìn)入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設(shè)備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在35℃，進(jìn)壓4bar，出壓3bar。收集納濾膜處理膜內(nèi)液即為純化的mtgase。純化的mtgase的sds-page電泳圖見圖1所示。從圖1中可以看出，mtgase粗酶液的蛋白條帶較多，說明mtgase粗酶中含有大量雜蛋白，其中最粗的條帶為mtgase。純化的mtgase為單一條帶，對(duì)應(yīng)分子量約為37kda，與茂原鏈霉菌發(fā)酵的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的分子量一致。說明經(jīng)過本實(shí)施例的處理，能夠去除mtgase粗酶中的大量雜蛋白，得到純化的mtgase。mtgase的回收率為90.74%，納濾膜處理膜內(nèi)液中mtgase的酶活力為5.24u/ml。

實(shí)施例2

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成2wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-8000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-1000030wt%

(nh4)2so412wt％

水58wt％；

peg-8000/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg-8000相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg-8000/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：5的質(zhì)量比混合均勻，20℃靜置1h，mtgase進(jìn)入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設(shè)備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在30℃，進(jìn)壓3bar，出壓2bar。收集納濾膜處理膜內(nèi)液即為純化的mtgase。純化的mtgase的sds-page電泳圖見圖2所示。從圖2中可以看出，mtgase粗酶液的蛋白條帶較多，說明mtgase粗酶中含有大量雜蛋白，其中最粗的條帶為mtgase。純化的mtgase為單一條帶，對(duì)應(yīng)分子量約為37kda，與茂原鏈霉菌發(fā)酵的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的分子量一致。說明經(jīng)過本實(shí)施例的處理，能夠去除mtgase粗酶中的大量雜蛋白，得到純化的mtgase。mtgase的回收率為83.99%，納濾膜處理膜內(nèi)液中mtgase的酶活力為10.87u/ml。

實(shí)施例3

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成1.8wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-10000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-1000025wt%

(nh4)2so420wt％

水55wt％；

peg-10000/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg-10000相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：3的質(zhì)量比混合均勻，40℃靜置1h，mtgase進(jìn)入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設(shè)備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在25℃，進(jìn)壓4bar，出壓3bar。收集納濾膜處理膜內(nèi)液即為純化的mtgase。mtgase的回收率為84.36%，納濾膜處理膜內(nèi)液中mtgase的酶活力為7.56u/ml。

實(shí)施例4

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成1.5wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-600040wt%

(nh4)2so410wt％

水50wt％；

peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg-6000相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg-6000/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：4的質(zhì)量比混合均勻，30℃靜置1h，mtgase進(jìn)入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設(shè)備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在30℃，進(jìn)壓5bar，出壓4bar。收集納濾膜處理膜內(nèi)液即為純化的mtgase。mtgase的回收率為89.12%，納濾膜處理膜內(nèi)液中mtgase的酶活力為6.76u/ml。

實(shí)施例5

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成1.2wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-8000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-800020wt%

(nh4)2so47wt％

水73wt％；

將mtgase粗酶液與peg-8000/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：3的質(zhì)量比混合均勻，40℃靜置1h，mtgase進(jìn)入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設(shè)備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在40℃，進(jìn)壓6bar，出壓5bar。收集納濾膜處理膜內(nèi)液即為純化的mtgase。mtgase的回收率為92.23%，納濾膜處理膜內(nèi)液中mtgase的酶活力為8.37u/ml。

實(shí)施例6

mtgase粗酶的純化方法，包括以下步驟：

將mtgase的粗酶粉末用水溶解，配制成1wt%的mtgase粗酶液；

配制peg-10000/(nh4)2so4雙水相溶液，組成為：

peg-1000015wt%

(nh4)2so45wt％

水80wt％；

peg-10000/(nh4)2so4雙水相溶液形成上層的peg-10000相和下層的鹽相；

將mtgase粗酶液與peg-10000/(nh4)2so4雙水相溶液按照1：2的質(zhì)量比混合均勻，20℃靜置1h，mtgase進(jìn)入雙水相體系中的鹽相，收集雙水相體系中的鹽相；

將收集的鹽相泵入納濾膜設(shè)備中處理，所用納濾膜材料為聚丙烯腈，截留分子量為1kda，溫度控制在20℃，進(jìn)壓2bar，出壓1bar。收集納濾膜處理膜內(nèi)液即為純化的mtgase。mtgase的回收率為81.45%，納濾膜處理膜內(nèi)液中mtgase的酶活力為5.88u/ml。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。